Summary
Cuantificar la muerte celular epidérmica en ranas con quitridiomicosis usando dos métodos. En primer lugar, utilizamos terminal transferasa-mediated dUTP nick etiquetado final (TUNEL) en situ histología para determinar las diferencias entre animales clínicamente infectados y no infectados. En segundo lugar, llevamos a cabo un análisis de series temporales de la apoptosis sobre la infección usando un análisis de la proteína caspasa 3/7.
Abstract
Anfibios están experimentando una gran pérdida de biodiversidad a nivel mundial y una de las principales causas es la quitridiomicosis enfermedad infecciosa. Esta enfermedad es causada por el hongo patógeno Batrachochytrium dendrobatidis (Bd), que infecta y afecta epidermis de rana; sin embargo, los cambios patológicos se han no explícitamente caracterizados. Apoptosis (muerte celular programada) puede utilizarse por los patógenos para dañar tejido anfitrión, pero también puede ser un mecanismo de host de resistencia a las enfermedades para la eliminación del patógeno. En este estudio, cuantificar la muerte de las células epidérmicas de los animales infectados y no infectados usando dos análisis diferentes: terminal transferasa-mediated dUTP nick end-etiquetado (TUNEL) y caspasas 3/7. Utilizando tejido de piel de muslo y ventral, dorsal, en el ensayo TUNEL, observamos muerte en las células epidérmicas en situ de los animales clínicamente infectados de la célula y comparar la muerte de la célula con los animales no infectados mediante microscopía fluorescente. Para determinar cómo cambian los niveles de apoptosis en la epidermis en el transcurso de la infección extraer muestras de la punta del dedo del pie quincenal durante un período de 8 semanas y utilizar un ensayo de caspasas 3/7 con proteínas extraídas para cuantificar la actividad dentro de las muestras. Entonces correlacionamos actividad de caspasas 3/7 con la carga de la infección. El ensayo TUNEL es útil para la localización de la muerte de la célula en situ, pero es costoso y el tiempo por muestra. El ensayo de caspasas 3/7 es eficaz para tamaños de muestra grandes y tiempo curso de experimentos. Sin embargo, porque las de biopsias punta del dedo del pie de rana son pequeñas hay extracto limitado disponible para estandarización de la muestra a través de métodos de cuantificación de la proteína, tales como el ensayo de Bradford. Por lo tanto, sugerimos estimar el área superficial de la piel a través del análisis fotográfico de las biopsias del dedo del pie para evitar el consumo de los extractos durante la normalización de la muestra.
Introduction
Anfibios están experimentando actualmente una las mayores pérdidas de la biodiversidad global de cualquier taxa vertebrados1. Una de las principales causas de estos descensos son la piel fatal enfermedad chytridiomycosis, causada por el hongo patógeno Batrachochytrium dendrobatidis, Bd2. El patógeno infecta superficialmente la epidermis, que puede conducir a la alteración de la función de la piel resultando en pérdida del electrólito grave, paro cardiaco y muerte3. Varios mecanismos inmunes del huésped potencial contra Bd actualmente se están estudiando, tales como péptidos antimicrobianos4,5, de la flora bacteriana cutánea6, inmune de la célula receptores7,8, y actividad de linfocitos9,10. Sin embargo, pocos estudios explorarán si epidérmica apoptosis y muerte celular es un mecanismo inmune contra este patógeno mortal.
Muerte celular, ya sea a través de la apoptosis (muerte celular programada) o necrosis (muerte), en la epidermis puede ser una patología de la infección de la Bd . La investigación anterior sugiere que Bd infección puede inducir apoptosis debido a la interrupción de uniones intracelulares se observa cuando los explantes de piel están expuestos a zoospora sobrenadantes en vitro11. Además, cambios degenerativos epidérmicos en Bd-ranas infectadas se observan con microscopia electrónica12,13. Análisis transcriptómico indican que las vías de apoptosis son upregulated en piel infectada14y esplenocitos de anfibios sufren apoptosis cuando son expuestos a Bd sobrenadantes en vitro15. A pesar del creciente volumen de evidencia que sugiere que el Bd puede inducir apoptosis y anfitrión célula muerte en vitro, estudios en vivo que explorar o cuantificar apoptosis carecen de mecanismos a través de la progresión de la infección. Además, se desconoce si el host utiliza apoptosis como una estrategia defensiva inmune para luchar contra la infección de la Bd , o si la apoptosis es una patología de la enfermedad.
En este estudio, el objetivo fue detectar muerte celular epidérmica y apoptosis en animales infectados en vivo usando dos métodos: Análisis de la proteína caspasa 3/7 y terminal transferasa-mediated dUTP nick etiquetado final (TUNEL) en situ ensayo. Como cada ensayo detecta diferentes aspectos de la muerte de la célula16, juntos estos métodos proporcionan un completo entendimiento de los mecanismos implicados en la muerte celular y aseguran una medida exacta del efecto. El ensayo de caspasas 3/7 cuantifica la actividad de las caspasas efectoras 3 y 7, que permite la cuantificación de ambos las vías intrínseca y extrínseca de la apoptosis. En contraste, el ensayo TUNEL detecta la fragmentación del ADN, que es causada por mecanismos de muerte celular incluyendo apoptosis, necrosis y pyroptosis17. Utilizamos el ensayo TUNEL para investigar la situación de muerte celular en la epidermis de los animales clínicamente infectados y no infectados con tres secciones de piel diferentes: el dorso, el vientre y el muslo de Pseudophryne corroboree. Este método identifica el sitio anatómico de la muerte de la célula, como distinguiendo su ubicación dentro de capas epidérmicas específicas. Entonces utilizamos el análisis de caspasas 3/7 para llevar a cabo una cuantificación de la serie de tiempo de la apoptosis a través de una infección de 8 semanas en Litoria verreauxii alpina. Tomar muestras de punta de dedo del pie quincenal de los mismos animales y son capaces de correlacionar la carga de infección del patógeno con la actividad de caspasas 3/7.
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Protocol
Universidad James Cook aprobó ética animal en aplicaciones A1875 para p. corroboree y A1897 y A2171 L. v. alpina.
1. cría de animales y control de
- Animales de la casa individualmente, en un ambiente apropiado para la especie, con un agua apropiada, alimentación y limpieza horario. Revise diariamente los animales.
- Individuos adultos de la críticamente amenazada Pseudophryne corroboree (para el ensayo TUNEL, sección 4) y el amenazado Litoria verreauxii alpina (para el análisis caspasas 3/7, sección 5), donados por cautivo instalaciones de cría. Mantener los animales en 15-18 ° C, sobre un musgo y grava sustrato niebla ellos diariamente con agua de ósmosis inversa y alimentar 3 veces semanalmente con grillos gut cargado.
- Recoger los datos cada vez individual semanal. Esponja a los individuos para Bd , como se describe en el paso 2.1. Pesar cada animal a lo 0.1 g estaba usando una escala y medir su hocico para salida longitud de (SVL) a la más cercana 0,01 mm con pinzas de disco.
- Después de la inoculación (como se describe en la sección 3), ver animales diariamente para signos clínicos de infección (slough de piel irregulares, inapetencia, enrojecimiento de la pierna, letargia o retrasada righting reflex) conforme a las directrices de la ética animal. Eutanasia de animales si la morbilidad y los signos clínicos están presentes.
- Eutanasia con sobredosis de tricaine methanesulfonate (MS222) (0.1% w/v MS222 a pH 6-7 con bicarbonato de sodio de agua del grifo). Mantener animales MS222 para 10 minutos después de todo movimiento cesa y no mostrar respuesta a estímulos.
2. pruebas para la infección de la Bd
- Vajillas para Bd
- Limpiar cada animal con un nuevo hisopo estéril de rayón (una esponja por animal). Utilice el siguiente método desmoldante: cinco veces en el vientre, cinco veces en cada muslo, lateral y extremidades. Se trata de un total de 45 movimientos.
- Gire suavemente la torunda durante y entre pasadas para asegurar la efectiva captura de ADN. Romper la punta del hisopo en tubos de microcentrífuga de 1,5 mL y almacenar a-20 ° C hasta la extracción.
- Extracción de ADN y análisis de qPCR
- Extraiga el ADN genómico de los hisopos por añadiendo 50 μl de un reactivo de extracción de ADN disponible en el mercado con 30-40 mg de perlas de sílice de 0,5 mm. Grano de golpe las muestras en un disruptor de células grano batidor a velocidad máxima durante 2 minutos. Tras el paso del grano de batidor, centrifugar las muestras a 2.000 x g durante 1 minuto.
- Incubar las muestras a 100 ° C durante 10 minutos y deje que se enfríe. Centrifugar las muestras a 5.000 x g durante 3 min y luego transferir el sobrenadante a tubos de centrífuga micro individual 1.5 mL y almacenar a-20 ° C hasta qPCR.
