Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Terminal transferaz-aracılı dUTP kullanarak Nick uç-etiketleme (tünel) ve Caspase 3/7 deneyleri için ölçü Epidermal hücre ölümünde kurbağalar Chytridiomycosis ile

Published: May 16, 2018 doi: 10.3791/57345
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1
1One Health Research Group, College of Public Health, Medical and Veterinary Sciences, James Cook University, 2Department of Biological Sciences, University of Pittsburgh

Summary

İki yöntem kullanarak chytridiomycosis ile kurbağa epidermal hücre ölümü ölçmek. Öncelikle, terminal dUTP transferaz-aracılı nick son etiketleme (tünel) situ Histoloji klinik olarak bulaşmış ve bulaşmamış hayvanlar arasındaki farkları belirlemek için kullanabilirsiniz. İkinci olarak, biz bir caspase 3/7 protein analizi ile enfeksiyon üzerinde apoptosis bir zaman serisi analizi kuralları.

Abstract

Hem suda hem genel olarak biyolojik çeşitlilik içinde büyük bir kayıp yaşandığı ve bulaşıcı hastalık chytridiomycosis en önemli nedenlerinden biridir. Bu hastalığı mantar patojen bozar ve kurbağa epidermis bozan Batrachochytrium dendrobatidis (Bd), tarafından neden olur; Ancak, patolojik değişiklikler açık olarak nitelendirmiştir değil. Apoptozis (programlanmış hücre ölümü) patojenlerin ana bilgisayar dokusuna zarar için kullanılabilir ama aynı zamanda hastalık direnci patojen kaldırma için bir ana mekanizma olabilir. Bu çalışmada, biz iki farklı deneyleri kullanarak bulaşmış ve bulaşmamış hayvanların epidermal hücre ölümü ölçmek: terminal dUTP transferaz-aracılı nick uç-etiketleme (tünel) ve caspase 3/7. Ventral, sırt ve uyluk deri dokusu tünel assay olarak, biz gözlemlemek kullanarak klinik olarak enfekte hayvanların in situ epidermal hücre ölümünde hücre ve hücre ölümü floresan mikroskopisi kullanılarak bulaşmamış hayvanlarla karşılaştırın. Epidermis seviyelerinde apoptosis enfeksiyon boyunca nasıl değiştiğini belirlemek için iki haftada bir 8 haftalık süre içinde ayak ucu örnekleri kaldırmak ve caspase 3/7 tahlil etkinlik örnekleri içinde ölçmek için ayıklanan proteinler ile kullanın. Biz o zaman caspase 3/7 etkinlik enfeksiyon yük ile aralarındaki ilişkileri belirlemektir. Tünel tahlil hücre ölüm situyerelleştirme için yararlıdır, ancak pahalı ve zaman örnek başına sahiptir. Caspase 3/7 tahlil örneklerin boyutu büyük ve zaman için verimli ders deneyler. Ancak, kurbağa ayak ucu biyopsisi küçüğüz çünkü mevcuttur sınırlı özü Bradford tahlil gibi protein miktar yöntemleri ile örnek standardizasyon. Bu nedenle, biz deri yüzey alanı örnek standardizasyon sırasında özleri tüketen önlemek için ayak biyopsi fotoğraf analizi ile tahmin öneririz.

Introduction

Hem suda hem şu anda herhangi bir omurgalı takson1küresel çeşitliliğin en büyük kayıp birini yaşıyorsunuz demektir. Bu düşüşler bir büyük mantar patojen Batrachochytrium dendrobatidis, Bd2tarafından neden ölümcül cilt hastalığı chytridiomycosis nedeni. Patojen yüzeysel deri işlevi şiddetli elektrolit kaybı, kalp krizi ve ölüm3bozulmasına yol açabilir epidermis bozar. Bd karşı çeşitli olası ana bilgisayar bağışıklık mekanizmaları şu anda, antimikrobiyal peptidler4,5, Kutanöz bakteriyel flora6, bağışıklık hücre reseptörleri7,8gibi incelendiği, ve lenfosit aktivite9,10. Ancak, epidermal Apoptozis ve hücre ölümü bu ölümcül patojen karşı bir bağışıklık mekanizması olup birkaç çalışmalar keşfedin.

Hücre ölümü, Apoptozis (programlanmış hücre ölümü) veya nekroz (unprogrammed ölüm), epidermis ile bir patoloji Bd enfeksiyon olabilir. Önceki araştırma hücre içi kavşak çalışmasının ne zaman cilt explants zoospore supernatants vitro11' e. maruz kalır görülmektedir çünkü Bd enfeksiyon apoptosis neden olabilir gösteriyor Ayrıca, Bdepidermal dejeneratif değişiklikler-virüslü kurbağalar gözlenen elektron mikroskobu12,13kullanarak. Transcriptomic analizleri apoptosis yolları upregulated enfekte cilt14, ve onlar Bd supernatants vitro15' e maruz kaldığında apoptosis amfibi splenocytes tabi gösterir. Büyüyen birimin Bd tetikleyebilir öneriyor kanıt rağmen hücre Apoptozis ve ana bilgisayar ölüm vitro, keşfetmek veya mekanizmalar yoluyla enfeksiyon ilerleme eksik olan Apoptozis ölçmek in vivo çalışmalar. Ayrıca, ana Bd enfeksiyon mücadele için bir savunma bağışıklık strateji olarak apoptosis kullanıyorsa veya apoptosis bir patoloji hastalık ise bilinmemektedir.

Bu çalışmada, epidermal hücre ölümü ve Apoptozis iki yöntem kullanarak enfekte hayvan in vivo algılamaya yönelik: caspase 3/7 protein tahlil ve terminal dUTP transferaz-aracılı nick (tünel) in situ tahlil son etiketleme. Her tahlil hücre ölüm16farklı yönlerini algılarken, birlikte bu yöntemlerin hücre ölümüyle mekanizmaları tam bir anlayış sağlamak ve etkisi doğru bir ölçü olun. Caspase 3/7 tahlil miktar içsel ve dışsal apoptosis yollar sağlayan efektör caspases 3 ve 7, etkinlik quantifies. Buna ek olarak, tünel tahlil apoptosis, nekroz ve pyroptosis17de dahil olmak üzere hücre ölümü mekanizmaları tarafından neden olduğu DNA fragmantasyonu algılar. Tünel tahlil hücre ölümü üç farklı cilt bölümleri kullanarak hem klinik olarak bulaşmış ve bulaşmamış hayvanların epidermiste konumunu araştırmak için kullanıyoruz: patolojisi, venter ve Pseudophryne corroboreeuyluk. Bu yöntem anatomik site konumu belirli epidermal katmanlar içinde ayrım yanı sıra, hücre ölümü tanımlar. Daha sonra caspase 3/7 tahlil apoptosis Magno16 verreauxii alpinabir 8 haftalık enfeksiyonunda boyunca, bir saat serisi miktar yapmak için kullanın. Biz ayak ucu örnekleri iki haftada aynı hayvanlardan almak ve patojen bulaşma yük caspase 3/7 aktivite ile ilişkilendirmek edebiliyoruz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

James Cook Üniversitesi L. v. alpinauygulamalarda A1875 P. corroboree ve A1897 ve A2171 için hayvan etik onayladı.

1. hayvancılık ve izleme

  1. Hayvan besleme ve zamanlama temizlik uygun bir su ile türler için uygun bir ortamda tek tek, ev. Hayvanlar her gün kontrol edin.
    1. Kritik tehlike altında Pseudophryne corroboree yetişkin bireylerin (tünel tahlil için Bölüm 4) kullanın ve tehdit Magno16 verreauxii alpina (Caspase 3/7 tahlil için Bölüm 5), bağışlanan esir İmkanları ıslahı. 15-18 ° C'de hayvanlar üzerinde bir yosun korumak ve substrat çakıl, onları günlük ters osmoz su ile sis ve 3 kez haftalık yüklü gut cırcır ile beslemek.
  2. Veri üzerinde tek tek her bir kez haftalık toplamak. Bireyler için Bd adım 2.1 içinde açıklandığı gibi temizle. Her hayvan için bir ölçek kullanarak neared 0.1 g tartmak ve arama destekleri kullanarak en yakın 0,01 mm uzunluğa (SVL) havalandırma için onların burun ölçün.
  3. (Bölüm 3 açıklandığı gibi) aşı sonra hayvanlar hayvan etik kuralları ile uyumlu (düzensiz cilt slough, inappetence, bacak kızarıklık, uyuşukluk veya gecikmeli iyileştiren refleks) enfeksiyonunun klinik belirtiler için her gün kontrol edin. Klinik belirtiler ve morbidite varsa hayvanlara ötenazi.
    1. Tricaine methanesulfonate (MS222) aşırı dozda ötenazi (% 0,1 w/v-MS222 pH 6-7 yaşında musluk suyu sodyum bikarbonat ile). Hayvanlar MS222 içinde 10 dk sonra hareket durur ve uyaranlara yanıt görüntülemek için tutun.

2. test Bd enfeksiyon için

  1. Bd için ev temizliği
    1. Her hayvan yeni bir steril Rayonu bez (hayvan başına bir çubukla) ile temizle. Aşağıdaki swabbing yöntemini kullanın: beş kez venter, beş kez her uyluk, yan ve bacak. Toplam 45 vuruşları bu.
    2. Yavaşça çubukla sırasında ve DNA'ın etkili yakalama sağlamak için vuruş arasında döndürün. 1.5 mL microcentrifuge tüpler içine çubukla ucunu kesiyorum ve ayıklama kadar-20 ° C'de depolayın.
  2. DNA ekstraksiyon ve qPCR tahlil
    1. Genomik DNA bezlerden piyasada bulunan bir DNA ekstraksiyon reaktif 50 µL 30-40 mg 0,5 mm silis boncuk ile ekleyerek ayıklayın. Boncuk boncuk çırpıcı hücre bölücü 2 min için maksimum hızda örnekleri yendi. Boncuk çırpıcı adım 2.000 x g 1 dk. için de örnekler santrifüj kapasitesi.
    2. Örnekleri 10 dk 100 ° C'de kuluçkaya ve soğumasını bekleyin. 5000 x g 3 dk de örnekler santrifüj kapasitesi ve sonra süpernatant bireysel 1,5 mL mikro santrifüj tüpleri için aktarın ve qPCR kadar-20 ° C'de depolayın.
    3. Kantitatif PCR (qPCR) Boyle vd. aşağıdaki kullanın 200418 enfeksiyon yük çözümlenecek. Aşağıdaki değişiklikler kullanın:
      1. DNA ekstraksiyon örnekleri 6:100 Çift Kişilik deiyonize suyla seyreltik. Sığır serum albumin (BSA) 0.7 µL PCR inhibisyon önlemeye yardımcı olmak için her şey için ekleyin. Her örnek içinde singlicate çalıştırın. Her plaka üzerinde bir negatif (şablon yok) ve olumlu bir denetimi seyreltme standartlar bir dizi zoospore (enfeksiyon) yük tahmin etmek için kullanın.

3. aşı

  1. Kültür Bd
    1. Kültür tryptone 16 g, 2 g jelatin hidrolizat ve laktoz (TGHL) 4 g 1 litre deiyonize su ekleyerek suyu hazırlayın. Otoklav (121 ° C 40 dk) ve suyu soğutmak izin verir.
    2. Bu durumda (New South Wales ayrı tut, AbercrombieR-L.booroologensis-2009-LB1, geçiş--dan 11 numaralı izole,) BD izole aşılamak bir TGHL et suyu içinde ve 23 ° c 7 d için büyümek, sonra et suyu kültür TGHL Ağar kaplamalar için transfer.
    3. Levha yapmak için 1 litre deiyonize su ve basınçlı kap (121 ° C 40 dk) tryptone 16 g, 2 g jelatin hidrolizat, laktoz (TGHL), 4 g ve bakteriyolojik agar 10 g ekleyin. Öylesine onlar are karışımı dokunmak serin olduğunda, ancak önce bu katılaşır, TGHL agar 92 mm çap kültür plakaları dökmek bir sınıf II biyolojik güvenlik kabin 1/4-1/3 tam.
    4. Ne zaman agar katılaşmış ve tamamen soğutmalı, Bd sıvı suyu üzerinden 0.5 mL ile her plaka aşılamak ve eşit yayılmış. Yaklaşık 1 h için plaka üzerinde kuru ve ardından plastik parafin film ile plakalarının Bd suyu karışım izin verin. 23 ° c 5-7 d için aşağı plakaları agar yan kuluçkaya.
  2. Kaplamalar, zoospore aşı çözüm için sel
    1. Zoospore motilite her gün önce aşı canlılığı sağlamak için bir ters ışık mikroskobu altında kontrol edin. Zoospore yayın birçok zoospores dışında sporangia yüzme ile yüksek, kültür aşı için hazır olduğunda.
    2. Yaşlı musluk suyu veya yapay göl suyu, 3 mL ile her tabak tabak su dökme ve suya serbest bırakmak zoospores izin vermek 10 dakika oda sıcaklığında kuluçka tarafından sel. Kuluçka dönemi sonra zoospore süspansiyon yeni bir steril konteyner içine dikkatle boşaltmak.
    3. Zoospore toplama bir haemocytometer kullanarak üreticisinin yönergeleri izleyerek tahmin ediyoruz. Zoospore süspansiyon konsantrasyon bilinen sonra 1 x 106 zoospores yaşında musluk suyu ile 3 mL başına bir konsantrasyon için süspansiyon oranında seyreltin.
  3. Hayvanlar aşılamak
    1. Her hayvan inoculum karışımı dökerek 3 mL tarafından bireysel 50 mL kaplarda onun venter19 üzerinde aşılamak. Aşı konteyner üsse doğru toplamak fazla inoculum izin verir. Her hayvan enfeksiyon sağlamak 24 h için bireysel aşılama kapsayıcısında ayrılıp 24 h aşı sonra her birey için dezenfekte terrarium dönmek.
      1. Terraria % 13 birim/birim (v/v) ticari çamaşır suyu çözüm20kullanarak dezenfekte, en az iki kez su ile durulayın, sonra en az 24 saat kurumasını sağlar.
    2. Bdiçin-negatif denetimleri, sahte olduğu gibi 3.2-3.3, aynı yöntemlerle hayvanları aşılamak ama Bdsel-ücretsiz Ağar kaplamalar 5 mL de yaşlı musluk suyu ile bunun yerine Bd Ağar kaplamalar aşılandı.

4. tünel tahlil

  1. Adım 1.3.1 ve Bdeşit sayıda bölümünde açıklandığı gibi chytridiomycosis, klinik belirtileri gösteren hayvanlar ötenazi-negatif kontrol hayvanlar.
  2. Cilt teşrih (dorsal, ventral ve uyluk) her hayvan örnekleri. Deri örnekleri için 2 h % 4 v/v tamponlanmış fosfat formaldehit düzeltmek. Kısa ve tutarlı zaman sabitleme tam olarak düzeltilmesi, doku sağlar ama aynı zamanda etkili ve doğru immünhistokimya boyama için sağlar. O zaman % 80 etanol için kesit için gömme kadar transferi.
  3. Cilt parafin standart yöntemleri21histolojik hazırlık için göm. Kısaca, iletişim kuralı aşağıdaki gibidir:
    1. Etanol kademeli bir dizi dokularda kurutmak ve etanol Ksilen ile temizleyin. Doku parafin balmumu katıştırmak ve her bireyin bir parafin blok için tüm üç deri örnekleri yerleştirin.
  4. Standart histolojik hazırlık21takip bir microtome kullanarak bölümü cilt. Doku seri olarak 5 mikron, bölüm ve hidrofilik cam slaytlara yapıştırmayın. Dört seri histosections slayt başına cilt tipine yerleştirin. Seri deri bölümleri ile birey başına üç slayt yapmak, her slayt yapıştırılmış her doku dört bölümü vardır unutmayın.
  5. Aşağıdaki sırada slaytlar leke:
    1. İlk slayt Hematoksilen Eozin (H & E) counterstaining tarafından takip ile leke. Bu slayt Bd sporangia cilt içinde konumunu görselleştirmek etmektir.
    2. Piyasada bulunan bir tünel tahlil histolojik hazırlık için aşağıdaki ikinci slayt leke ve aşağıda açıklanan üreticisinin yönergelerini izleyin.
      1. İlk olarak, Ksilen yıkama başına 5 min için üç değişikliklerle slaytlar yıkayarak coplin kavanoz doku bölümlerde deparaffinize ve 5 min için % 100 etanol iki değişiklik ile her yıkama izleyin. PBS bir yıkama 5 min için ile % 95 etanol 3 dakika ve sonra % 70 etanol 3 dk. bitirmek için bir yıkama ile izleyin.
      2. Taze seyreltilmiş protein sindiren enzimi (İndinavir K 20 μg/mL PBS içinde seyreltilmiş bir konsantrasyon,) ile doku pretreat ve doğrudan slayda ekleyin. PBS için 2 dk coplin kavanozda iki değişiklik ile 15 dk. yıkama için kuluçkaya olanak sağlar.
      3. Aşırı sıvı dokunun ve %3.0 hidrojen peroksit PBS için oda sıcaklığında 2 dk coplin kavanozda gidermek. İki kez PBS ile beş dakikalığına her yıkama durulama.
      4. Aşırı sıvı ve ardından slayt üzerinde 75 µL/5 cm2 doğrudan doku üzerine denge tamponunun geçerli. Bölümün çevresinde aşırı sıvı dışında 10 s. dokunun için kuluçkaya ve terminal deoksinükleotidil tranferase (TdT) enzim çalışma 55 µL/5 cm2 uygulayın. 37 ° C'de 1 h için oksijen odasında kuluçkaya
      5. Slayt çalışma gücü stop/yıkama arabellek, bir coplin kavanoza koyup TdT kuluçka sonra 15 için kışkırtmak s ve oda sıcaklığında 10 dakika için kuluçkaya. Slayt yıkama başına 1 dk. için PBS üç değişiklikler ile yıkayın. Aşırı sıvı dokunun.
      6. Doku, 65 µL/5 cm2oda sıcaklığına için sıcak anti-digoxigenin eşlenik (rodamine) uygulanır. Oda sıcaklığında 30 dakika oksijen odasında kuluçkaya ve ışığa maruz kalma önlemek. PBS dört değişiklikleri yıkama başına 2 dakika yıkayın. Aşırı sıvı dokunun.
      7. Bitiş tarafından ekleyerek 15 µL 0,5 - 1 µg/mL DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole) bir sayaç leke davranan slayt, slayt montaj orta. Bir kapak notu ile kapak ve tırnak cilası veya kauçuk çimento ile mühür. Slaytlar tahlil ışığa duyarlı olduğu gibi karanlıkta kurumasını sağlar.
    3. Leke üçüncü slayt kullanarak tünel tahlil ve DAPI counterstain lekeli bir pozitif ve negatif kontrol her örnek için kullanır
      Not: Denetim slaytlara 4 histosections ilk 2 pozitif kontrol çoğaltır ve son 2 negatif kontrol çoğaltır.
      1. Adım 4.5.2.2, yerine olumlu denetimler için doku DN arabelleği (30 mM trizma temel, pH 7.2, 4 mM MgCl2, 0,1 mM DDT) ile önceden tedavi ve oda sıcaklığında 5 dakikalığına kuluçkaya izin. O zaman ı DN 0.1ug son bir konsantrasyon için arabellek Dnaz dağıtılması / mL ve slayta doğrudan uygulayın. Oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya.  Sonra slayt dH2O 5 yıkama ile her yıkama için 3 dakika yıkayın. Aşırı sıvı leke. Sonra tünel tahlil 4.5.2.3 bölümünde belirtilen şekilde devam.
      2. Negatif kontrol için terminal deoksinükleotidil tranferase (TdT) enzim örnekleri için (4.5.2.4 bölümünde anlatıldığı gibi) ekleme.
  6. Tünel slaytlar tahlil tamamlanmasından hemen sonra gözlemlemek.
    1. Almak fotoğraf rasgele aralıklarla apoptotik hücreler ortaya çıkarır ve kırmızı ve tüm çekirdek ortaya çıkarır ve mavi DAPI, her iki rodamine leke için filtreleri kullanarak bir floresan mikroskop kullanarak X 200 her cilt bölüm boyunca böylece ilişkin bir bindirme hücre-ebilmek var olmak oluşturmak. En az 100 hücreleri cilt bölüm örnek başına başına fotoğraflandı emin olun. -20 ° C'de karanlık mikroskop kutusunda slaytları depolama
    2. Hücreleri (mavi DAPI lekeli) başına görüntü saymak. En az 100 hücreleri cilt bölüm başına sayılır emin olun. 100 hücreleri ulaşmak için resmin içinde tüm hücreleri saymak. Daha az sonra 100 hücreleri bir görüntü varsa, en az 100 hücreleri cilt bölüm hayvan başına başına ulaşana kadar başka bir görüntü saymak.
    3. Daha sonra tünel pozitif hücrelerinin aynı görüntüleri (kırmızı rodamine lekeli) saymak. Apoptozis ve değil nekroz veya arka plan gösterir, tünel pozitif hücrelerinin (membran yok lysis ile olduğu gibi) Açik Hücre kenarları ile tek hücrelerdir. Bazen hücreleri formu apoptotik organları için küçültmek.
    4. Tünel assay olarak sayılan alanlarda bulun ve H & E histosections lekeli karşılık gelen bölgeler analiz. H & E bölümleri lekeli Bdsağlar Bd enfeksiyon sitelere karşılık geldiğini onaylayın-virüslü siteler tünel tahlil apoptotik hücrelerde sayım sırasında kullanılır.

5. Caspase 3/7 tahlil

  1. Her hayvandan ( Bdmaruz - ve Bd- negatif) ayak parmağı ipuçları toplamak bir kez hafta 3 sonrası aşılama yoluyla haftalık ve iki haftada sonuna kadar bağımsız başına 8 ayak parmakları kadar deneme.
    1. Ayak ucunu ikinci parmağını alev steril makasla kesip bir 1.5 mL microtube yerleştirin ve hemen-80 ° C'de dondurmak
  2. Proteinler donmuş ayak örnekten ayıklayın.
    1. Örnekleri örnek arabelleği (25 mM HEPES pH 7, 5 mM MgCl2) iki paslanmaz çelik boncuklar (3.2 mm) 1,5 mL vidalı kapak microtube ile 100 µL yerleştirin. 1dk boncuk buza 3 min tarafından takip maksimum hızda (içinde aynı boncuk çırpıcı kullanılan adım 1.2.1 olarak) yenerek 4 döngüleri tarafından örnekleri parçalayıcı. Lizis sonra santrifüj kapasitesi 12.000 g x ve 4 ° C 5 dk. toplamak süpernatant assay olarak kullanmak için örnekleri.
  3. Bradford tahlil kullanarak örnek başına protein konsantrasyonu ölçmek.
    1. 384 iyi plaka 10 µL protein özü Bradford reaktifi 10 µL ile karıştırın ve oda sıcaklığında 2 min için kuluçkaya. Her örnek içinde yinelenen gerçekleştirmek, 5 serisi ile birlikte BSA seyreltme standartları katlayın. 595 Absorbans okumak nm bir Absorbans plaka okuyucu üzerinde.
  4. Ayak ucu örnekleri (protein konsantrasyonu en düşük fiyat kimden adım 4.3.1 Bradford tahlil belirlenen veya örnek kurbağalar 3 g toplam ağırlığı ise standarttır) çok küçük ise, alternatif olarak, örnekleri cilt yüzeyi hesaplanıyor tarafından standardize alan fotoğrafları, Bradford tahlil yerine kullanıyor.
    1. Proteinler caspase tahlil için örnek önce ayıklarken, her ayak bir ters ışık mikroskop kullanarak 40 X büyütme, fotoğraf.
    2. Disk görüntüsü oluşturma yazılımı, ayak parmak alan hesaplanıyor tarafından bir bilgisayar kullanarak ayak örneğini analiz. Bunu ayak küçük kenarı etrafında bir çizgi çizerek ve görüntüleme yazılımı tahmini alanını şeklin içinde var. O bölgede hangi 3-dimentional deri örneği yüzey alanı yaklaşık pi (3.14), çarpma (uzunluk x kesit alanı olarak (pi x çapı) bir tüp dış yüzey alanı verir).
  5. Caspase 3/7 tahlil gerçekleştirin.
    1. 384 iyi ışıldama tabak içinde 10 µL piyasada bulunan caspase 3/7 reaktif ve protein ekstresinin 10 µL ekleyin. Her örnek nüsha çalıştırın.
    2. Reaktifleri plaka yavaş yavaş için 15 s. Incubate sallayarak 30 dakika oda sıcaklığında ışıktan uzak plaka karıştırın. Işıksaçan plaka okuyucu kullanarak ışıldama ölçmek.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Tünel tahlil

Vardı daha fazla tünel pozitif hücrelerinin virüslü hayvanlarda hastalık bulaşmamış tek denetim hayvanlarda. Tünel içinde hücreleri farklılık olumlu in situ konumunu enfekte ve hayvan kontrol. Denetim hayvanlarda vardı Tünel boyunca dermal ve epidermal hücre katmanları (bkz: şekil 1A) düşük seviyelerde cilt ama virüslü hayvanlarda tünel pozitif hücrelerinin epidermis (rakam daha sık olumlu eşit dağılımı 1B). (H & E slaytlar lekeli gibi) enfeksiyon sitelerin clumped gibi Bd sporangia dağılmış uyluk ve ventral cilt bölümlerine hiçbiri patolojisi bölümlerde aracılığıyla gözlendi. Tünel pozitif hücrelerinin, daha yoğun ve enfekte hücreleri (şekil 1 c) sitelerine bitişik, ayrıca daha yaygın tünel pozitif hücrelerinin epidermis ve nerede derin epidermal katmanlarında Bd yaşamaktaydı. Bd içinde analiz tüm üç cilt tipleri daha fazla tünel pozitif hücreler vardı ama özellikle yüksek düzeyde uyluk ve venter deride hayvanlar enfekte (12.01 kat daha yüksek (% 95 GA: 4,92 26.30) uyluk deride ve 22.31 kez daha yüksek (% 95 GA 5,25-94.82) içinde Venter cilt) (Şekil 2).

Caspase 3/7 tahlil

Enfeksiyon boyunca caspase etkinliği bir fark vardı. Enfekte Bd hayvanlarda enfeksiyon yoğunluğu olumlu caspase 3/7 etkinlik (şekil 3) ile ilişkili. Ayrıca zaman, sonrası aşılama yoluyla bulaşmış ve bulaşmamış hayvanlar arasında bir fark oldu. Caspase 3/7 etkinlik (%48,36 daha az aktivite virüslü hayvanlarda) ile aşı sonra ilk birkaç hafta içinde azalmış ve daha sonra 7 Bd (şekil 4) enfekte hayvan, ama içinde virüs bulaşmamış sabit kaldı hafta sonuna doğru arttı bireyler.

Figure 1
Şekil 1: son-in situ tahlil (tünel) etiketi Terminal dUTP transferaz-aracılı nick enfekte ve bulaşmamış hayvanlar. a) Bd- Pseudophryne corroboree ve B denetim uyluk cilt bölümünü) Bd+ uyluk cilt in situ tünel tahlil tarafından lekeli P. corroboree bölümünü. Mavi DAPI hücreleri gösteren çekirdekleri boyama ve kırmızı karakteristik apoptosis tarafından neden olduğu DNA fragmantasyonu gösterir rodamine leke. Sarı ok C. C panelinde görülen Bd küme konumunu gösterir) uyluk cilt bölümünü P. corroboree lekeli H & E. H & E bölümü paneline d. seri Boş Bd sporangia oluşan bir küme olan (ok) ve cilt yüzeye yakın birkaç karanlık olgunlaşmamış sporangia. Tüm üç panel için epidermis fotoğrafın üst kısmındadır. B ve C epidermal hücrelerin lekeli rodamine Bd küme aşağıda ve çevresinde yoğunlaşmıştır ve nerede deri hasar gösterir panelleri karşılaştırarak, mikro-vezikül oluşumu epidermal Bazal hücreler arasında gibi görülüyor. 400 X büyütme ve ölçek çubuğu gösterir 0,03 mm. uyarlama Şekil 2 Brannelly ve ark. 2017 Eş J22. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: tünel pozitif oranı (tünel +) Cilt tipine hücreleri. P. corroboree, Cilt tipinde hastalığa yenik hayvanlar gösteren enfekte hayvanlarla başına tünel olumlu apoptotik hücre oranı (n = 9) ve bulaşmamış denetim hayvanlar (n = 10). Hata çubukları bir oran % 95 güven aralıkları göstermek ve * tünel + hücre oranlarını önemli bir artış gösterir. Dorsal cilt enfekte hayvan 14.38 (% 95 GA 3,32-62.24) denetim hayvanlar daha fazla tünel pozitif hücre kez vardı (oran oranı: Z 3,57, p = < 0,01). Uyluk deride enfekte hayvan 12.01 vardı (% 95 GA: 4,92-26.30; Oran oranı: Z 5.46, p = < 0,01) kez kontrol hayvanlar daha fazla tünel pozitif hücre (Chi Pearson'ın kare: χ21 44.30, p = < 0,01). Venter deride enfekte hayvan 22,31 (% 95 GA 5,25-94.82) denetim hayvanlar daha fazla tünel pozitif hücre kez vardı (oran oranı: Z 4.21, p = < 0,01). Şekil 3 Brannelly ve ark. 2017 eş J22. adapte Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: Enfeksiyon yoğunluğu, günlük10(zoospore eşdeğerleri) ve caspase 3/7 arasındaki ilişki, günlük10(Caspase) / Magno16 verreauxii alpina deneme boyunca aşılandı. Enfeksiyon yoğunluğu ve caspase etkinliği arasındaki korelasyon 0.463 ve trend çizgisi denklemi y = (0,229) x + 0.939. Şekil 4 ' ten Brannelly ve arkuyarlanmış. 2017 eş J22. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Resim 4: Caspase 3/7 etkinlik hafta 7 Magno16 verreauxii alpinaher grup için: Bd-enfekte hastalığa yenik hayvanlar (n = 4) ve bulaşmamış denetimleri (n = 8). Caspase etkinliği okuma ışıldama için örnek başına protein konsantrasyonu tarafından kontrol olarak tanımlanır ve 10 tabanına dönüştürülmüş oturum. Caspase aktivite (günlük10 dönüştürülmüş) haftada her grup için. Hata çubukları standart hata gösterir. * virüs bulaşan hayvanların bu hafta bulaşmamış denetimler farklılık gösterir. (Doğrusal karışık etkileri modeli: hafta, F4 11.974, p = < 0,01; hafta * durum, F8 2.139, p = 0.037; = 3. hafta ANOVA, F2,18 5.512, p = 0.014 =), adapte Şekil 5 Brannelly ve ark. 2017 eş J22. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Epidermal Apoptozis ve hücre ölümü ölümcül hastalık chytridiomycosis patoloji veya bir mekanizma hastalık direnci Bd duyarlı türlerin potansiyel bir mekanizma olarak araştırılmalıdır. Biz hücre ölümü epidermis, in situ epidermal hücre ölüm analizi için tünel tahlil ve epidermal hücre ölümü boyunca enfeksiyon ilerlemesini izlemek için caspase 3/7 tahlil değerlendirilmesi için iki yöntem kullanılır. Hücre ölümü ve Apoptozis enfeksiyon yük ile correlated ve hücre ölümü enfeksiyon sitesinde anlamlı olarak daha yüksek bulduk. Erken enfeksiyon, epidermis apoptosis bir azalma olduğunu ama apoptosis virüslü doku içinde patojen yükü arttıkça artar.

Apoptozis hücre içinde çok sayıda farklı yaklaşımlar, her biri faydaları ve kısıtlamaları kullanarak test edilebilir. Apoptozis ve hücre ölümü bulguları onaylamak için birden çok testleri kullanarak eğitim önemlidir. Bu çalışmada, epidermal hücre ölümü ve chytridiomycosis Onlarlakurbağaları apoptosis araştırmak için iki farklı deneyleri keşfettik. İlk, biz trialled tünel tahlil hücre ölüm içinde in situdeğerlendirmek için. Bu test zaman alıcı ve pahalı örnek başına ve floresan sinyal hızlı bir şekilde sona ererkendüşünceleriniz slaytlar hemen okumak gerekir. Bu sınırlamaları rağmen bu in situ deney sonuçlarını daha fazla ana bilgisayar-patojen etkileşim mekanizmaları anlamak için önemlidir. Yerelleştirme ile ilgili bilgi bu yöntemi kullanarak belirlenebilir ve bizim çalışma apoptosis yüksek düzeylerinde mantar enfeksiyonu yerinde ve daha yaygın diğer sitelerdeki mevcuttu. Ayrıca bu tünel tahlil farklı hücre ölümü mekanizmaları apoptosis, nekroz ve pyroptosis17de dahil olmak üzere bir dizi neden DNA hasarı ölçer belirtmek gerekir. İmzalar Apoptozis ile ilişkili hücre ölümü iken (tek hücre membranları ile hala bozulmamış, protokolü hat 4.6.3 görmek gibi sınıflandırma araştırmacı yorumu üzerinde dayanır. Hücre ölümü mekanizması tünel tahlil tarafından belirlenir değildir çünkü, başka bir sigara Apoptozis hücre ölüm yolu artış morbidite enfekte hayvanların, tünel olumlu hücrelerdeki neden olmuş mümkündür. Her tahlil önlemler neler iki desen farklılıkları açıklayabilir fark burada trialled deneyleri.

Caspase 3/7 tahlil enfeksiyon zaman içinde etkisini ölçmek için kullanılabilir. Ancak, kurbağa ayak örnekleri küçük olduğu için analiz ve standardizasyon sınırlı örnek. Bir ortak örnek standardizasyon her ekstresinin toplam protein konsantrasyonu belirlemek için bir yöntemdir. Bradford protein miktar tahlil örnek tüketir gibi küçük özleri için etkili bir yöntem değil. Buna ek olarak, pigmentler kurbağa içinde nano UV-VIS spektrometresi tarafından durdurulmasını emretti analiz cilt bulduk. Küçük örnek boyutları da kuru ağırlık olarak standardizasyon engelledi. Öneririz (az 3 g vücut boyutu bu kurbağalar vardı) ayak ucu örnekleri deneyleri protein konsantrasyonu ve caspase konsantrasyon için izin vermek için çok küçük olduğu gibi fotoğraf, kullanarak ayak deri yüzey alanı tahmin ediliyor. Ayak parmakları fotoğraf çekmek ve bir deri yüzey alanı tahmin kullanarak geleneksel protein konsantrasyonu analizleri etkili olduğunu fark ettik.

Bu çalışmada iki standart teknik sayısal hücre ölümü ve Apoptozis için kullanılan ama kurbağalar ve küçük doku örnekleri için yöntemler adapte. Tünel tahlil için yeterince doku tahlil için kullanılabilir ve farklı cilt Mekanlar karşılaştırma için izin emin olmak için hayvan euthanized. Bu yöntem ötenazi hayvan gerektirmeyeceğini ayak dokuma biyopsi gibi daha küçük doku örnekleri için adapte mümkündür. Hayvan boyutuna bağlı olarak, biyopsi vakit geçirmek için izin verebilir serisi test yaklaşımımız caspase 3/7 tahlil için benzer.

Gelecekte çalışmalar, çünkü hala chytridiomycosis patogenezinde nedensel mekanizmalarının öğrenmek için fazla hücre ölümü ve apoptosis chytridiomycosis enfeksiyon boyunca keşfetmek için ek deneyleri kullanımını öneririz. Bu sonuçlar Apoptozis ve epidermal hücre ölümü Bdpatogenezinde önemli olabilir öneririz; Ancak, daha fazla araştırma apoptosis etkisi hastalık sonuçlar, özellikle enfeksiyon. yenik değil ana bilgisayarları belirlemek için gereklidir

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının bildirin.

Acknowledgments

Biz hayvancılık ve veri toplama ile destekli aşağıdaki insanlar teşekkür: D. Tegtmeier, C. De Jong, J. Hawkes, K. Fossen, S. Percival, M. McWilliams, L. Bertola, M. Stewart, i. Harney ve T. Knavel; ve M. Merces diseksiyonlarının hakkında yardım almak için. Ayrıca M. McFadden, P. Harlow ve L. v. alpinayetiştirmek için Taronga Zoo ve G. Marantelli P. corroboreeyetiştirmek için teşekkür etmek istiyorum. F. Pasmans, A. Martel apoptosis deneyleri, C. ı. Konstantin, A. Kladnik ve R. Webb tünel tahlil, hakkında yardım almak için tavsiye için teşekkür ederiz ve T. Emeto ve W. Weßels için protokol ve caspase 3/7 tahlil için kiti ile yardımcı olur. Bu el yazması ve protokol Brannelly ve ark 2017 Eş J22. adapte

Materials

Name Company Catalog Number Comments
POLARstar Omega BMG Labtech Luminescent plate reader
384 well flat clear bottom plate Corning 3707
384 well low flange white flat bottom plate Corning 3570
Agar Bacteriological (Oxoid) Fisher OXLP0011B
Formal-Fixx 10% Neutral Buffered Formalin Fisher 6764254
Lactose Broth (Oxoid) Fisher OXCM0137B
Sodium Bicarbonate Fisher BP328-500
Tricane-S (MS-222) Fisher NC0872873
Tryptone Fisher BP1421-500
Bovine Serum Albumin Invitrogen 15561020
Sterile rayon swab Medical Wire & Equipment MW-113
ApopTag Red In Situ Apoptosis Detection Kit Merck Millipore S7165
Coomassie Bradford reagent Pierce 23200
Caspase Glo  3/7 Promega G8090
HEPES buffer Sigma Aldrich H0887-20ML
Magnesium chloride Sigma Aldrich 1374248-1G
Gelatin hydrolysate Enzymatic Sigma-Aldrich G0262
PBS (Phosphate Buffered Saline), pH 7.2 (1X) Thermo/Life 20-012-043
Prepman Thermo/Life 4318930
TaqMan Fast Advanced Master Mix ThermoFisher 4444556
Parafilm Bemis PM996
Clorox bleach Clorox
Ethanol, 200 Proof, Molecular Grade Fisher BP2818500
ZEISS Axio Scan florescent miscroscope Carl Zeiss Florescent microscope
3.2mm stainless steel beads BioSpec 11079132SS
Primer ITSI-3 Chytr (5′-CCTTGAT
ATAATACAGTGTGCCATATGTC-3′)		 Taqman Individual design for primers and probe
Primer 5.8S Chytr (5′-TCGGTT
CTCTAGGCAACAGTTT-3′)		 Taqman Individual design for primers and probe
Minor groove binder probe Chytr MGB2(5′-CGAGTCGAAC-3′) Taqman Individual design for primers and probe
Rotor-Gene qPCR Instruments Qiagen qPCR machine
Microcentrifuge tubes 1.5ml Fisher 02-681-372
Cell culture petri plates Nunc 263991
Mini-beadBeater Zircornia-Silicate Beads, 0.5mm BioSpec 11079105Z

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stuart, S. N., et al. Status and trends of amphibian declines and extinctions worldwide. Science. 306 (5702), 1783-1786 (2004).
  2. Skerratt, L. F., et al. Spread of chytridiomycosis has caused the rapid global decline and extinction of frogs. EcoHealth. 4, 125-134 (2007).
  3. Voyles, J., et al. Pathogenesis of chytridiomycosis, a cause of catastrophic amphibian declines. Science. 326 (5952), 582-585 (2009).
  4. Woodhams, D. C., et al. Population trends associated with skin peptide defenses against chytridiomycosis in Australian frogs. Oecologia. 146 (4), 531-540 (2006).
  5. Woodhams, D. C., Voyles, J., Lips, K. R., Carey, C., Rollins-Smith, L. A. Predicted disease susceptibility in a Panamanian amphibian assemblage based on skin peptide defenses. Journal of Wildlife Diseases. 42 (2), 207-218 (2006).
  6. Woodhams, D. C., Rollins-Smith, L. A., Alford, R. A., Simon, M. A., Harris, R. N. Innate immune defenses of amphibian skin: antimicrobial peptides and more. Animal Conservation. 10, 425-428 (2007).
  7. Savage, A. E., Zamudio, K. R. MHC genotypes associate with resistance to a frog-killing fungus. PNAS. 108 (40), 16705-16710 (2011).
  8. Bataille, A., et al. Susceptibility of amphibians to chytridiomycosis is associated with MHC class II conformation. Proceeding of the Royal Society B. 282, 20143127 (2015).
  9. Fites, J. S., Reinert, L. K., Chappell, T. M., Rollins-Smith, L. A. Inhibition of local immune responses by the frog-killing fungus Batrachochytrium dendrobatidis. Infection and Immunity. 82 (11), 4698-4706 (2014).
  10. Brannelly, L. A., Webb, R. J., Skerratt, L. F., Berger, L. Effects of chytridiomycosis on hematopoietic tissue in the spleen, kidney and bone marrow in three diverse amphibian species. Pathogens and Disease. 74 (7), ftw069 (2016).
  11. Brutyn, M., et al. Batrachochytrium dendrobatidis zoospore secretions rapidly disturb intercellular junctions in frog skin. Fungal Genetics and Biology. 49 (10), 830-837 (2012).
  12. Berger, L., Hyatt, A. D., Speare, R., Longcore, J. E. Life cycle stages of the amphibian chytrid Batrachochytrium dendrobatidis. Diseases of Aquatic Organisms. 68 (1), 51-63 (2005).
  13. Pasmans, F., et al. Chytridiomycosis related mortality in a midwife toad (Alytes obstetricans) in Belgium. Vlaams Diergeneeskundig Tijdschrift. 79 (6), 460-462 (2010).
  14. Ellison, A. R., et al. More than skin deep: Functional genomic basis for resistance to amphibian chytridiomycosis. Genome Biology and Evolution. 7 (1), 286-298 (2014).
  15. Fites, J. S., et al. The invasive chytrid fungus of amphibians paralyzes lymphocyte responses. Science. 342 (6156), 366-369 (2013).
  16. Galluzzi, L., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes. Cell Death and Differentiation. 16 (8), 1093-1107 (2009).
  17. Kelly, K. J., Sandoval, R. M., Dunn, K. W., Molitoris, B. A., Dagher, P. C. A novel method to determine specificity and sensitivity of the TUNEL reaction in the quantitation of apoptosis. American Journal of Cell Physiology. 284 (5), C1309-C1318 (2003).
  18. Boyle, D. G., Boyle, D. B., Olsen, V., Morgan, J. A. T., Hyatt, A. D. Rapid quantitative detection of chytridiomycosis (Batrachochytrium dendrobatidis) in amphibian samples using real-time Taqman PCR assay. Diseases of Aquatic Organisms. 60 (2), 141-148 (2004).
  19. Brannelly, L. A., Webb, R., Skerratt, L. F., Berger, L. Amphibians with infectious disease increase their reproductive effort: evidence for the terminal investment hypothesis. Open Biology. 6 (6), 1-24 (2016).
  20. Webb, R., Mendez, D., Berger, L., Speare, R. Additional disinfectants effective against the amphibian chytrid fungus Batrachochytrium dendrobatidis. Diseases of Aquatic Organisms. 74 (1), 13-16 (2007).
  21. Woods, A., Ellis, R. Laboratory Histopathology: A Complete Reference. , Churchill Livingstone: Edinburgh. (1994).
  22. Brannelly, L. A., Roberts, A. A., Skerratt, L. F., Berger, L. Epidermal cell death in frogs with chytridiomycosis. PeerJ. 5, e2925 (2017).

Tags

İmmünoloji ve enfeksiyon yayın 135 Apoptozis Caspase Histoloji patoloji tünel yaban hayatı hastalığı
Terminal transferaz-aracılı dUTP kullanarak Nick uç-etiketleme (tünel) ve Caspase 3/7 deneyleri için ölçü Epidermal hücre ölümünde kurbağalar Chytridiomycosis ile
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Brannelly, L. A., Roberts, A. A.,… More

Brannelly, L. A., Roberts, A. A., Skerratt, L. F., Berger, L. Using Terminal Transferase-mediated dUTP Nick End-labelling (TUNEL) and Caspase 3/7 Assays to Measure Epidermal Cell Death in Frogs with Chytridiomycosis. J. Vis. Exp. (135), e57345, doi:10.3791/57345 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter