Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

שימוש dUTP בתיווך טרנספראז מסוף מבחני סיום ניק-תוויות (TUNEL) ו קספאז 3/7 כדי למדוד מות תאים באפידרמיס של צפרדעים עם צ'יטרידיומיקוסיס

Published: May 16, 2018 doi: 10.3791/57345
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1
1One Health Research Group, College of Public Health, Medical and Veterinary Sciences, James Cook University, 2Department of Biological Sciences, University of Pittsburgh

Summary

אנחנו לכמת מוות תאי אפידרמיס של צפרדעים עם צ'יטרידיומיקוסיס באמצעות שתי שיטות. ראשית, אנו משתמשים dUTP טרנספראז בתיווך מסוף ניק labelling-סוף (TUNEL) בחיי עיר היסטולוגיה כדי לקבוע את ההבדלים בין בעלי חיים נגועים קליניות, נגוע. שנית, אנו מבצעים ניתוח סדרות זמן של אפופטוזיס על זיהום באמצעות ניתוח חלבון קספאז 3/7.

Abstract

דו-חיים חווים אובדן גדול של המגוון הביולוגי באופן גלובלי, והוא אחד הגורמים העיקריים צ'יטרידיומיקוסיס מחלה זיהומית. מחלה זו נגרמת על ידי המחלה פטרייתי כיטרידיומיקוסיס (Bd), אשר מדביק ומפריע האפידרמיס צפרדע; עם זאת, שינויים פתולוגיים לא היה מפורש שאפיינו. אפופטוזיס (מוות תאי מתוכנת) יכול לשמש על ידי פתוגנים לפגיעה ברקמות הפונדקאי, אך ניתן גם מנגנון המארח של ההתנגדות המחלה להסרת הפתוגן. במחקר זה, נוכל לכמת מוות תאי אפידרמיס של בעלי חיים נגועים, נגוע, באמצעות שני מבחני שונות: dUTP טרנספראז בתיווך מסוף ניק סוף-תוויות (TUNEL) ולאחר קספאז 3/7. שימוש הגחוני /, הגבי, ואת רקמת עור הירך ב- TUNEL וזמינותו, נתבונן תא מוות תאים אפידרמיס בחיי עיר של חיות נגועות קלינית והשווה מוות של תאים בעלי נגוע באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. כדי לקבוע כיצד רמות אפופטוזיס האפידרמיס לשנות במהלך זיהום אנחנו להסיר דגימות הבוהן-עצה כל שבועיים על פני תקופה 8 שבועות, והשתמש וזמינותו של קספאז 3/7 עם חלבונים שחולצו לכמת פעילות בתוך הדגימות. אנחנו מכן לתאם פעילות קספאז 3/7 עם עומס זיהום. וזמינותו TUNEL שימושית לוקליזציה של התא המוות בחיי עיר, אבל אינטנסיבית יקר והשעה עבור דגימה. וזמינותו קספאז 3/7 יעיל עבור מדגמים גדולים וזמן הקורס ניסויים. עם זאת, מכיוון צפרדע הבוהן עצה ביופסיות קטנות יש תמצית מוגבלת זמין התקינה מדגם באמצעות שיטות כימות חלבון, כמו וזמינותו ברדפורד. לכן, אנו מציעים הערכת שטח העור בעזרת צילומי ניתוח ביופסיות הבוהן כדי להימנע מצריכת תמציות במהלך דגימה תקינה.

Introduction

דו-חיים כיום חווים אחד ההפסדים הגדולים של המגוון הביולוגי העולמי של כל חוליות taxa1. הגורם העיקרי ירידות אלה הוא צ'יטרידיומיקוסיס מחלת העור קטלנית, הנגרמת על ידי המחלה פטרייתי כיטרידיומיקוסיס, Bd2. הפתוגן באופן שטחי מדביק האפידרמיס, אשר יכול להוביל לשיבוש בתפקוד העור וכתוצאה מכך איבוד חמור אלקטרוליט, דום לב ומוות3. פוטנציאל מארח המערכת החיסונית מנגנונים שונים נגד Bd הם כיום נחקר, פפטידים מיקרוביאלית4,5, עורית חיידקי הפלורה6, תא החיסון רצפטורים7,8, ו לימפוציטים פעילות9,10 עם זאת, מחקרים מעטים לחקור אם המוות אפופטוזיס ותא באפידרמיס הוא מנגנון החיסון כנגד הפתוגן הקטלני הזה.

מוות של תאים, או באמצעות אפופטוזיס (מוות תאי מתוכנת) או נמק (מוות unprogrammed), האפידרמיס ייתכן פתולוגיה של זיהום Bd . מחקרים קודמים מרמז כי Bd זיהום עלול לגרום אפופטוזיס בגלל שיבוש צמתים תאיים נוצרת כאשר העור explants נחשפים zoospore supernatants במבחנה11. בנוסף, שינויים ניווניים עוריות Bd-צפרדעים נגוע שנצפו באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים12,13. ניתוחים Transcriptomic מצביעים על כך אפופטוזיס ישנן upregulated העור הנגוע14, דו-חיים splenocytes עוברים אפופטוזיס כאשר הם נחשפים supernatants במבחנה Bd 15. למרות הנפח גדל והולך של הראיות המצביע Bd יכול לגרום אפופטוזיס ומנחה תא מוות במבחנה, מחקרים ויוו לחקור או לכמת אפופטוזיס חסרים מנגנונים דרך ההתקדמות של זיהום. יתר על כן, לא ידוע אם המחשב המארח משתמש אפופטוזיס כמו אסטרטגיה הגנתית המערכת החיסונית להילחם Bd זיהום, או אם אפופטוזיס הוא פתולוגיה של מחלות.

במחקר זה, כיוונו כדי לזהות מוות תאי אפידרמיס של אפופטוזיס חיות נגועות ויוו באמצעות שתי שיטות: שיטת קספאז 3/7, dUTP טרנספראז בתיווך מסוף ניק labelling-סוף (TUNEL) בחיי עיר וזמינותו. כמו כל assay מגלה היבטים שונים של מוות תא16, יחד שיטות אלה מספקים הבנה מלאה של המנגנונים המעורבים מוות תאי ולהבטיח מדד מדויק של האפקט. וזמינותו קספאז 3/7 מכמת את הפעילות של caspases אפקטור 3 ו- 7, המאפשר כימות של שני המסלולים אפופטוזיס פנימי ולא חיצוני. לעומת זאת, וזמינותו TUNEL מזהה פיצול הדנ א, אשר נגרמת על ידי מנגנוני מוות התא כולל אפופטוזיס, נמק, pyroptosis17. אנו משתמשים וזמינותו TUNEL לחקור את המיקום של מוות של תאים בתוך האפידרמיס של חיות הן נגועות קלינית והן נגוע באמצעות שלושה מקטעים עור שונים: את dorsum, ונטר את ירכו של Pseudophryne corroboree. שיטה זו מזהה האתר האנטומי של מוות של תאים, כמו גם הבחנה מיקומו בתוך שכבות עוריות מסוימות. ואז נשתמש וזמינותו קספאז 3/7 לערוך סדרת זמן כימות אפופטוזיס לאורך כל זיהום 8 שבועות ליטוריה verreauxii alpina. אקח דגימות קצה הבוהן כל שבועיים החיות באותה ואנו מסוגלים לתאם הפתוגן זיהום עומס עם פעילות קספאז 3/7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ג'יימס קוק האוניברסיטה אישרה אתיקה בעלי יישומים A1875 corroboree פ ו A1897 ו A2171 עבור ל' נ' alpina.

1. גידול בעלי חיים וניטור

  1. בית חיות בנפרד, סביבה מתאימה המינים, עם מים המתאים, האכלה, ניקוי לוח הזמנים. בדוק חיות מדי יום.
    1. לשימוש למבוגרים מהאינדיבידואלים בסכנת הכחדה חמורה Pseudophryne corroboree (TUNEL וזמינותו, סעיף 4) ותרם מאוימים ליטוריה verreauxii אלפינה (עבור קספאז 3/7 וזמינותו, סעיף 5), מן בשבי הרבייה מתקנים. לשמור על החיות ב 15-18 מעלות צלזיוס, באיזוב חצץ המצע, ערפל אותם מדי יום עם מים אוסמוזה הפוכה ו להאכיל 3 פעמים בשבוע עם בטן טעון צרצרים.
  2. לאסוף נתונים על כל פעם בודדים שבועי. דגימה האנשים Bd כפי שמתואר בשלב 2.1. שוקל כל חיה להג 0.1 neared באמצעות סרגל, ולמדוד את האף שלהם לפרוק אורך (SVL) הקרוב 0.01 מ מ באמצעות חיוג callipers.
  3. לאחר חיסון (כמתואר בסעיף 3), לבדוק חיות מדי יום עבור סימנים קליניים של זיהום (העור לא סדיר סלאו, inappetence, הרגל אדמומיות, עייפות או רפלקס שקמה בעצמה אחרי שמפילים מושהית) בהתאם הנחיות אתיקה בעלי חיים. המתת חסד חיות אם קיימים סימנים קליניים ותחלואה.
    1. המתת חסד עם מנת יתר של tricaine methanesulfonate (MS222) (0.1% w/v MS222 את ה-pH 6-7 עם סודיום ביקרבונט במים מהברז בגילאי). שמור חיות MS222 10 דקות אחרי כל תנועה נפסקת, הם מציגים אין תגובה לגירויים.

2. בדיקות זיהום Bd

  1. מקימה עבור Bd
    1. דגימה כל חיה עם מקלון חדש זהורית סטרילי (אחת ספוגית לכל חיה). השתמש בשיטה swabbing הבאה: חמש פעמים על ונטר את, חמש פעמים על כל הירך בצד, האיבר. זה סך של 45 קווים.
    2. סובב בעדינות את הספוגית במהלך, בין קווים כדי להבטיח לכידת יעיל של ה-DNA. שבור את הקצה ספוגית שלו לתוך צינורות microcentrifuge 1.5 mL ולאחסן ב-20 ° C עד מיצוי.
  2. מיצוי הדנ א ואת וזמינותו qPCR
    1. לחלץ הדנ א מ הושארו על-ידי הוספת µL 50 של ריאגנט מיצוי DNA זמינים מסחרית עם 30-40 מ ג של חרוזים סיליקה 0.5 מ מ. חרוז היכו את הדגימות disrupter תא מקצף חרוז במהירות מקסימלית למשך 2 דקות. בעקבות הצעד מקצף חרוז, centrifuge את הדגימות-g x 2,000 עבור 1 דקות.
    2. דגירה בדגימות ב 100 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, להתקרר. Centrifuge את הדגימות ב g x 5,000 למשך 3 דקות, להעביר את תגובת שיקוע צינורות בודדים mL 1.5 מיקרו צנטריפוגה ואז לאחסן ב-20 ° C עד qPCR.
    3. השתמש PCR כמותי (qPCR) בעקבות בויל. et al. 200418 כדי לנתח את הזיהום לטעון. השתמש את השינויים הבאים:
      1. לדלל DNA שאיבת דגימות 6:100 עם מים יונים כפול. להוסיף 0.7 µL של שור אלבומין (BSA) כל טוב כדי למנוע עיכוב PCR. להפעיל כל מדגם singlicate. על כל צלחת להשתמש שלילי (ללא תבנית) פקד ופקד חיובית עם סדרה של תקנים דילול כדי לאמוד טען zoospore (זיהום).

3. חיסון

  1. תרבות Bd
    1. להכין מרק תרבות על-ידי הוספת 16 גר' טריפטון, 2 גר' ג'לטין hydrolysate, ו- 4g של לקטוז (TGHL) 1 ליטר של מים יונים. אוטוקלב (121 מעלות צלזיוס למשך 40 דקות) ולאפשר מרק להתקרר.
    2. לחסן Bd בידוד (במקרה זה, מבודד מדרום ווילס ולבודד, AbercrombieR-L.booroologensis-2009-LB1, מעבר מספר 11) לא TGHL, גדלים עבור d 7 ב 23 ° C, ואז להעביר את התרבות מרק פלטות אגר TGHL.
    3. כדי להפוך את הצלחות, להוסיף 16 גר' טריפטון, 2 גר' ג'לטין hydrolysate, 4 g של לקטוז (TGHL) ו- 10 גרם של אגר בקטריולוגית 1 ליטר של מים יונים autoclave (121 מעלות צלזיוס למשך 40 דקות). ברגע שהתערובת מגניב מספיק לגעת, אבל לפני זה עפור, שופכים אגר TGHL לתוך 92 מ מ קוטר תרבות צלחות ולכן הם מלא 1/4 עד 1/3, ב Class II בטיחות ביולוגית בארון.
    4. כאשר התחזק אגר, מקורר לחלוטין, לחסן כל צלחת עם 0.5 מ ל Bd של מרק נוזלי, נמרח בקלות. לאפשר Bd תערובת מרק ומניחים על צלחת לשעה בערך, ואז לאטום צלחות עם סרט פרפין פלסטיק. דגירה פלטות אגר בצד למטה ב 23 מעלות צלזיוס במשך 5-7 d.
  2. המבול לוחות עבור פתרון חיסון zoospore
    1. בדוק zoospore תנועתיות תחת מיקרוסקופ אור הפוך כדי להבטיח יכולת הקיום מדי יום לפני חיסון. כאשר zoospore שחרור הוא גבוה, עם הרבה zoospores שחייה בחוץ אחידות המנבגים, התרבות הוא מוכן לקבל חיסון.
    2. להציף כל צלחת עם 3 מ"ל של בגילאי מי ברז או מים בריכה מלאכותית, על ידי מזיגת המים המשקולת המקננת בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות לאפשר את zoospores לשחרר לתוך המים. לאחר תקופת דגירה, decant את המתלים zoospore לתוך מיכל סטרילי חדש.
    3. מעריכים zoospore ריכוז ההוראות של היצרן משתמש של haemocytometer. ברגע הריכוז של המתלה zoospore ידוע, לדלל את המתלים כדי ריכוז עונה 1 פרק 10 zoospores6 לכל 3 מ עם מים מהברז בגילאי.
  3. לחסן חיות
    1. לחסן כל חיה על ידי שפיכת 3 מ"ל של תערובת inoculum מעל שלה ונטר19 במיכלים נפרדים 50 מ. לאפשר inoculum עודף לאסוף לתוך הבסיס של המיכל חיסון. להשאיר כל חיה במיכל חיסון בודדים עבור 24 שעות להבטיח זיהום, ולחזור לאחר חיסון 24 שעות, כל אדם לצפרדע מחוטא.
      1. לחטא ראנאריו באמצעות פתרון20אקונומיקה מסחרי נפח/אמצעי האחסון (v/v) 13%, לפחות פעמיים לשטוף עם מים, ואז אפשר להתייבש במשך לא פחות מ 24 שעות.
    2. עבור Bd-שלילי פקדים, מיצגי לחסן את החיות באותן שיטות כמו 3.2-3.3, אבל להציף Bd-פלטות אגר חינם עם 5 מ ל מי ברז בגילאי במקום של Bd מחוסן פלטות אגר.

4. TUNEL Assay

  1. המתת חסד חיות כי הם מראה סימנים קליניים של צ'יטרידיומיקוסיס, כפי שמתואר בשלב 1.3.1 ולאחר מספר שווה של Bd-שלילי חיות בקרת.
  2. לנתח את העור (הגבי, הגחוני / ולאחר הירך) דגימות כל בעל חיים. לתקן את דגימות עור עבור 2 h בפורמלין פוספט buffered וי/v 4%. קצר, עקבי תיקון זמן מאפשר הרקמות יש לתקן באופן מלא, אלא גם מאפשר עבור צביעת אימונוהיסטוכימיה יעיל ומדויק. ואז להעביר 80% אתנול עד הטבעה על חלוקתה.
  3. להטביע העור פרפין להכנה היסטולוגית בעקבות בשיטות הרגילות21. בקצרה, הפרוטוקול הוא כדלקמן:
    1. מייבשים רקמות בסדרה מדורגת של אתנול, ונקה האתנול עם קסילן. להטביע את הרקמה פרפין, ולמקם כל העור שלוש דוגמאות עבור כל אדם בבלוק פרפין אחד.
  4. סעיף העור באמצעות של מיקרוטום בעקבות הכנה היסטולוגית תקן21. אזור הרקמה באופן סדרתי ב 5 מיקרומטר, ואז יצויינו שקופיות זכוכית הידרופילית. במקום ארבעה טורי histosections לפי סוג העור לכל שקופית. להפוך את שלוש שקופיות הפרט עם העור טורי מקטעים, זכור כי כל שקופית יש ארבעה מקטעים של כל רקמה מוצמדת.
  5. מכתים את השקופיות לפי הסדר הבא:
    1. כתם השקופית הראשונה עם hematoxylin ואחריו אאוזין counterstaining (H & E). בשקופית זו היא להמחיש את המיקום של Bd המנבגים בתוך העור.
    2. כתם השקופית השניה לאחר assay TUNEL זמינים מסחרית של הכנה היסטולוגית, בצע את הוראות היצרן, שיפורטו להלן.
      1. ראשית, deparaffinize הסעיפים רקמות בתוך צנצנת coplin ע י שטיפת השקופיות עם שלושה שינויים של קסילן למשך 5 דקות לכל שטיפת ופעל עם שני שינויים של אתנול 100% עבור 5 דקות כל כביסה. בצע עם שטיפה אחת של אתנול 95% למשך 3 דקות ולאחר מכן 70% אתנול במשך 3 דקות הסיום עם שטיפה אחת ל- PBS במשך 5 דקות.
      2. Pretreat הרקמה עם חלבון טרי מדולל לעכל אנזים (proteinase K בריכוז של 20 μg/mL מדולל ב- PBS), וכן להוסיף ישירות לשקופית. מאפשרים תקופת דגירה של 15 דקות לשטוף עם שני שינויים ל- PBS בצנצנת coplin למשך 2 דקות.
      3. הקש את הנוזל העודף, להרוות ב- 3.0% חמצן ב- PBS בצנצנת coplin למשך 2 דקות אווריריות. לשטוף פעמיים עם PBS, חמש דקות כל כביסה.
      4. הקש את הנוזל העודף, ולאחר מכן להחיל µL/5 ס מ 752 המאגר שיווי משקל ישירות על גבי הרקמה בשקופית. תקופת דגירה של ברז ס' 10 את הנוזל העודף סביב הסעיף ולהחיל µL/5 ס מ 552 של עובד אנזים tranferase (TdT) deoxynucleotidyl מסוף. דגירה בתוך תא humidified עבור h 1-37 מעלות צלזיוס.
      5. לאחר הדגירה TdT, שמים את השקופית בצנצנת coplin עובד כוח עצירה/שטיפת מאגר, להתסיס 15 s דגירה 10 דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף את השקופית הכוללת שלושה שינויים ל- PBS עבור 1 דקות לכל לשטוף. הקש את הנוזל העודף.
      6. להחיל אנטי-digoxigenin המספר המשלים (rhodamine) אשר יש כבר חימם את טמפרטורת החדר לרקמות, µL/5 ס מ 652. דגירה בתוך תא humidified למשך 30 דקות אווריריות ולהימנע חשיפה לאור. לשטוף עם ארבעה שינויים ל- PBS למשך 2 דקות לכל לשטוף. הקש את הנוזל העודף.
      7. סיום על-ידי הוספת 15 µL של 0.5 - 1 µg/mL. דאפי (4', 6-diamidino-2-phenylindole) במדיום הרכבה שקופית לשקופית, אשר משמש כתם מונה. ואז מכסים עם מכסה, חותם עם לק או דבק גומי. לאפשר שקופיות להתייבש בחושך כמו וזמינותו הוא רגיש אור.
    3. שקופית הכתם השלישית היא מוכתמת שימוש TUNEL assay ו- counterstain דאפי, אך שימוש בפקד חיוביים ושליליים עבור כל דגימה.
      הערה: של histosections 4 בשקופיות שליטה,-2 הראשון משכפל בקרה חיובית והם את ה 2 האחרונים משכפל שליטה שלילי.
      1. עבור הפקדים חיובית, במקום שלב 4.5.2.2, מראש מתייחסים הרקמה באמצעות מאגר DN (30 מ מ trizma הבסיס, pH 7.2, 4 מ מ MgCl2, 0.1 מ מ DDT) ותנו דגירה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. ואז לפזר Dnase אני ב DN מאגר עבור ריכוז הסופי של 0.1ug / mL, ולהחיל אותו ישירות לשקופית. תקופת דגירה של 15 דקות בטמפרטורת החדר.  לאחר מכן, לשטוף השקופית עם שטיפת 5 של dH2O במשך 3 דקות כל כביסה. למחוק את הנוזל העודף. מכן לחדש TUNEL assay בהמלצת בסעיף 4.5.2.3.
      2. עבור הפקדים שלילי, לא להוסיף את האנזים tranferase (TdT) deoxynucleotidyl מסוף הדגימות (כמתואר בסעיף 4.5.2.4).
  6. להתבונן TUNEL שקופיות מיד עם השלמת וזמינותו.
    1. קח תמונות אקראיות מרווחי לאורך כל מקטע העור 200 X באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, באמצעות מסננים עבור שני rhodamine הכתם, אשר חושף את התאים אפופטוטיים להיפגע ומופיע ואדום, דאפי אשר חושף את כל הגרעינים ומופיע כחול, כך כיסוי של ניתן להפיק תאים. ודא לפחות מאה תאים מצטלמים לכל סעיף העור לדגימה. לאחסן השקופיות בתוך קופסה מיקרוסקופ כהה ב-20 ° C.
    2. לספור תאים (דאפי blue מוכתמת) לכל תמונה. להבטיח לפחות מאה תאים ייספרו לכל סעיף העור. כדי להגיע תאים 100, לספור את כל התאים בתוך התמונה. אם פחות מ-100 תאים נמצאים בתמונה אחת, נחשב תמונה אחרת עד לפחות מאה תאים נגישים לכל סעיף העור לכל חיה.
    3. בשלב הבא, לספור את מספר התאים חיובי TUNEL אותן תמונות (אדום rhodamine צבעונית). תאים חיוביים TUNEL, אשר מציינות אפופטוזיס ולא נמק או רקע, הם תאים בודדים עם קצוות התא ברורה (ממברנות שלמים עם אין פירוק). לפעמים התאים לכווץ לגופים אפופטוטיים להיפגע טופס.
    4. לאתר את האזורים במניין וזמינותו TUNEL ולנתח את האזורים המתאימים על H & E צבעונית histosections. לאשר H & E סעיפים מוכתמים יתאימו לאתרים של Bd זיהום, דבר המבטיח Bd-אתרים נגועים משמשים בעת ספירת בתאים אפופטוטיים להיפגע וזמינותו TUNEL.