- Uso de PCR cuantitativa (qPCR) después de Boyle et al. 200418 para analizar la carga de la infección. Utilice las siguientes modificaciones:
- Diluir el DNA 6:100 de muestras de extracción con agua desionizada. Añadir 0,7 μl de albúmina de suero bovino (BSA) en cada pocillo para evitar la inhibición de la polimerización en cadena. Ejecute cada muestra en singlicate. En cada placa de utilizar un control negativo (sin plantilla) y un control positivo con una serie de normas de dilución para estimar la carga de la zoospora (infección).
3. inoculación
- Cultura Bd
- Para preparar cultivo caldo añadir 16 g de triptona, 2 g de hidrolizado de gelatina y 4 g de lactosa (TGHL) a 1 L de agua desionizada. Autoclave (121 ° C durante 40 min) y permita que el caldo se enfríe.
- Inocular la cepa de Bd (en este caso, aislado de Nueva Gales del sur aislado, AbercrombieR-L.booroologensis-2009-LB1, pasaje número 11) en un caldo TGHL y crecer por 7 d a 23 ° C, y luego transferir el caldo de cultivo en placas de agar TGHL.
- Para hacer las placas, añadir 16 g de triptona, 2 g de hidrolizado de gelatina, 4 g de lactosa (TGHL) y 10 g de agar bacteriológico a 1 L de agua desionizada y autoclave (121 ° C durante 40 minutos). Una vez que la mezcla esté lo suficientemente fría como para tocar, pero antes de que se solidifica, vierta el agar TGHL 92 mm diámetro placas de cultura por lo que son 1/4 a 1/3 completo, en el gabinete de seguridad biológico una clase II.
- Cuando se haya solidificado el agar y haya enfriado por completo, inocule cada placa con 0,5 mL de Bd del caldo líquido y espárcelo de forma pareja. Permitir que la mezcla de caldo de Bd secar en placa por aproximadamente 1 h y luego sellar las placas con película de plástico de la parafina. Incubar con el agar hacia las placas abajo a 23 ° C durante 5-7 días.
- Placas de inundación para la solución de inoculación de zoospora
- Compruebe la movilidad de la zoospora bajo un microscopio de luz invertido para asegurar viabilidad diariamente antes de la inoculación. Cuando liberación de zoospora es alta, con muchas zoosporas nadar fuera de los esporangios, la cultura está lista para la inoculación.
- Inundación cada plato con 3 mL de agua del grifo o agua de los estanques artificiales, verter el agua en la placa y la incubación a temperatura ambiente durante 10 minutos permitir que las zoosporas a liberar en el agua. Después de la incubación, decantar la suspensión de la zoospora en un recipiente estéril nuevo.
- Estimar la concentración de la zoospora siguiendo las instrucciones del fabricante utilizando un hemocitómetro. Una vez se conoce la concentración de la suspensión de la zoospora, diluir la suspensión a una concentración de 1 x 106 zoosporas por 3 mL de agua.
- Inocular a animales
- Inocular cada animal por verter 3 mL de mezcla de inóculo sobre su vientre19 en envases individuales de 50 mL. Permite exceso inóculo recoger en la base del envase de inoculación. Dejar cada animal en envase individual de inoculación durante 24 h para la infección y después de la inoculación de 24 h, volver a cada uno a un terrario desinfectado.
- Desinfectar el terrario con un 13% volumen/volumen (v/v) blanqueador comercial solución20, enjuagar al menos dos veces con agua, luego dejar para secar por no menos de 24 h.
- Para Bd-negativa controles, simulado inocular a los animales con los mismos métodos que en 3.2-3.3, pero inundaciones Bd-placas de agar libre con 5 mL de agua del grifo en lugar de Bd inocularon las placas de agar.
- Inocular cada animal por verter 3 mL de mezcla de inóculo sobre su vientre19 en envases individuales de 50 mL. Permite exceso inóculo recoger en la base del envase de inoculación. Dejar cada animal en envase individual de inoculación durante 24 h para la infección y después de la inoculación de 24 h, volver a cada uno a un terrario desinfectado.
4. TUNEL ensayo
- Eutanasia de animales que muestran signos clínicos de la quitridiomicosis, tal como se describe en el paso 1.3.1 y un número igual de Bd-negativo animales de control.
- Disecar la piel (dorsal, ventral y muslo) muestras de cada animal. Fijar las muestras de piel para 2 h de formaldehído al 4% v/v tamponada fosfato. Corto y constante de tiempo de fijación permiten que los tejidos a ser completamente fijo, sino que también permite para la tinción de inmunohistoquímica efectiva y precisa. Luego se transfieren a etanol al 80% hasta incrustar para seccionamiento.
- Incrustar la piel en la cera de parafina para preparación histológica siguiendo métodos estándar21. Brevemente, el protocolo es el siguiente:
- Deshidratar los tejidos en una serie gradual de etanol y claro el etanol con xileno. Incrustar el tejido en parafina y colocar todas las muestras de piel de tres para cada individuo en bloque de uno parafina.
- Piel de sección usando un micrótomo después de la preparación histológica estándar21. Sección del tejido en serie a 5 μm y luego fijar en portaobjetos de vidrio hidrofílico. Coloque cuatro histosections serie por tipo de piel por diapositiva. Realizar tres diapositivas por persona con secciones de piel serie, recuerda que cada diapositiva tiene cuatro secciones de cada tejido fijada.
- La mancha las diapositivas en el siguiente orden:
- La primera diapositiva se tiñen con hematoxilina seguida de eosina contratinción (H & E). Esta diapositiva es visualizar la ubicación de los esporangios de la Bd dentro de la piel.
- La segunda diapositiva después de un ensayo TUNEL comercialmente disponible para la preparación histológica de la mancha y siga las instrucciones del fabricante, que se describen a continuación.
- En primer lugar, Desparafinizar las secciones de tejido en un frasco de coplin por lavado de los portaobjetos con tres cambios de xileno durante 5 minutos por lavado y seguir con dos cambios de etanol al 100% durante 5 minutos cada lavado. Siga con un lavado de etanol al 95% por 3 min y etanol 70% durante 3 minutos acabado con un lavado de PBS durante 5 minutos.
- Prepare el tejido con la proteína recién diluida digerir la enzima (proteinasa K a una concentración de 20 μg/mL diluido en PBS) y añadir directamente a la diapositiva. Dejar para incubar durante 15 minutos de lavado con dos cambios de PBS en una jarra de coplin durante 2 minutos.
- Tap off el exceso de líquido y saciar en peróxido de hidrógeno de 3.0% en PBS en una jarra de coplin para 2 min a temperatura ambiente. Enjuague dos veces con PBS durante 5 minutos cada lavado.
- Toque del exceso de líquido y luego aplicar 75 μl/5 cm2 de la solución de equilibrio directamente sobre el tejido sobre el portaobjetos. Incube durante 10 s. Elimine el exceso de líquido alrededor de la sección y aplicar 55 μl/5 cm2 de trabajo terminal deoxynucleotidyl (TdT) de tranferase enzima. Incubar en una cámara humidificada durante 1 h a 37 ° C.
- Después de la incubación de la TdT, colocar la corredera en una jarra de coplin trabajo fuerza parada/tampón de lavado, agite por 15 s e incubar 10 min a temperatura ambiente. Lavar el portaobjetos con tres cambios de PBS durante 1 minuto por lavado. Tap off el exceso de líquido.
- Aplica el conjugado anti-digoxigenina (rodamina) que ha sido calentado a la temperatura en el tejido, 65 μl/5 cm2. Incubar en una cámara humidificada durante 30 min a temperatura ambiente y evitar la exposición a la luz. Lavar con cuatro cambios de PBS durante 2 min por lavado. Tap off el exceso de líquido.
- Acabado por añadir 15 μl de 0.5 - 1 μg/mL DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole) en medio de montaje de la diapositiva a la diapositiva, que actúa como un contador. Luego cubrir con un cubreobjetos y sellar con esmalte de uñas o pegamento de caucho. Permite transparencias secar en la oscuridad como el ensayo es sensible a la luz.
- Mancha la tercera diapositiva se tiñe usando el TUNEL análisis y contratinción DAPI, pero utilizar como control positivo y negativo para cada muestra.
Nota: De los 4 histosections en el portaobjetos de control, los primeros 2 son repeticiones de control positivo y los 2 últimos son réplicas del control negativo.- Para los controles positivos, en lugar de paso 4.5.2.2, tratamiento previo del tejido con tampón de DN (30mM trizma base, pH 7.2, 4mM de MgCl2, 0,1 DDT) y dejar incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos. Luego disolver DNasa I en DN del almacenador intermediario para una concentración final de 0.1ug / mL y aplicar directamente a la diapositiva. Incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente. Luego, lavar el portaobjetos con 5 lavado de dH2O 3 minutos cada lavado. Secar el líquido sobrante. Entonces reanudar el ensayo TUNEL como se indica en la sección 4.5.2.3.
- Para los controles negativos, no agregue el terminal deoxynucleotidyl (TdT) de tranferase enzima a las muestras (como se describe en la sección 4.5.2.4).
- Observar diapositivas TUNEL inmediatamente después de terminar el ensayo.
- Tome fotos al azar intervalos a lo largo de cada sección de la piel en 200 X usando un microscopio de fluorescencia, utilizando filtros para ambos la mancha de la rodamina, que revela las células apoptóticas y aparece rojo y DAPI que revela todos los núcleos y aparece azul, para que un recubrimiento de las células se pueden generar. Asegurar por lo menos 100 células son fotografiadas por sección de la piel por ejemplo. Almacenar las diapositivas en una caja oscura microscopio a-20 ° C.
- Cuente las células (DAPI azul manchado) por imagen. Asegúrese de que se cuentan por lo menos 100 células por sección de la piel. Para llegar a 100 células, contar todas las celdas dentro de la imagen. Si menos 100 células están presentes en una imagen, cuenta otra imagen hasta alcanzaron por lo menos 100 células por sección de la piel por animal.
- Luego, cuente el número de células positivas TUNEL en las mismas imágenes (rojo rodamina tinción). Las células positivas TUNEL, que indican la apoptosis y la necrosis ni fondo, son las células con bordes de células claras (las membranas están intactas con no lisis). A veces las células se encogen a cuerpos apoptóticos de forma.
- Localizar las áreas en el ensayo TUNEL y analizar las regiones correspondientes en el H & E tinción de histosections. Confirmar que la H & E tinción de secciones corresponden a sitios de infección de la Bd , que asegura Bd-sitios infectados se utilizan cuando el recuento de células apoptóticas en el ensayo TUNEL.
5. caspasas 3/7 ensayo
- Recoger sugerencias del dedo del pie de cada animal ( Bd- expuesto y Bd- negativo) una vez semanal a través de inoculación de post de la semana 3 y quincenalmente hasta el final del experimento, hasta los dedos del 8 pie por persona.
- Cortar la punta del dedo del pie en la segunda falange con una tijera esterilizada a la llama y colocar en un microtubo de 1.5 mL y congelar inmediatamente a-80 ° C.
- Extracto de proteínas de la muestra congelada del dedo del pie.
- Coloque las muestras en 100 μl de sample buffer (25 mM HEPES de pH 7, 5 mM de MgCl2) con dos granos de acero inoxidable (3.2 mm) en un microtubo de 1.5 mL tapón de rosca. Lisar muestras por 4 ciclos de 1 min grano batiendo a velocidad máxima (en el mismo batidor de grano como paso en 1.2.1) seguida de 3 min sobre hielo. Después de lisis, centrifugar las muestras a 12.000 g y 4 ° C por 5 min recoger sobrenadante a utilizar en el ensayo.
- Cuantificar la concentración de proteína por muestra usando el ensayo de Bradford.
- En una placa bien 384, mezclar 10 μl de proteína extracto con 10 μl de reactivo de Bradford e incubar durante 2 min a temperatura ambiente. Realizar cada muestra por duplicado, junto con una serie de 5 doble estándares de dilución de BSA. Leer la absorbancia a 595 nm en un lector de absorbancia.
- Por otra parte, si las muestras de punta de los pies son demasiado pequeñas (la concentración de proteína es cerca el estándar más bajo determinado desde el ensayo de Bradford en paso 4.3.1, o si las ranas que son muestreadas son menores de 3 g de peso total), estandarizar las muestras por estimación de la superficie de la piel área con fotografías, en lugar del ensayo de Bradford.
- Antes de extraer las proteínas de la muestra para el ensayo de caspasa, fotografiar cada dedo con 40 aumentos con un microscopio de luz invertido.
- Analizar la muestra del dedo del pie, utilizando un equipo de proyección de imagen de software, por estimar el área del dedo del pie. Para ello, trazar una línea alrededor del borde del clip del dedo del pie y tener la proyección de imagen área de estimación de software dentro de la forma. Luego multiplica esa área por pi (3.14), que se aproximan a la superficie de la muestra de piel 3-dimentional (longitud x área de sección transversal (pi x diámetro) da la superficie exterior de un tubo).
- Realizar el ensayo de caspasas 3/7.
- En una placa de 384 luminiscencia bien, añadir 10 μl de reactivo comercialmente disponible caspasas 3/7 y 10 μl del extracto de la proteína. Ejecute cada muestra por triplicado.
- Mezcle los reactivos sacudiendo lentamente la placa para incubar s. 15 la placa lejos de la luz durante 30 min a temperatura ambiente. Luminescencia medida usando un lector de placas luminiscentes.
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Representative Results
Ensayo TUNEL
Había más células positivas TUNEL en los animales infectados que en los animales control no infectado. La ubicación en situ de TUNEL positiva las células difieren en infectados y controlar animales. En animales control, hubo una distribución uniforme del TUNEL positiva las células a lo largo de la dérmica y epidérmica de la piel capas en niveles bajos (ver figura 1A), pero en los animales infectados, las células positivas TUNEL fueron más frecuentes en la epidermis (figura 1B). los sitios de infección (como se observa en la H & E tinción de portaobjetos) se observaron como agrupado Bd esporangios dispersos a través de las secciones de piel ventral con ninguno en las secciones de dorso y muslos. Mientras que el túnel fueron más concentradas en las células positivas y directamente adyacente a los sitios de las células infectadas (figura 1), había también células positivas de TUNEL más generalizadas sobre la epidermis y capas epidérmicas que fueron más allá de donde Bd residido. En Bd infectan animales había más células positivas de TUNEL en todo tipo de piel tres analizado, pero un nivel particularmente alto en la piel del muslo y venter (12.01 veces mayor (IC del 95%: 4.92 26.30) en la piel de muslo y 22,31 veces mayor (IC del 95% 94.82 5.25) en el piel de Venter) (figura 2).
Ensayo de caspasas 3/7
En el transcurso de la infección hubo una diferencia en la actividad de la caspasa. En Bd infectadas animales, intensidad de infección se correlacionó positivamente con la actividad de caspasas 3/7 (figura 3). Había también una diferencia entre animales infectados y no infectados a través del tiempo, post inoculación. Actividad de caspasas 3/7 disminuyó en las primeras semanas después de la inoculación (con 48.36% menos actividad en los animales infectados) y luego aumentó hacia el final de la semana 7 (figura 4) en Bd animales infectados, pero se mantuvo constante en no infectados las personas físicas.
Figura 1: Terminal transferasa-mediated dUTP nick end-etiquetado (TUNEL) en situ ensayo de infectados y no infectados animales. Un) Bd- sección de piel de muslo control de corroboree de Pseudophryne y B) Bd+ muslo sección de corroboree p. manchado por ensayo de TUNEL en situ de la piel. El azul es el que indica núcleos de las células de tinción DAPI, y el rojo es el colorante rodamina, que indica fragmentación del ADN característico causado por apoptosis. La flecha amarilla indica la posición del cluster Bd en panel C. C) corroboree p. sección de piel de muslo teñidas con H & E. La sección de H & E es serial al panel B. Hay un grupo de vacío Bd esporangios (flecha) y unos esporangios inmaduras oscuros cerca de la superficie de la piel. Para todos los tres paneles la epidermis está en la parte superior de la foto. Comparación paneles B y C muestran que la rodamina tinción las células epidérmicas se concentran alrededor y debajo del cluster de Bd y daño de la piel donde es visible, como la formación de micro-vesícula entre las células epidérmicas basales. Aumento de 400 X y la barra de escala indica 0,03 mm. adaptado de la figura 2 en Brannelly et al. 2017 Peer J22. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: la proporción de positivos de TUNEL (TUNEL +) células por tipo de piel. La proporción de células apoptotic positivo de TUNEL por tipo de piel en p. corroboree, con animales infectados, indicando que los animales que sucumbieron a la enfermedad (n = 9) y los animales de control no infectados (n = 10). Barras de error indican intervalos de confianza del 95% de una proporción y * indica un aumento significativo en TUNEL + célula de proporciones. En la piel dorsal, los animales infectados tenían 14,38 (IC del 95%: 3.32 62.24) veces más células positivas TUNEL que los animales control (Odds Ratio: Z = 3.57, p < 0.01). En la piel del muslo, los animales infectados tenían 12.01 (IC del 95%: 4.92-26.30; Odds Ratio: Z = 5.46, p < 0.01) veces más células positivas TUNEL que los animales de control (Chi cuadrado de Pearson: χ21 = 44.30, p < 0.01). En la piel del vientre, animales infectados tenían 22.31 (IC del 95%: 5.25-94.82) veces más células positivas TUNEL que los animales control (Odds Ratio: Z = 4.21, p < 0.01). Adaptado de figura 3 , en Brannelly et al. 2017 Peer J22. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Correlación entre la intensidad de la infección, Log10(equivalentes de zoospora) y caspasas 3/7, Log10(caspasa) de inoculado Litoria verreauxii alpina en el transcurso del experimento. La correlación entre la intensidad de la infección y actividad de caspasa es 0.463 y la línea de tendencia tiene una ecuación de y = x (0.229) + 0.939. Adaptado de figura 4 en Brannelly et al. 2017 peer J22. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Actividad de caspasas 3/7 semana 7 para cada grupo de Litoria verreauxii alpina: Bd-animales que sucumbieron a la enfermedad infectados (n = 4) y no infectados los controles (n = 8). Actividad de la caspasa se define como la luminiscencia de lectura controlada para por la concentración de proteína por muestra y entonces log base 10 transformado. La actividad de caspasa (Log10 transformado) para cada grupo por semana. Barras de error indican el error estándar. * indica que los animales infectados diferían de los controles no infectados en esa semana. (Modelo lineal de efectos mixtos: semana, F4 = 11.974, p < 0.01; semana * estado, F8 = 2.139, p = 0,037; Semana 3 ANOVA, F2,18 = 5.512, p = 0,014), adaptado de la figura 5 en Brannelly et al. 2017 Peer J22. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Exploramos epidérmico apoptosis y muerte celular como un mecanismo potencial de la patología de la quitridiomicosis enfermedad mortal o un mecanismo de resistencia a enfermedades en especies susceptibles de Bd . Se utilizaron dos métodos de evaluar la muerte celular en la epidermis, ensayo TUNEL en situ análisis de muerte celular epidérmica y caspasas 3/7 análisis para monitoreo de muerte de las células epidérmicas a lo largo de la evolución de la infección. Se encontró que la muerte celular y la apoptosis se correlacionan con la carga de infección y muerte celular es significativamente mayor en el sitio de la infección. En la infección temprana, hay una disminución en la apoptosis en la epidermis y aumenta la apoptosis como patógeno carga aumenta en el tejido infectado.
Apoptosis en las células puede ser probado usando numerosos enfoques diferentes, cada uno con ventajas y limitaciones. Es importante estudiar la apoptosis y muerte celular utilizando múltiples ensayos para confirmar los resultados. En este estudio, exploramos dos diferentes ensayos para investigar la muerte de las células epidérmicas y apoptosis en ranas con la quitridiomicosis. Primero, hemos probado el TUNEL de ensayo para determinar la célula muerte in situ. Esta prueba es lento y caro por muestra, y diapositivas se deben leer inmediatamente como la señal fluorescente se desvanece rápidamente. A pesar de estas limitaciones, los resultados de este experimento en situ son importantes para la posterior comprensión de los mecanismos de las interacciones huésped-patógeno. Información sobre localización se puede determinar con este método, y en nuestro estudio apoptosis estaba presente en altos niveles en el sitio de la infección micótica y más difusamente en otros sitios. Además debe ser observado que el ensayo TUNEL mide daño en el ADN, que puede ser causada por una serie de mecanismos de muerte de diferentes células incluyendo la apoptosis, necrosis y pyroptosis17. Mientras que hay firmas de muerte asociada a apoptosis de la célula (como las células con las membranas aún intactos, ver protocolo línea 4.6.3, la clasificación se basa en la interpretación del investigador. Porque el mecanismo de muerte celular no está determinado por el ensayo TUNEL, es posible que otra vía de la muerte de la célula apoptosis no pudo haber causado el aumento en las células positivas TUNEL en morbilidad de los animales infectados. La diferencia en las medidas de cada ensayo podrían explicar las diferencias del patrón en los dos ensayos de probado aquí.
El ensayo de caspasas 3/7 puede ser usado para cuantificar el efecto de la infección a través del tiempo. Sin embargo, como muestras del dedo del pie de rana son pequeñas, hay limitada muestra para análisis y normalización. Un método común para la normalización de la muestra es determinar la concentración de proteínas totales de cada extracto. Como el ensayo de cuantificación de la proteína de Bradford consume muestra, no es un método eficaz para pequeños extractos. Además, se encontró que los pigmentos dentro de la rana piel Dido análisis por espectrometría UV-Vis de nano. Tamaños de muestra pequeños también prevenir normalización peso seco. Se sugiere estimar la superficie de la piel del dedo del pie utilizando la fotografía, como las muestras de punta de dedo del pie (estas ranas fueron menos de 3 g en tamaño de cuerpo) eran demasiado pequeñas como para permitir análisis de concentración de proteínas y concentración de la caspasa. Se encontró que fotografiar los dedos del pie y usando una estimación de la superficie de la piel es tan eficaz como el análisis de la concentración de proteína tradicionales.
En este estudio, utiliza dos técnicas estándar para cuantificación de muerte celular y apoptosis, pero había adaptado a los métodos para los anfibios y las muestras de tejido pequeñas. Para el ensayo TUNEL, nos eutanasia al animal para asegurar suficiente tejido estaba disponible para el análisis y permite la comparación de localizaciones de la piel diferente. Es posible adaptar este método a pequeñas muestras de tejido, como una biopsia de las correas del dedo del pie, que no requeriría la eutanasia del animal. Dependiendo del tamaño del animal, las biopsias podrían permitir por una vez la serie de prueba similares a nuestro enfoque para el análisis de caspasas 3/7.
En el futuro estudios, sugerimos el uso de ensayos adicionales para explorar la muerte celular y apoptosis en el transcurso de la infección quitridiomicosis porque todavía hay mucho que aprender de los mecanismos causales de la patogenesia de la quitridiomicosis. Estos resultados sugieren que la apoptosis y muerte celular epidérmica pueden ser importantes en la patogenia de la Bd; sin embargo, se necesita más investigación para determinar la influencia de la apoptosis en los resultados de la enfermedad, particularmente en los hosts que no sucumbió a la infección por.
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Disclosures
Los autores no declaran a intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Agradecemos a las siguientes personas que ayudaron con cría y recogida de datos: Tegtmeier D. C. De Jong, J. Hawkes, K. Fossen, Percival S., M. McWilliams, L. Bertola, M. Stewart, Harney N. y T. Knavel; y M. Merces ayuda con disecciones. También nos gustaría agradecer a M. McFadden, P. Harlow y Taronga Zoo para aumentar la L. v. alpinay G. Marantelli para levantar los p. corroboree. Agradecemos a F. Pasmans, A. Martel para asesoramiento en ensayos de apoptosis, Constantino C., Kladnik A. y R. Webb ayuda con ensayo TUNEL, y Emeto T. y W. Weßels para ayudan con el protocolo y kit para análisis de caspasas 3/7. Este manuscrito y el protocolo se ha adaptado de Brannelly et al 2017 Peer J22.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| POLARstar Omega | BMG Labtech | Luminescent plate reader | |
| 384 well flat clear bottom plate | Corning | 3707 | |
| 384 well low flange white flat bottom plate | Corning | 3570 | |
| Agar Bacteriological (Oxoid) | Fisher | OXLP0011B | |
| Formal-Fixx 10% Neutral Buffered Formalin | Fisher | 6764254 | |
| Lactose Broth (Oxoid) | Fisher | OXCM0137B | |
| Sodium Bicarbonate | Fisher | BP328-500 | |
| Tricane-S (MS-222) | Fisher | NC0872873 | |
| Tryptone | Fisher | BP1421-500 | |
| Bovine Serum Albumin | Invitrogen | 15561020 | |
| Sterile rayon swab | Medical Wire & Equipment | MW-113 | |
| ApopTag Red In Situ Apoptosis Detection Kit | Merck Millipore | S7165 | |
| Coomassie Bradford reagent | Pierce | 23200 | |
| Caspase Glo 3/7 | Promega | G8090 | |
| HEPES buffer | Sigma Aldrich | H0887-20ML | |
| Magnesium chloride | Sigma Aldrich | 1374248-1G | |
| Gelatin hydrolysate Enzymatic | Sigma-Aldrich | G0262 | |
| PBS (Phosphate Buffered Saline), pH 7.2 (1X) | Thermo/Life | 20-012-043 | |
| Prepman | Thermo/Life | 4318930 | |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | ThermoFisher | 4444556 | |
| Parafilm | Bemis | PM996 | |
| Clorox bleach | Clorox | ||
| Ethanol, 200 Proof, Molecular Grade | Fisher | BP2818500 | |
| ZEISS Axio Scan florescent miscroscope | Carl Zeiss | Florescent microscope | |
| 3.2mm stainless steel beads | BioSpec | 11079132SS | |
| Primer ITSI-3 Chytr (5′-CCTTGAT ATAATACAGTGTGCCATATGTC-3′) |
Taqman | Individual design for primers and probe | |
| Primer 5.8S Chytr (5′-TCGGTT CTCTAGGCAACAGTTT-3′) |
Taqman | Individual design for primers and probe | |
| Minor groove binder probe Chytr MGB2(5′-CGAGTCGAAC-3′) | Taqman | Individual design for primers and probe | |
| Rotor-Gene qPCR Instruments | Qiagen | qPCR machine | |
| Microcentrifuge tubes 1.5ml | Fisher | 02-681-372 | |
| Cell culture petri plates | Nunc | 263991 | |
| Mini-beadBeater Zircornia-Silicate Beads, 0.5mm | BioSpec | 11079105Z |
References
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