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Immunology and Infection

Usando o Terminal Transferase-mediada dUTP Nick End-rotulagem (TUNEL) e Caspase 3/7 ensaios a morte de células epidérmicas medida em sapos com quitridiomicose

Published: May 16, 2018 doi: 10.3791/57345
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1
1One Health Research Group, College of Public Health, Medical and Veterinary Sciences, James Cook University, 2Department of Biological Sciences, University of Pittsburgh

Summary

Podemos quantificar a morte celular epidérmica em sapos com quitridiomicose usando dois métodos. Primeiro, usar terminal transferase-mediated dUTP nick em situ histologia rotulagem final (TUNEL) para determinar diferenças entre animais clinicamente infectados e não infectados. Em segundo lugar, realizamos uma análise de série de tempo da apoptose infecção usando uma análise de proteínas caspase 3/7.

Abstract

Anfíbios estão enfrentando uma grande perda de biodiversidade global e uma das principais causas é a doença infecciosa quitridiomicose. Esta doença é causada por patógeno fungo Batrachochytrium dendrobatidis (Bd), que infecta e interrompe a epiderme de rã; no entanto, as alterações patológicas não foram explicitamente caracterizadas. Apoptose (morte celular programada) pode ser usado por patógenos para danificar o tecido do hospedeiro, mas também pode ser um mecanismo de anfitrião de resistência a doenças, para a remoção do agente patogénico. Neste estudo, podemos quantificar a morte de células epidérmicas de animais infectados e não infectados, usando dois diferentes ensaios: terminal transferase-mediated dUTP nick end-rotulagem (TUNEL) e caspase 3/7. Usando ventral, dorsal e o tecido da pele da coxa no ensaio de TUNEL, observamos pilha morte no células epidérmicas em situ de animais clinicamente infectados e comparar a morte celular com animais não infectados usando microscopia fluorescente. A fim de determinar como os níveis de apoptose na epiderme mudam no curso da infecção, nós removemos amostras de ponta de dedo do pé-quinzenalmente durante um período de 8 semanas e use um ensaio do caspase 3/7 com proteínas extraídas para quantificar a atividade dentro das amostras. Nós então correlacionar atividade caspase 3/7 com carga de infecção. O ensaio TUNEL é útil para a localização da célula morte em situ, mas é caro e tempo intensivo por amostra. O ensaio do caspase 3/7 é eficiente para tamanhos de amostra grande e tempo experiências do curso. No entanto, porque biópsias de ponta de dedo de rã são pequenas há extrato limitado disponível para padronização de amostra através de métodos de quantificação da proteína, tais como o ensaio de Bradford. Portanto, sugerimos que estimar a área de superfície da pele através da análise fotográfica de biópsias do dedo do pé para evitar consumir extratos durante a padronização da amostra.

Introduction

Os anfíbios são actualmente uma as maiores perdas de biodiversidade global de qualquer vertebrado táxons1. Das principais causas destes declínios é a quitridiomicose de doença de pele fatal, causada por patógeno fungo Batrachochytrium dendrobatidis, Bd2. O patógeno infecta superficialmente a epiderme, que pode levar ao rompimento de função da pele, resultando em perda de eletrólito grave, parada cardíaca e morte3. Vários potenciais hospedeiro imune mecanismos contra Bd atualmente estão sendo estudados, tais como peptídeos antimicrobianos4,5, flora bacteriana cutânea6, imune celular receptores7,8, e linfócitos atividade9,10. No entanto, poucos estudos exploram se morte de apoptose e célula epidérmica é um mecanismo imune contra este agente patogénico mortal.

Morte celular, por meio de apoptose (morte celular programada) ou necrose (morte sem programado), a epiderme pode ser uma patologia de infecção de Bd . Pesquisas anteriores sugerem que Bd infecção pode induzir apoptose porque interrupção das junções intracelulares é observada quando a pele explantes estão expostos a zoospore sobrenadantes em vitro11. Além disso, alterações epidérmicas degenerativas em Bd-rãs infectadas são observadas usando microscopia eletrônica12,13. Transcriptomic análises indicam que as vias de apoptose são upregulated em pele infectada14, e anfíbios splenocytes sofrem apoptose quando eles são expostos a Bd sobrenadantes em vitro15. Apesar do volume crescente de evidências sugerindo que o Bd pode induzir apoptose e anfitrião pilha morte em vitro, estudos em vivo que explore ou quantificar a apoptose mecanismos através a progressão da infecção são escassos. Além disso, é desconhecido se o host usa apoptose como uma estratégia de defesa imune para combater infecção de Bd , ou se a apoptose é uma patologia da doença.

Neste estudo, tivemos como objetivo detectar morte celular epidérmica e apoptose em animais infectados na vivo usando dois métodos: ensaio de proteínas caspase 3/7 e terminal transferase-mediated dUTP nick rotulagem final (TUNEL) em situ do ensaio. Como cada ensaio detecta diferentes aspectos da célula morte16, juntos, esses métodos fornecem uma completa compreensão dos mecanismos envolvidos na morte celular e certifique-se de uma medida exata do efeito. O ensaio do caspase 3/7 quantifica a atividade das caspases efetoras 3 e 7, que permite a quantificação de ambas as vias de apoptose intrínseca e extrínseca. Em contraste, o ensaio TUNEL detecta fragmentação de DNA, que é causada por mecanismos de morte celular, incluindo apoptose, necrose e pyroptosis17. Nós usamos o ensaio do TUNEL para investigar o local da morte de pilha dentro da epiderme dos animais clinicamente infectados e não infectados usando três seções de pele diferentes: o dorso, o ventre e a coxa de Pseudophryne corroboree. Este método identifica o site anatômico de morte celular, bem como distinguir sua localização dentro de específicas camadas epidérmicas. Em seguida, usamos o ensaio do caspase 3/7 para conduzir uma quantificação de série de tempo da apoptose durante uma infecção de 8 semanas em Litoria verreauxii alpina. Tomamos amostras de ponta de dedo quinzenal dos mesmos animais e são capazes de correlacionar a carga de infecção do patógeno com atividade da caspase 3/7.

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Protocol

Universidade James Cook aprovado ética animal em aplicações A1875 para corroborre p. e A1897 e A2171 para L. v. alpina.

1. criação de animais e de monitoramento

  1. Casa animais individualmente, em um ambiente adequado para a espécie, com uma água adequada, alimentação e horário de limpeza. Verifique os animais diariamente.
    1. Use indivíduos adultos do criticamente em perigo Pseudophryne corroboree (para o ensaio de TUNEL, seção 4) e o ameaçado Litoria verreauxii alpina (para o ensaio de Caspase 3/7, seção 5), doou de cativo de instalações de criação. Manter os animais em 15-18 ° C, em um musgo e substrato de cascalho, névoa-los diariamente com água de osmose reversa e alimentar 3 vezes semanalmente com intestino carregado grilos.
  2. Colete dados sobre cada vez que individuais semanalmente. Esfregue os indivíduos para Bd , conforme descrito no passo 2.1. Pesar cada animal para neared 0,1 g usando uma escala e medir seu focinho para deixar sair o comprimento (CRC) para o mais próximo 0.01 mm usando pinças de discagem.
  3. Após a inoculação (como descrito na seção 3), verifique os animais diariamente para sinais clínicos de infecção (slough pele irregular, inappetence, vermelhidão de perna, letargia ou reflexo de braço endireitante retardado), em conformidade com as diretrizes de ética animal. Eutanásia em animais se morbidade e sinais clínicos estão presentes.
    1. Eutanásia com uma overdose de Metanossulfonato de metanosulfonato (MS222) (0,1% w/v MS222 a pH 6-7 com bicarbonato de sódio na água da torneira envelhecido). Manter animais em MS222 de 10 min depois de tudo movimento cessa e eles exibem sem resposta a estímulos.

2. teste para infecção de Bd

  1. Limpeza para Bd
    1. Limpe cada animal com um novo swab estéril viscose (um cotonete por animal). Use o seguinte método de limpeza: cinco vezes sobre o ventre, cinco vezes em cada coxa, lado e membro. Isto é um total de 45 acidentes vasculares cerebrais.
    2. Rode o swab suavemente durante e entre traçados para garantir efetiva captura de DNA. Quebre a ponta do cotonete para tubos de 1,5 mL microcentrifuga e armazenar a-20 ° C até a extração.
  2. Extração de DNA e qPCR ensaio
    1. Extrai DNA genômico das zaragatoas pela adição de 50 µ l de um reagente de extração de DNA comercialmente disponível com 30-40 mg de grânulos de sílica de 0,5 mm. Grânulo bate as amostras em um disruptor de célula grânulo bate em velocidade máxima por 2 min. Após a etapa de batedor do grânulo, Centrifugar as amostras a 2.000 x g por 1 min.
    2. Incubar as amostras a 100 ° C por 10 min e deixe para esfriar. Centrifugar as amostras a 5.000 x g, durante 3 min e depois transferir o sobrenadante para tubos de centrífuga micro individual 1,5 mL e armazenar a-20 ° C até qPCR.
    3. Use o PCR quantitativo (qPCR) seguindo Boyle et al . 200418 para analisar a carga de infecção. Use as seguintes modificações:
      1. Dilua o 6:100 de amostras de extração de DNA com água desionizada dupla. Adicione 0,7 µ l de albumina de soro bovino (BSA) em cada poço para ajudar a prevenir a inibição de PCR. Execute cada amostra em singlicate. Em cada prato use um controle positivo e um controle negativo (sem modelo) com uma série de padrões de diluição para estimar a carga de zoospore (infecção).

3. inoculação

  1. Cultura Bd
    1. Prepare a cultura caldo adicionando 16 g de triptona, 2 g de hidrolisado de gelatina e 4G de lactose (TGHL) para 1L de água desionizada. Autoclave (121 ° C por 40 min) e deixe o caldo esfriar.
    2. Inocular Bd isolado (no caso, isolado de Nova Gales do Sul isolado, AbercrombieR-L.booroologensis-2009-LB1, passagem número 11) em um caldo TGHL e crescer para 7D a 23 ° C e, em seguida, transfira o caldo de cultura para placas de ágar TGHL.
    3. Para fazer as placas, adicione 16 g de triptona, 2 g de hidrolisado de gelatina, 4G de lactose (TGHL) e 10 g de ágar bacteriológico para 1L de água desionizada e autoclave (121 ° C por 40 min). Quando a mistura estiver fria o suficiente para tocar, mas antes que ela se solidifica, despeje o ágar TGHL 92mm placas de cultura de diâmetro assim que são 1/4 a 1/3 cheio, um segurança microbiológica classe II.
    4. Quando o ágar tem solidificado e esfriado completamente, semear cada placa com 0,5 mL de Bd do caldo líquido e espalhe uniformemente. Deixe a mistura de caldo Bd secar em placa por aproximadamente 1h e depois selá placas com película de plástico da parafina. Incube a agar para placas para baixo a 23 ° C, durante 5-7 d.
  2. Placas de inundação para solução de inoculação de zoospore
    1. Verifica a mobilidade do zoospore sob um microscópio invertido para assegurar a viabilidade diariamente antes da inoculação. Quando zoospore lançamento é alto, com muitos zoósporos nadando fora os esporângios, a cultura está pronta para inoculação.
    2. Inunde cada prato com 3 mL de envelhecido água da torneira ou água da lagoa artificial, derramando água na placa e incubar à temperatura ambiente durante 10 minutos permitir que os zoósporos liberar na água. Após o período de incubação, decante a suspensão de zoospore para um novo recipiente estéril.
    3. Estimativa de concentração de zoospore seguindo as instruções do fabricante, usando um haemocytometer. Uma vez que a concentração da suspensão de zoospore é conhecida, dilua a suspensão a uma concentração de 1 x 106 zoósporos por 3 mL com água da torneira envelhecida.
  3. Inocular animais
    1. Inocule cada animal por derramamento 3 mL de mistura de inóculo sobre seu ventre19 em recipientes individuais de 50 mL. Permitir que o excesso inóculo coletar na base do recipiente de inoculação. Deixe cada animal em recipiente individual inoculação durante 24 h garantir a infecção e após a inoculação de 24 h, retornar cada indivíduo para um terrário desinfectado.
      1. Desinfectar terrários usando um de solução de lixívia comercial2013% volume/volume (v/v), enxágue pelo menos duas vezes com água e, em seguida, deixe-a secar por nada menos que 24 h.
    2. Para Bd-negativo controles, simulado inocular os animais usando os mesmos métodos como em 3.2-3.3, mas inundar Bd-placas de ágar gratuito com 5 mL de água da torneira envelhecida em vez de Bd placas de ágar inoculado.

4. TUNEL ensaio

  1. Eutanásia em animais que estão mostrando sinais clínicos de quitridiomicose, conforme descrito na etapa 1.3.1 e um número igual de Bd-negativo animais de controle.
  2. Dissecar a pele (dorsal, ventral e coxa) amostras de cada animal. Fixar as amostras de pele para 2h em formol de tampão fosfato 4% v/v. O curto e consistente de fixação de tempo permite que os tecidos totalmente fixada, mas também permite a coloração imunohistoquímica eficaz e precisa. Então transfira para 80% de etanol até incorporação para corte.
  3. Incorpore a pele em cera de parafina para preparação histológica, seguindo os métodos padrão21. Brevemente, o protocolo é o seguinte:
    1. Desidratar tecidos em uma série graduada de etanol e limpar o etanol com xilol. Incorporar o tecido em cera de parafina e coloque todas as amostras de pele de três para cada indivíduo em bloco de um parafina.
  4. Pele de seção usando um micrótomo preparação histológica padrão21a seguir. Secção do tecido serialmente em 5 µm e então apor em lâminas de vidro hidrofílico. Coloque quatro histosections seriais por tipo de pele por slide. Fazer três slides por indivíduo com seções de pele serial, lembre-se que cada slide tem quatro seções de cada tecido afixada.
  5. Mancha os slides na seguinte ordem:
    1. Mancha o primeiro slide com hematoxilina, seguida pela eosina counterstaining (H & E). Este slide é para visualizar a localização do Bd esporângios dentro da pele.
    2. Manchar o segundo slide após um ensaio TUNEL comercialmente disponível para preparação histológica e siga as instruções do fabricante, que são descritas abaixo.
      1. Primeiro, deparaffinize as seções de tecido em uma jarra de coplin lavando os slides com três mudanças de xileno por 5 min por lavagem e siga com duas mudanças de etanol 100% por 5 min a cada lavagem. Siga com uma lavagem de etanol a 95% por 3 min e, em seguida, etanol a 70% por 3 min. revestimento com uma lavagem de PBS por 5 min.
      2. Pré-tratamento o tecido com proteína recentemente diluída digestão enzimática (proteinase K em uma concentração de 20 μg/mL diluída em PBS) e adicionar diretamente para o slide. Permita a incubar durante 15 min. lavagem com duas mudanças de PBS em uma jarra de coplin por 2 min cada.
      3. Toque o líquido em excesso e saciar-se em peróxido de hidrogênio de 3,0% em PBS em uma jarra de coplin por 2 min em temperatura ambiente. Lave duas vezes com PBS, por cinco minutos cada lavagem.
      4. Toque o líquido em excesso e, em seguida, aplicar 75 µ l/5 cm2 do buffer equilíbrio diretamente sobre o tecido no slide. Incubar durante 10 s. torneira o líquido em excesso ao redor da seção e aplicar 55 µ l/5 cm2 de trabalho terminal deoxynucleotidyl tranferase (TdT) enzima. Incubar em uma câmara umidificada para 1 h a 37 ° C.
      5. Após a incubação de TdT, colocar o slide em uma jarra de coplin debuffer paragem/lavagem trabalhar força, agitar durante 15 s e incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente. Lave o slide com três mudanças de PBS durante 1 min por lavagem. Toque o líquido em excesso.
      6. Aplica o conjugado anti-Digoxigenina (rodamina) que tenha sido aquecido à temperatura no tecido, 65 µ l/5 cm2. Incubar em uma câmara umidificada por 30 min em temperatura ambiente e evite a exposição à luz. Lavar com quatro mudanças de PBS por 2 min por lavagem. Toque o líquido em excesso.
      7. Revestimento por adicionando 15 µ l de 0.5 - 1 µ g/mL DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole) no meio de montagem de slide para o slide, que actua como uma mancha de contador. Em seguida, cubra com uma lamínula e selar com esmalte ou cimento de borracha. Permita slides secar no escuro, como o ensaio é sensível à luz.
    3. Mancha o terceiro slide está manchada usando o ensaio TUNEL e corante de contraste DAPI, mas usar como um controle positivo e negativo para cada amostra.
      Nota: Das 4 histosections nas corrediças de controle, os 2 primeiros são repetições de controlo positivo e os últimos 2 são repetições de controle negativo.
      1. Para os controles positivos, ao invés de passo 4.5.2.2, Pre-treat o tecido com tampão DN (30mM trizma base, pH 7.2, 4mM MgCl2, 0,1 mM DDT) e deixe incubar em temperatura ambiente por 5 minutos. Então dissolver Dnase I em DN de buffer para uma concentração final de 0.1ug / mL e aplicá-lo diretamente para o slide. Incube durante 15 minutos à temperatura ambiente.  Em seguida, lave o slide com lavagem 5 de dH2O por 3 minutos cada lavagem. Borre o líquido em excesso. Em seguida, retome o ensaio TUNEL conforme indicado na seção 4.5.2.3.
      2. Para os controles negativos, não adicione enzima terminal deoxynucleotidyl tranferase (TdT) para as amostras (conforme descrito na seção 4.5.2.4).
  6. Observe o TUNEL slides imediatamente após a conclusão do ensaio.
    1. Tirar fotos ao acaso intervalos ao longo de cada seção de pele em 200x usando um microscópio fluorescente, usando filtros de ambos o rodamina de Truant, que revela as células apoptóticas e aparece vermelho e DAPI que revela todos os núcleos e aparece azul, para que uma sobreposição de as células podem ser geradas. Certifique-se de pelo menos 100 células são fotografadas por seção de pele, por exemplo. Armazenar os slides em uma caixa escura microscópio a-20 ° C.
    2. Contar as células (DAPI azul manchado) por imagem. Certifique-se de pelo menos 100 células são contadas por seção da pele. Para chegar a 100 células, conte todas as células de dentro da imagem. Se menos 100 células estão presentes em uma imagem, conte uma outra imagem até que pelo menos 100 células são alcançadas por seção de pele por animal.
    3. Em seguida, conte o número de células positivas do TUNEL nas mesmas imagens (rodamina vermelha manchada). Células positivas TUNEL, que indicam a apoptose e necrose nem fundo, são células únicas, com bordas de células claras (membranas estão intactas com nenhum Lise). Às vezes as células encolhem a corpos apoptotic de formulário.
    4. Localizar as áreas contadas no ensaio de TUNEL e analisar as regiões correspondentes na H & E manchado histosections. Confirmar que a H & E manchado seções correspondem aos locais de infecção de Bd , que garante a Bd-sites infectados são usados quando a contagem de células apoptóticas no ensaio de TUNEL.

5. ensaio do Caspase 3/7

  1. Coletar dicas de dedo do pé de cada animal ( Bd- expostos e Bd- negativa) uma vez semanalmente através de inoculação de post semana 3 e quinzenalmente o final do experimento, até 8 pés por indivíduo.
    1. Corte a ponta do dedo do pé na segunda falange com uma tesoura de flama-esterilizados e coloque em um microtubo de 1,5 mL e congelar imediatamente a-80 ° C.
  2. Extrai as proteínas da amostra congelada do dedo do pé.
    1. Colocar as amostras em 100 µ l de tampão de amostra (25mm HEPES pH 7, 5mm MgCl2) com duas esferas de aço inoxidável (3,2 mm) em um microtubo de tampa de rosca de 1,5 mL. Lyse amostras por 4 ciclos de 1 min do grânulo batendo na velocidade máxima (no batedor de grânulo mesmo como passo usado em 1.2.1) seguida por 3 min no gelo. Após a Lise, Centrifugar as amostras a 12.000 x g e 4 ° C por 5 min. Collect sobrenadante usar no ensaio.
  3. Quantificar a concentração de proteína, por exemplo, usando o ensaio de Bradford.
    1. Em um prato bem 384, misture 10 µ l de proteína extrato com 10 µ l de reagente de Bradford e incube por 2 min à temperatura ambiente. Realizar cada amostra em duplicado, juntamente com uma série de 5 dobre padrões de diluição de BSA. Ler a absorvância a 595 nm em um leitor de placa de absorvância.
  4. Como alternativa, se as amostras de ponta de dedo do pé são muito pequenas (a concentração de proteína é perto o padrão mais baixo, como determinado a partir do ensaio de Bradford em passo 4.3.1, ou se os sapos que são amostrados em 3 g de peso total), padronizar as amostras por estimar a superfície da pele área usando fotografias, em vez do ensaio de Bradford.
    1. Antes de extrair as proteínas da amostra para o ensaio do caspase, fotografe cada dedo do pé na ampliação de X 40 usando um microscópio invertido.
    2. Analise a amostra de dedo do pé, usando um computador de processamento de imagens software, estimando-se a área dos dedos do pé. Para fazer isso, desenhar uma linha ao redor da borda do clipe de dedo do pé e tem a área de estimativa de software da imagem latente dentro da forma. Então, multiplique nessa área por pi (3,14), que vai aproximar a área de superfície da amostra 3-dimentional pele (como comprimento x área da seção transversal (pi x diâmetro) dá a área da superfície exterior de um tubo).
  5. Realize o ensaio do caspase 3/7.
    1. Em um prato de luminescência bem 384, adicione 10 µ l de reagente comercialmente disponível caspase 3/7 e 10 µ l de extracto de proteína. Execute cada amostra em triplicado.
    2. Misture os reagentes agitando o prato lentamente por 15 s. Incubar a placa de luz por 30 min à temperatura ambiente. Luminescência de medida usando um leitor de placas luminescentes.

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Representative Results

Ensaio TUNEL

Havia mais células positivas do TUNEL nos animais infectados do que nos animais controle não infectados. A localização em situ do TUNEL positivo células diferiam em infectados e controlar animais. Nos animais controle, houve uma distribuição uniforme de TUNEL positivo células em toda a derme e epiderme da pele camadas em níveis baixos (ver figura 1A), mas nos animais infectados, as células positivas TUNEL foram mais frequentes na epiderme (Figura 1B). os sítios de infecção (como observado na H & E manchado slides) foram observados como aglutinado Bd esporângios espalharam através da coxa e seções de pele ventral com nenhum nas seções de dorso. Enquanto o TUNEL células positivas foram mais concentradas em e diretamente adjacentes aos locais de células infectadas (Figura 1), havia também células positivas de TUNEL mais difundidas sobre a epiderme e nas camadas epidérmicas que eram mais profundas do que onde Bd residia. Em Bd infectados por havia mais células positivas do TUNEL em todos os tipos de pele três analisados, mas um nível particularmente elevado na pele da coxa e venter (12.01 vezes maior (95% CI: 4.92-26.30) na pele da coxa e 22,31 vezes maior (95% CI 5,25-94.82) na pele de Venter) (Figura 2).

Ensaio do caspase 3/7

No curso da infecção, havia uma diferença na atividade de caspases. Em animais de Bd infectados, intensidade de infecção foi positivamente correlacionada com atividade caspase 3/7 (Figura 3). Também havia uma diferença entre animais infectados e não infectados através do tempo, inoculação de post. Caspase 3/7 atividade diminuída dentro das primeiras semanas após a inoculação (com 48.36% menos atividade em animais infectados) e então aumentado no final de semana 7 (Figura 4) em Bd animais infectados, mas manteve-se constante em não infectados indivíduos.

Figure 1
Figura 1: Terminal transferase-mediated dUTP nick rotulagem final (TUNEL) no ensaio de situ de infectados e não infectados animais. A) Bd- controle seção de pele da coxa de Pseudophryne corroboree e B) Bd+ coxa pele secção de p. corroborre manchadas pelo ensaio de TUNEL em situ . O azul é DAPI coloração indicando núcleos das células, e o vermelho é o rodamina, que indica a fragmentação de DNA caracteristicamente causada por apoptose. A seta amarela indica a posição do cluster Bd visto no painel C. C) p. corroborre seção da pele da coxa corados com H & E. A seção H & E é serial para painel B. Existe um aglomerado de esporângios de Bd vazios (seta) e alguns esporângios imaturos escuros perto da superfície da pele. Para todos os três painéis a epiderme está na parte superior da foto. Comparando os painéis B e C mostram que a rodamina manchada células epidérmicas estão concentrada em torno e abaixo do cluster de Bd e danos de pele onde é visível, como a formação de micro vesículas entre células epidérmicas basais. Ampliação de 400 X e a barra de escala indica 0,03 mm. adaptado de Figura 2 em Brannelly et al . 2017 Peer J22. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: A proporção de TUNEL positivo (TUNEL +) células de cada tipo de pele. A proporção de células de apoptotic positivo TUNEL por tipo de pele em p. corroborre, com animais infectados, indicando animais que sucumbiram à doença (n = 9) e os animais não infectados controle (n = 10). Barras de erro indicam os intervalos de confiança de 95% de uma proporção e * indica um aumento significativo no TUNEL + célula proporções. Na pele dorsal, os animais infectados tinham 14.38 (95% CI 3,32-62.24) vezes mais células positivas do TUNEL que animais controle (Odds Ratio: Z = 3,57, p < 0,01). Na pele da coxa, animais infectados tinham 12.01 (95% CI: 4.92-26.30; Odds Ratio: Z = 5.46, p < 0,01) vezes mais células positivas do TUNEL que animais controle (Chi quadrado Pearson: χ21 = 44.30, p < 0,01). Na pele venter, animais infectados tinham 22.31 (95% CI 5,25-94.82) vezes mais células positivas do TUNEL que animais controle (Odds Ratio: Z = 4,21, p < 0,01). Adaptado de Figura 3 em Brannelly et al 2017 Peer J22. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: A correlação entre a intensidade da infecção, Log10(equivalentes de zoospore) e caspase 3/7, Log10(Caspase) de inoculado Litoria verreauxii alpina ao longo do experimento. A correlação entre a intensidade da infecção e atividade da caspase é 0.463, e a linha de tendência tem uma equação y = x (0.229) + 0.939. Adaptado de Figura 4 em Brannelly et al. 2017 peer J22. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Atividade de Caspase 3/7 através de 7 semanas para cada grupo de Litoria verreauxii alpina: Bd-infectados por isso sucumbiu à doença (n = 4) e não infectados controles (n = 8). Atividade da caspase é definido como a luminescência leitura controlada pela concentração de proteína por amostra e então log base 10 transformado. A atividade da caspase (Log10 transformado) para cada grupo por semana. Barras de erro indicam o erro padrão. * indica que os animais infectados diferiam dos controles não infectados naquela semana. (Modelo linear de efeitos mistos: semana, F4 = 11.974, p < 0,01; semana * status, F8 = 2,139, p = 0.037; Semana 3 ANOVA, F2,18 = 5.512, p = 0,014), adaptado da Figura 5 no ponto J. Brannelly et al . 201722. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Nós exploramos epidérmico apoptose e morte celular, como um mecanismo potencial de patologia de quitridiomicose a doença mortal ou um mecanismo de resistência a doenças em espécies sensíveis de Bd . Usamos dois métodos de avaliação de morte celular na epiderme, ensaio TUNEL para em situ análise de morte de células epidérmicas e ensaio do caspase 3/7 para monitoramento morte celular epidérmica em todo o progresso da infecção. Descobrimos que apoptose e morte celular é correlacionadas com carga de infecção e morte celular é significativamente maior no local da infecção. Na infecção precoce, há uma diminuição da apoptose na epiderme, mas apoptose aumenta com o aumento da carga patógeno dentro o tecido infectado.

Apoptose em células pode ser testado usando várias abordagens diferentes, cada um com benefícios e limitações. É importante estudar a morte de apoptose e célula usando vários ensaios a fim de confirmar as conclusões. Neste estudo, nós exploramos dois ensaios diferentes para investigar a morte de células epidérmicas e apoptose em sapos com quitridiomicose. Primeiro, temos testado o TUNEL do ensaio para avaliar a célula morte in situ. Este teste é demorado e caro por amostra, e slides devem ser lidos imediatamente como o sinal fluorescente desvanece-se rapidamente. Apesar dessas limitações, os resultados deste experimento em situ são importantes para compreender mais os mecanismos de interações patógeno-hospedeiro. Informações sobre a localização podem ser determinadas usando este método, e em nosso estudo apoptose esteve presente em níveis elevados no local da infecção fúngica e mais difusamente em outros locais. Além disso deve-se notar que o ensaio TUNEL medidas de dano do ADN, que pode ser causado por uma série de mecanismos de morte celular diferentes incluindo apoptose, necrose e pyroptosis17. Enquanto existem assinaturas de morte associada a apoptose celular (tais como células únicas com membranas ainda intacta, consulte linha protocolo 4.6.3, a classificação baseia-se sobre a interpretação do pesquisador. Porque o mecanismo de morte celular não é determinado pelo ensaio de TUNEL, é possível que um outro caminho de morte de células não-apoptose pode ter causado o aumento em células positivas de TUNEL na morbidade dos animais infectados. A diferença de que medidas de cada ensaio podem explicar as diferenças de padrão em dois ensaios testado aqui.

O ensaio do caspase 3/7 pode ser usado para quantificar o efeito da infecção através do tempo. No entanto, como amostras de dedo do pé do sapo são pequenas, há uma amostra limitada para análise e padronização. Um método comum para padronização de amostra é determinar a concentração de proteínas totais de cada extracto. Como o ensaio de quantificação da proteína Bradford consome amostra, não é um método eficaz para pequenos extractos. Além disso, achamos que os pigmentos dentro do sapo pele análise impedida por espectrometria de nano UV-Vis. Tamanhos de amostra pequenos também impediram a padronização em peso seco. Sugerimos que estimar a área de superfície da pele dos dedos do pé, usando a fotografia, como as amostras de ponta de dedo do pé (Estes sapos eram menos de 3G no tamanho do corpo) eram demasiado pequenas para permitir ensaios para concentração de proteína e caspase concentração. Nós achamos que fotografar os dedos e usando uma estimativa de área de superfície de pele são tão eficaz quanto as análises de concentração de proteína tradicional.

Neste estudo, nós usado duas técnicas padrão para quantificação de morte celular e apoptose, mas adaptado os métodos para anfíbios e pequenas amostras. Para o ensaio TUNEL, nós eutanásia do animal para garantir suficiente tecido estava disponível para o ensaio e permitido para a comparação de locais de pele diferente. É possível adaptar esse método para pequenas amostras de tecido, tais como a biópsia de cintas do dedo do pé, que não exigiria a eutanásia do animal. Dependendo do tamanho do animal, biópsias poderiam permitir um tempo série teste semelhante a nossa abordagem para o ensaio do caspase 3/7.

No futuro estudos, sugerimos a utilização de ensaios adicionais para explorar a morte celular e apoptose no curso da infecção quitridiomicose porque ainda há muito a aprender dos mecanismos causais da patogênese de quitridiomicose. Estes resultados sugerem que a apoptose e morte celular epidérmica podem ser importantes na patogênese da Bd; no entanto, é necessária mais investigação para determinar a influência da apoptose em resultados de doença, particularmente em hospedeiros que não sucumbem à infecção.

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Disclosures

Os autores declaram não concorrentes interesses financeiros.

Acknowledgments

Agradecemos às seguintes pessoas que ajudaram com criação e recolha de dados: Tegtmeier D. C. De Jong, J. Hawkes, Fossen K., S. Percival, M. McWilliams, L. Bertola, M. Stewart, s. Harney e T. Knavel; e M. Mercês para obter assistência com dissecações. Também gostaríamos de agradecer a M. McFadden, P. Harlow e Taronga Zoo para elevar o L. v. alpinae G. Marantelli para elevar o p. corroborre. Agradecemos a F. Pasmans, r. Martel para aconselhamento sobre ensaios de apoptose, C. Constantino, r. Kladnik e R. Webb para obter assistência com ensaio TUNEL, e T. Emeto e W. Weßels para ajudarem com o protocolo e kit de ensaio do caspase 3/7. Este manuscrito e o protocolo é adaptado de Brannelly et al 2017 Peer J22.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
POLARstar Omega BMG Labtech Luminescent plate reader
384 well flat clear bottom plate Corning 3707
384 well low flange white flat bottom plate Corning 3570
Agar Bacteriological (Oxoid) Fisher OXLP0011B
Formal-Fixx 10% Neutral Buffered Formalin Fisher 6764254
Lactose Broth (Oxoid) Fisher OXCM0137B
Sodium Bicarbonate Fisher BP328-500
Tricane-S (MS-222) Fisher NC0872873
Tryptone Fisher BP1421-500
Bovine Serum Albumin Invitrogen 15561020
Sterile rayon swab Medical Wire & Equipment MW-113
ApopTag Red In Situ Apoptosis Detection Kit Merck Millipore S7165
Coomassie Bradford reagent Pierce 23200
Caspase Glo  3/7 Promega G8090
HEPES buffer Sigma Aldrich H0887-20ML
Magnesium chloride Sigma Aldrich 1374248-1G
Gelatin hydrolysate Enzymatic Sigma-Aldrich G0262
PBS (Phosphate Buffered Saline), pH 7.2 (1X) Thermo/Life 20-012-043
Prepman Thermo/Life 4318930
TaqMan Fast Advanced Master Mix ThermoFisher 4444556
Parafilm Bemis PM996
Clorox bleach Clorox
Ethanol, 200 Proof, Molecular Grade Fisher BP2818500
ZEISS Axio Scan florescent miscroscope Carl Zeiss Florescent microscope
3.2mm stainless steel beads BioSpec 11079132SS
Primer ITSI-3 Chytr (5′-CCTTGAT
ATAATACAGTGTGCCATATGTC-3′)		 Taqman Individual design for primers and probe
Primer 5.8S Chytr (5′-TCGGTT
CTCTAGGCAACAGTTT-3′)		 Taqman Individual design for primers and probe
Minor groove binder probe Chytr MGB2(5′-CGAGTCGAAC-3′) Taqman Individual design for primers and probe
Rotor-Gene qPCR Instruments Qiagen qPCR machine
Microcentrifuge tubes 1.5ml Fisher 02-681-372
Cell culture petri plates Nunc 263991
Mini-beadBeater Zircornia-Silicate Beads, 0.5mm BioSpec 11079105Z

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References

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Imunologia e infecção edição 135 apoptose Caspase histologia patologia TUNEL doença de animais selvagens
Usando o Terminal Transferase-mediada dUTP Nick End-rotulagem (TUNEL) e Caspase 3/7 ensaios a morte de células epidérmicas medida em sapos com quitridiomicose
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Brannelly, L. A., Roberts, A. A., Skerratt, L. F., Berger, L. Using Terminal Transferase-mediated dUTP Nick End-labelling (TUNEL) and Caspase 3/7 Assays to Measure Epidermal Cell Death in Frogs with Chytridiomycosis. J. Vis. Exp. (135), e57345, doi:10.3791/57345 (2018).

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