5. קספאז 3/7 Assay

  1. לאסוף טיפים הבוהן של כל בעל חיים ( Bd- חשוף והן Bd- שלילי) פעם בשבוע דרך חיסון פוסט בשבוע 3 ולאחר כל שבועיים עד סיום הניסוי, עד 8 אצבעות לכל אדם.
    1. חותכים את קצה הבוהן פרק השני במספריים מחוטא-להבה, ואת מקום microtube 1.5 mL להקפיא מיידית ב- 80 ° c
  2. תמצית חלבונים מהדגימה הבוהן קפוא.
    1. מקום דגימות µL 100 דוגמת המאגר (25 מ מ HEPES pH 7, 5 מ מ MgCl2) עם שני חרוזים פלדת אל-חלד (3.2 מ מ) ב microtube בורג שווי 1.5 מ. Lyse דוגמאות על ידי 4 מחזורים של חרוז 1 דקות פועם במהירות המרבית (מקצף חרוז זהה כשלב בשימוש 1.2.1) ואחריו 3 דקות על קרח. לאחר פירוק, צנטריפוגה דגימות-12,000 x g ו- 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דק לאסוף תגובת שיקוע להשתמש בוזמינותו.
  3. לכמת ריכוז חלבון לכל דגימה באמצעות וזמינותו ברדפורד.
    1. בצלחת טוב 384, לערבב את µL 10 של חלבון תמצית עם 10 µL של ריאגנט ברדפורד, דגירה למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר. לבצע כל דגימה של כפילויות, יחד עם סדרה של 5 מקפלים BSA דילול סטנדרטים. לקרוא את ספיגת-595 nm בקורא צלחת ספיגת.
  4. לחלופין, אם הדגימות קצה הבוהן קטנים מדי (ריכוז חלבון הוא ליד תקן הנמוך כפי שנקבע מן וזמינותו ברדפורד בשלב 4.3.1, או אם הצפרדעים זה הם שנדגמו נמצאים מתחת לגיל 3 g המשקל הכולל), לתקנן דוגמאות על ידי הערכת פני השטח של העור אזור באמצעות תצלומים, במקום וזמינותו ברדפורד.
    1. לפני חילוץ החלבונים מדגם עבור קספאז וזמינותו, לצלם כל אצבע ברגל-40 X הגדלה באמצעות מיקרוסקופ אור הפוך.
    2. לנתח את הדגימה הבוהן באמצעות מחשב דימות תוכנה, על ידי הערכת שטח של הבוהן. עושים זאת על ידי ציור קו סביב קצה הבוהן הקליפ, ויש אזור הדמיה של הערכת תוכנה בתוך הצורה. ואז להכפיל את האזור ב- pi (3.14), אשר משוער את פני השטח של דגימת עור תלת-מימדי (כמו אורך x שטח חתך הרוחב (pi x קוטר) נותן את פני השטח החיצוניים של שפופרת).
  5. לבצע את הבדיקה קספאז 3/7.
    1. צלחת 384 לומינסנציה היטב, להוסיף 10 µL של ריאגנט זמינים מסחרית קספאז 3/7 ו- 10 µL של תמצית חלבון. תריץ את דגימת כל דולר.
    2. מערבבים ריאגנטים ע י ניעור את הצלחת לאט עבור Incubate ס' 15 את הצלחת מן האור למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. למדוד לומינסנציה שימוש בקורא צלחת זורח.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

TUNEL Assay

היו יותר TUNEL חיובי תאים בעלי חיים נגועים הרבה את החיות נגוע השליטה. המיקום בבאתרו של TUNEL חיובי תאים שונה ב נגוע ושליטה חיות. בקרת חיות, היה ריפודי כתופיים של TUNEL חיובי תאים ברחבי את עורי וכן העור שכבות ברמות נמוכות (ראה איור 1 א'), אבל את החיות נגוע, התאים חיובי TUNEL היו תכופים יותר האפידרמיס (איור 1B). האתרים של זיהום (כפי שנמדדו על H & E צבעונית שקופיות) נצפו בכבדות כמו Bd המנבגים מפוזרים בין הירך ומקטעים העור הגחון עם אף בסעיפים dorsum. בזמן TUNEL תאים חיוביים יותר מרוכזת בשעה ולא ישירות בסמוך לאתרים של תאים נגועים (איור 1C), היה גם נפוצה יותר תאים חיוביים TUNEL על האפידרמיס, בשכבות עוריות שהיו עמוקים יותר מאשר איפה Bd התגורר. ב- Bd נגוע חיות היו יותר TUNEL תאים חיוביים בכל סוגי העור שלוש מנותח, אבל רמה גבוהה במיוחד של העור הירך ואת ונטר (12.01 פעמים גבוה יותר (95% CI: 4.92-26.30) עור הירך ואת 22.31 פעמים גבוה יותר (95% CI 5.25-94.82) ב- ונטר עור) (איור 2).

Assay קספאז 3/7

במהלך זיהום היה הבדל בפעילות קספאז. בבעלי חיים Bd נגוע, עוצמת הזיהום היה בקורלציה חיובית עם פעילות קספאז 3/7 (איור 3). היה שם גם הבדל בין בעלי חיים נגועים, נגוע בזמן, פוסט חיסון. פעילות קספאז 3/7 ירד בתוך בשבועות הראשונים לאחר חיסון (עם 48.36% פחות פעילות חיות נגועות), והגדילה ואז לקראת סוף שבוע 7 (איור 4) ב- Bd נגוע חיות, אבל נשאר קבוע בנגוע יחידים.

Figure 1
איור 1: ניק dUTP טרנספראז בתיווך מסוף סיום-תוויות (TUNEL) ב- assay באתרו של נגוע, uninfected חיות. A) Bd- במקטע עור הירך בקרת של Pseudophryne corroboree, ו- B) Bd+ ירך עור חלק corroboree פ מוכתמת בחיי עיר TUNEL וזמינותו. הכחול הוא דאפי מכתים הגרעינים אנלוגיים של התאים, האדום הכתם rhodamine, אשר מציינת פיצול DNA כאופייני הנגרמת על ידי אפופטוזיס. החץ הצהוב מציין את המיקום של האשכול Bd ראיתי בלוח ג ג) corroboree פ סעיף של עור הירך מוכתם H & א המקטע H & E הוא הטורית בלוח ב' יש מקבץ של אחידות המנבגים Bd ריק (חץ), אחידות המנבגים כמה כהה לא בוגר, סמוך לפני השטח של העור. עבור כל שלושת לוחות האפידרמיס הוא בחלק העליון של התמונה. השוואה בין לוחות B ו- C מראה rhodamine צבעונית תאים אפידרמיס מרוכזים סביב ומתחת האשכול של Bd שבו העור נזק הוא גלוי, כגון היווצרות מיקרו-שלפוחית בין תאים באפידרמיס הבזליים. 400 X הגדלה וסרגל קנה מידה מציין 0.03 נקודות מ מ. Adapted איור 2 עמית J. ואח 2017 Brannelly22. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: שיעור TUNEL חיובי (TUNEL +) תאים לפי סוג העור. חלקם של TUNEL בתאים אפופטוטיים להיפגע חיובית לפי סוג העור ב פ corroboree, עם חיות נגועות המציין כי נכנע למחלה חיות (n = 9) ובעלי חיים נגוע השליטה (n = 10). קווי שגיאה מצביעים על 95% מרווחי הביטחון של שיעור ו * מצביע על עלייה משמעותית בפרופורציות תא TUNEL +. בעור הגבי, חיות נגועות היה 14.38 (95% CI 3:32 אם כן-62.24) פעמים יותר TUNEL תאים חיוביים יותר חיות בקרת (יחס הסיכויים: Z = 3.57, p < 0.01). בעור הירך, חיות נגועות היה 12.01 (95% CI: 4.92-26.30; יחס הסיכויים: Z = 5.46, p < 0.01) פעמים יותר TUNEL תאים חיוביים יותר חיות בקרת (פירסון Chi בריבוע: χ21 = 44.30, p < 0.01). בעור ונטר, חיות נגועות היה 22.31 (95% CI 5.25-94.82) פעמים יותר TUNEL תאים חיוביים יותר חיות בקרת (יחס הסיכויים: Z = 4.21, p < 0.01). חיבור מקורי איור 3 Brannelly et al. 2017 עמית J22. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: המתאם בין עוצמת הזיהום, יומן10(zoospore מקבילות) קספאז 3/7, יומן10(קספאז) של מחוסן ליטוריה verreauxii alpina במהלך הניסוי. הקשר בין עוצמת הזיהום לבין פעילות קספאז 0.463, ויש קו המגמה משוואה של y = x (0.229) + 0.939. חיבור מקורי איור 4 ב- Brannelly et al. 2017 עמית J22. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: פעילות קספאז 3/7 עד שבוע 7 עבור כל קבוצה של ליטוריה verreauxii alpina: Bd-נגוע חיות נכנעה למחלה (n = 4) ו- uninfected פקדים (n = 8). פעילות קספאז המוגדר כ הפריה חוץ גופית קריאה בשליטת עבור ריכוז חלבון לדגימה ולאחר מכן נכנס בבסיס 10 טרנספורמציה. הפעילות קספאז (יומן10 טרנספורמציה) עבור כל קבוצה בשבוע. קווי שגיאה מצביעים על שגיאה סטנדרטית. * מציין כי בעלי החיים הנגוע נבדל הפקדים נגוע באותו השבוע. (מודל ליניארי אפקטים מעורבת: השבוע, F4 = 11.974, p < 0.01; השבוע * מצב, F8 = 2.139, p = 0.037; שבוע 3 ANOVA, F2,18 = 5.512, p = 0.014), ממאמרו של איור 5 Brannelly. ואח 2017 עמית J22. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

חרשנו אפופטוזיס עוריות ומוות תא כמנגנון פוטנציאלי של פתולוגיות של צ'יטרידיומיקוסיס מחלה קטלנית או מנגנון של ההתנגדות המחלה במינים רגישים Bd . השתמשנו שתי שיטות הערכת מוות תאי האפידרמיס, TUNEL assay בחיי עיר ניתוח מוות תאים באפידרמיס ולאחר assay קספאז 3/7 עבור ניטור מוות תאי אפידרמיס לאורך כל ההתקדמות של זיהום. מצאנו כי מוות של תאים, אפופטוזיס נמצאים בקורלציה עם עומס זיהום, מוות של תאים גבוה משמעותית באתר של זיהום. בזיהום מוקדם, יש ירידה אפופטוזיס האפידרמיס, אבל אפופטוזיס גדל ככל הפתוגן עליות העומס בתוך הרקמה הנגועה.

אפופטוזיס בתאים יכול להיבדק באמצעות גישות שונות רבות, כל אחת עם יתרונות ומגבלות. חשוב ללמוד אפופטוזיס ומוות תא באמצעות מבחני מרובים על מנת לאשר את הממצאים. במחקר זה, חרשנו שני מבחני שונות כדי לחקור את מות תאים באפידרמיס, אפופטוזיס צפרדעים עם צ'יטרידיומיקוסיס. קודם, אנחנו trialled TUNEL הנועד להעריך לתא המוות בתוך באתרו. בדיקה זו היא זמן רב ויקר עבור דגימה, שקופיות צריך להיקרא מיד כמו האות פלורסנט דוהה במהירות. למרות מגבלות אלה, התוצאות של הניסוי הזה בחיי עיר חשובים נוספים הבנת המנגנונים של פתוגן-פונדקאי אינטראקציות. מידע על לוקליזציה יכול להיקבע באמצעות שיטה זו, במחקר שלנו אפופטוזיס היה נוכח רמות גבוהות באתר של זיהום פטרייתי, יותר diffusely באתרים אחרים. בנוסף יש לציין כי וזמינותו TUNEL מודד נזק לדנ א, אשר יכול להיגרם על ידי מספר מנגנוני מוות תאים שונים לרבות אפופטוזיס, נמק, pyroptosis17. אמנם יש חתימות של מוות של תאים הקשורים אפופטוזיס (כגון תאים בודדים עם ממברנות רואה עדיין בשלמותו, פרוטוקול קו 4.6.3, הסיווג מתבסס על הפרשנות של החוקר. המנגנון של מוות של תאים לא נקבע על פי וזמינותו TUNEL, זה אפשרי כי אחר שאינו-אפופטוזיס תא מוות מסלול שגרם העלייה ב- TUNEL תאים חיוביים על תחלואה של חיות נגועות. ההבדל באילו אמצעים assay כל מסביר דפוס הבדלים השני מבחני trialled כאן.

וזמינותו קספאז 3/7 ניתן לכמת את השפעת זיהום בזמן. עם זאת, כמו צפרדע הבוהן דגימות הם קטנים, יש דוגמת מוגבלת עבור ניתוח ותקינה. שיטה נפוצה התקינה הדגימה היא לקבוע ריכוז החלבון הכולל של כל תמצית. כפי שיטת כימות ברדפורד צורכת הדגימה, זה לא שיטה יעילה עבור תמציות קטן. בנוסף, מצאנו כי הפיגמנטים בתוך הצפרדע העור מנעה ניתוח על ידי nano UV-Vis מסות. גודל מדגם קטן גם מנעו סטנדרטיזציה לפי משקל יבש. אנו מציעים להערכת עור פני השטח של הבוהן באמצעות הצילום, כמו הדגימות קצה הבוהן (צפרדעים אלו היו פחות מ 3 g בגודל גוף) היו קטנים מדי כדי לאפשר מבחני ריכוז חלבון וגם קספאז ריכוז. מצאנו כי מצלמים אצבעות הרגליים ושימוש הערכה שטח העור יעיל כמו ניתוחים ריכוז חלבון מסורתיים.

במחקר זה, אנחנו משמשת שתי טכניקות סטנדרטיים לכימות מוות של תאים אפופטוזיס, אבל הותאם שיטות דו-חיים, דגימות רקמה קטנה. עבור וזמינותו TUNEL, אנחנו מורדמים החיה כדי להבטיח מספיק רקמה היה זמין עבור וזמינותו, איפשרה ההשוואה של מיקומים עור שונים. זה אפשרי להתאים בשיטה זו כדי דגימות רקמה קטנים יותר, כגון ביופסיה webbing הבוהן, אשר לא ידרוש המתת חסד של החיה. בהתאם לגודל של החיה, ביופסיות עלולה לאפשר זמן סדרת מבחן הדומה הגישה שלנו עבור וזמינותו קספאז 3/7.

בעתיד מחקרים, אנו מציעים את השימוש מבחני נוספים עבור חקר מות תאים ואפופטוזיס במהלך זיהום צ'יטרידיומיקוסיס כי יש עוד הרבה ללמוד על מנגנוני פתוגנזה צ'יטרידיומיקוסיס סיבתי. תוצאות אלו מראים כי אפופטוזיס ועל מוות תאי אפידרמיס עשוי להיות חשוב בפתוגנזה של Bd; עם זאת, דרוש מחקר נוסף כדי לקבוע את ההשפעה של אפופטוזיס על תוצאות המחלה, במיוחד אצל מארחים לא להיכנע זיהום.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

אנו מודים האנשים הבאים שסייעו עם גידול ואיסוף נתונים: Tegtmeier ד, ג דה יונג, ג'יי הוקס, ק' Fossen, פרסיבל ס, מ McWilliams, ל' Bertola, סטיוארט מ, הרני ש ו ט Knavel; Merces מ לקבלת סיוע עם ניתוח. כן נרצה להודות מ מקפאדן, עמ' הארלו Taronga גן החיות לגידול של ל' נ' alpinaואת ג'י Marantelli לגידול של corroboree פ. אנו מודים Pasmans פ, א מרטל לקבלת ייעוץ אודות מבחני אפופטוזיס, קונסטנטין ג, Kladnik א ו ר ווב לקבלת סיוע עם TUNEL assay, ולעזור Emeto ט ו וו Weßels עבור פרוטוקול, ערכת assay קספאז 3/7. זה כתב היד ופרוטוקול מותאמת מ Brannelly ואח 2017 J עמית22.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
POLARstar Omega BMG Labtech Luminescent plate reader
384 well flat clear bottom plate Corning 3707
384 well low flange white flat bottom plate Corning 3570
Agar Bacteriological (Oxoid) Fisher OXLP0011B
Formal-Fixx 10% Neutral Buffered Formalin Fisher 6764254
Lactose Broth (Oxoid) Fisher OXCM0137B
Sodium Bicarbonate Fisher BP328-500
Tricane-S (MS-222) Fisher NC0872873
Tryptone Fisher BP1421-500
Bovine Serum Albumin Invitrogen 15561020
Sterile rayon swab Medical Wire & Equipment MW-113
ApopTag Red In Situ Apoptosis Detection Kit Merck Millipore S7165
Coomassie Bradford reagent Pierce 23200
Caspase Glo  3/7 Promega G8090
HEPES buffer Sigma Aldrich H0887-20ML
Magnesium chloride Sigma Aldrich 1374248-1G
Gelatin hydrolysate Enzymatic Sigma-Aldrich G0262
PBS (Phosphate Buffered Saline), pH 7.2 (1X) Thermo/Life 20-012-043
Prepman Thermo/Life 4318930
TaqMan Fast Advanced Master Mix ThermoFisher 4444556
Parafilm Bemis PM996
Clorox bleach Clorox
Ethanol, 200 Proof, Molecular Grade Fisher BP2818500
ZEISS Axio Scan florescent miscroscope Carl Zeiss Florescent microscope
3.2mm stainless steel beads BioSpec 11079132SS
Primer ITSI-3 Chytr (5′-CCTTGAT
ATAATACAGTGTGCCATATGTC-3′)		 Taqman Individual design for primers and probe
Primer 5.8S Chytr (5′-TCGGTT
CTCTAGGCAACAGTTT-3′)		 Taqman Individual design for primers and probe
Minor groove binder probe Chytr MGB2(5′-CGAGTCGAAC-3′) Taqman Individual design for primers and probe
Rotor-Gene qPCR Instruments Qiagen qPCR machine
Microcentrifuge tubes 1.5ml Fisher 02-681-372
Cell culture petri plates Nunc 263991
Mini-beadBeater Zircornia-Silicate Beads, 0.5mm BioSpec 11079105Z

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stuart, S. N., et al. Status and trends of amphibian declines and extinctions worldwide. Science. 306 (5702), 1783-1786 (2004).
  2. Skerratt, L. F., et al. Spread of chytridiomycosis has caused the rapid global decline and extinction of frogs. EcoHealth. 4, 125-134 (2007).
  3. Voyles, J., et al. Pathogenesis of chytridiomycosis, a cause of catastrophic amphibian declines. Science. 326 (5952), 582-585 (2009).
  4. Woodhams, D. C., et al. Population trends associated with skin peptide defenses against chytridiomycosis in Australian frogs. Oecologia. 146 (4), 531-540 (2006).
  5. Woodhams, D. C., Voyles, J., Lips, K. R., Carey, C., Rollins-Smith, L. A. Predicted disease susceptibility in a Panamanian amphibian assemblage based on skin peptide defenses. Journal of Wildlife Diseases. 42 (2), 207-218 (2006).
  6. Woodhams, D. C., Rollins-Smith, L. A., Alford, R. A., Simon, M. A., Harris, R. N. Innate immune defenses of amphibian skin: antimicrobial peptides and more. Animal Conservation. 10, 425-428 (2007).
  7. Savage, A. E., Zamudio, K. R. MHC genotypes associate with resistance to a frog-killing fungus. PNAS. 108 (40), 16705-16710 (2011).
  8. Bataille, A., et al. Susceptibility of amphibians to chytridiomycosis is associated with MHC class II conformation. Proceeding of the Royal Society B. 282, 20143127 (2015).
  9. Fites, J. S., Reinert, L. K., Chappell, T. M., Rollins-Smith, L. A. Inhibition of local immune responses by the frog-killing fungus Batrachochytrium dendrobatidis. Infection and Immunity. 82 (11), 4698-4706 (2014).
  10. Brannelly, L. A., Webb, R. J., Skerratt, L. F., Berger, L. Effects of chytridiomycosis on hematopoietic tissue in the spleen, kidney and bone marrow in three diverse amphibian species. Pathogens and Disease. 74 (7), ftw069 (2016).
  11. Brutyn, M., et al. Batrachochytrium dendrobatidis zoospore secretions rapidly disturb intercellular junctions in frog skin. Fungal Genetics and Biology. 49 (10), 830-837 (2012).
  12. Berger, L., Hyatt, A. D., Speare, R., Longcore, J. E. Life cycle stages of the amphibian chytrid Batrachochytrium dendrobatidis. Diseases of Aquatic Organisms. 68 (1), 51-63 (2005).
  13. Pasmans, F., et al. Chytridiomycosis related mortality in a midwife toad (Alytes obstetricans) in Belgium. Vlaams Diergeneeskundig Tijdschrift. 79 (6), 460-462 (2010).
  14. Ellison, A. R., et al. More than skin deep: Functional genomic basis for resistance to amphibian chytridiomycosis. Genome Biology and Evolution. 7 (1), 286-298 (2014).
  15. Fites, J. S., et al. The invasive chytrid fungus of amphibians paralyzes lymphocyte responses. Science. 342 (6156), 366-369 (2013).
  16. Galluzzi, L., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes. Cell Death and Differentiation. 16 (8), 1093-1107 (2009).
  17. Kelly, K. J., Sandoval, R. M., Dunn, K. W., Molitoris, B. A., Dagher, P. C. A novel method to determine specificity and sensitivity of the TUNEL reaction in the quantitation of apoptosis. American Journal of Cell Physiology. 284 (5), C1309-C1318 (2003).
  18. Boyle, D. G., Boyle, D. B., Olsen, V., Morgan, J. A. T., Hyatt, A. D. Rapid quantitative detection of chytridiomycosis (Batrachochytrium dendrobatidis) in amphibian samples using real-time Taqman PCR assay. Diseases of Aquatic Organisms. 60 (2), 141-148 (2004).
  19. Brannelly, L. A., Webb, R., Skerratt, L. F., Berger, L. Amphibians with infectious disease increase their reproductive effort: evidence for the terminal investment hypothesis. Open Biology. 6 (6), 1-24 (2016).
  20. Webb, R., Mendez, D., Berger, L., Speare, R. Additional disinfectants effective against the amphibian chytrid fungus Batrachochytrium dendrobatidis. Diseases of Aquatic Organisms. 74 (1), 13-16 (2007).
  21. Woods, A., Ellis, R. Laboratory Histopathology: A Complete Reference. , Churchill Livingstone: Edinburgh. (1994).
  22. Brannelly, L. A., Roberts, A. A., Skerratt, L. F., Berger, L. Epidermal cell death in frogs with chytridiomycosis. PeerJ. 5, e2925 (2017).

Tags

אימונולוגיה זיהום גיליון 135 אפופטוזיס קספאז היסטולוגיה פתולוגיה TUNEL המחלה חיות הבר
שימוש dUTP בתיווך טרנספראז מסוף מבחני סיום ניק-תוויות (TUNEL) ו קספאז 3/7 כדי למדוד מות תאים באפידרמיס של צפרדעים עם צ'יטרידיומיקוסיס
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Brannelly, L. A., Roberts, A. A.,… More

Brannelly, L. A., Roberts, A. A., Skerratt, L. F., Berger, L. Using Terminal Transferase-mediated dUTP Nick End-labelling (TUNEL) and Caspase 3/7 Assays to Measure Epidermal Cell Death in Frogs with Chytridiomycosis. J. Vis. Exp. (135), e57345, doi:10.3791/57345 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter