Summary
Quantifichiamo la morte delle cellule epidermiche in rane con chytridiomycosis utilizzando due metodi. In primo luogo, utilizziamo terminal transferasi-mediata dUTP nick end-labelling (TUNEL) in situ istologia per determinare le differenze tra animali clinicamente infetti e non infetti. In secondo luogo, conduciamo un'analisi di serie temporali di apoptosi sopra infezione utilizzando un'analisi della proteina di caspase 3/7.
Abstract
Gli anfibi stanno vivendo una grande perdita di biodiversità a livello mondiale e una delle cause principali è la malattia infettiva chytridiomycosis. Questa malattia è causata dall'agente patogeno fungoso Batrachochytrium chytrid (Bd), che infetta e sconvolge epidermide rana; Tuttavia, le mutazioni patologiche non sono state caratterizzate in modo esplicito. Apoptosi (morte programmata delle cellule) possono essere utilizzato dagli agenti patogeni per danneggiare il tessuto ospite, ma possono anche essere un meccanismo di host di resistenza alle malattie per la rimozione dell'agente patogeno. In questo studio, quantifichiamo la morte delle cellule epidermiche di animali infetti e non infetti, utilizzando due diversi dosaggi: terminal transferasi-mediata dUTP nick end-labelling (TUNEL) e caspase 3/7. Utilizzando ventrale, dorsale e il tessuto della pelle della coscia nell'analisi di TUNEL, osserviamo delle cellule morte le cellule epidermiche di in situ di animali clinicamente infetti e confrontare la morte delle cellule con animali non infetti utilizzando la microscopia a fluorescenza. Al fine di determinare come livelli di apoptosi nell'epidermide cambiano nel corso dell'infezione abbiamo rimuovere campioni punta ogni due settimane per un periodo di 8 settimane e utilizzare un'analisi di caspase 3/7 con proteine estratte per quantificare l'attività all'interno dei campioni. Abbiamo quindi correlare l'attività della caspasi 3/7 con carico di infezione. L'analisi di TUNEL è utile per la localizzazione delle cellule morte in situ, ma è costoso e tempo intensivo per campione. L'analisi di caspase 3/7 è efficiente per campioni di grandi dimensioni e tempo esperimenti del corso. Tuttavia, perché Rana punta punta le biopsie sono piccole c'è estratto limitato disponibile per la standardizzazione di esempio tramite metodi di quantificazione della proteina, ad esempio, il saggio di Bradford. Pertanto, vi consigliamo di stimare la superficie della pelle attraverso analisi fotografica delle biopsie di punta per evitare di consumare gli estratti durante la normalizzazione del campione.
Introduction
Gli anfibi uno stanno vivendo le più grandi perdite di biodiversità globale di qualsiasi vertebrato taxa1. Delle principali cause di questi declini è il chytridiomycosis malattia mortale della pelle, causata dall'agente patogeno fungoso Batrachochytrium chytrid, Bd2. L'agente patogeno infetta superficialmente l'epidermide, che può causare la rottura della funzione della pelle con conseguente perdita dell'elettrolito grave, arresto cardiaco e morte3. Vari meccanismi immuni potenziale ospite contro Bd sono attualmente allo studio, quali peptidi antimicrobici4,5, flora batterica cutanea6, delle cellule immuni recettori7,8, e del linfocita attività9,10. Tuttavia, pochi studi esplorare se epidermica morte delle cellule e l'apoptosi è un meccanismo immune contro questo agente patogeno mortale.
Morte cellulare, sia attraverso l'apoptosi (morte programmata delle cellule) o necrosi (morte non programmata), nell'epidermide può essere una patologia dell'infezione di Bd . La ricerca precedente suggerisce che l'infezione Bd può indurre apoptosi perché la rottura delle giunzioni intracellulari è osservata quando pelle espianti sono esposti a zoospore surnatanti in vitro11. Inoltre, i cambiamenti degeneranti epidermici in Bd-rane infetti sono osservate usando microscopia elettronica12,13. Analisi trascrittomica indicano che le vie di apoptosi sono sovraregolati in pelle infetta14e anfibio splenocytes apoptosi quando sono esposti a Bd surnatanti in vitro15. Nonostante il volume crescente di prove che suggeriscono che il Bd può indurre apoptosi e host delle cellule morte in vitro, in vivo studi che Esplora o misurare il apoptosis meccanismi attraverso la progressione dell'infezione sono carenti. Inoltre, non è noto se l'host utilizza apoptosi come una strategia difensiva sistema immunitaria per combattere infezione Bd , o se l'apoptosi è una patologia della malattia.
In questo studio, abbiamo mirato a rilevare la morte delle cellule epidermiche e apoptosi in animali infettati in vivo utilizzando due metodi: l'analisi della proteina di caspase 3/7 e terminal transferasi-mediata dUTP nick in situ il saggio fine-etichettatura (TUNEL). Come ogni dosaggio rileva diversi aspetti di cellule morte16, insieme questi metodi forniscono una piena comprensione dei meccanismi coinvolti nella morte delle cellule e garantiscono una misura accurata dell'effetto. L'analisi di caspase 3/7 quantifica l'attività delle caspasi effettrici 3 e 7, che consente la quantificazione di entrambe le vie intrinseca ed estrinseca apoptosi. Al contrario, l'analisi di TUNEL rileva la frammentazione del DNA, che è causata da meccanismi di morte cellulare tra cui apoptosi, necrosi e pyroptosis17. Utilizziamo l'analisi di TUNEL per indagare la posizione della morte delle cellule all'interno dell'epidermide degli animali sia clinicamente infetti e non infetti usando le tre sezioni differenti della pelle: dorsum, il venter e la coscia di Pseudophryne corroboree. Questo metodo identifica il sito anatomico di morte delle cellule, nonché a distinguere la sua posizione all'interno di specifici strati epidermici. Usiamo quindi l'analisi di caspase 3/7 per condurre una quantificazione di serie tempo di apoptosi nel corso di un'infezione di 8 settimane in Litoria verreauxii alpina. Prendiamo la punta punta campioni ogni due settimane dagli stessi animali e sono in grado di correlare patogeno infezione carico con l'attività della caspasi 3/7.
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Protocol
James Cook University approvato etica animale nelle applicazioni A1875 per p. corroboree e A1897 e A2171 per L. v. alpina.
1. allevamento e monitoraggio
- Casa animali individualmente, in un ambiente appropriato per le specie, con un appropriato dell'acqua, alimentazione e pulizia programmata. Controllare gli animali ogni giorno.
- Utilizzare gli individui adulti del estinzione Pseudophryne corroboree (per l'analisi di TUNEL, sezione 4) e la minacciata Litoria verreauxii alpina (per l'analisi di Caspase 3/7, sezione 5), donato dalla cattività allevament. Mantenere gli animali a 15-18 ° C, su un muschio e substrato di ghiaia, foschia loro tutti i giorni con acqua di osmosi inversa e mangimi 3 volte settimanale con intestino caricato grilli.
- Raccogliere dati su una volta ogni individuale settimanale. Tampone, gli individui per Bd come descritto nel punto 2.1. Pesare ogni animale si avvicinò g 0,1 utilizzando una scala e misurare il loro muso per sfogare la lunghezza (SVL) alla più vicina 0,01 mm utilizzando pinze dial.
- Dopo l'inoculazione (come descritto nella sezione 3), controllare gli animali ogni giorno per segni clinici di infezione (slough pelle irregolare, inappetenza, arrossamento gamba, letargia o riflesso di raddrizzamento in ritardo) in conformità alle linee guida etica animale. Eutanasia animali se morbilità e segni clinici sono presenti.
- Eutanasia con un sovradosaggio di Tricaina metansolfonato (MS222) (0,1% p/v MS222 a pH 6-7 con bicarbonato di sodio in acqua di rubinetto invecchiata). Mantenere gli animali in MS222 per 10 min dopo tutto movimento cessa e non visualizzano nessuna risposta agli stimoli.
2. test per l'infezione di Bd
- Tamponi per Bd
- Il tampone ogni animale con un nuovo tampone sterile rayon (un tampone per animale). Utilizzare il seguente metodo tampone: cinque volte sul venter, cinque volte su ogni coscia, lato e degli arti. Si tratta di un totale di 45 colpi.
- Ruotare delicatamente il tampone durante e tra i tratti per garantire efficace acquisizione di DNA. Rompere la punta del tampone in provette per microcentrifuga da 1,5 mL e conservare a-20 ° C fino all'estrazione.
- Estrazione del DNA e l'analisi qPCR
- Estrazione del DNA genomico dai tamponi aggiungendo 50 µ l di un reagente di estrazione DNA commercialmente disponibile con 30-40 mg di grani di silice di 0,5 mm. Tallone battere i campioni in un distruttore cellulare battitore di tallone alla massima velocità per 2 min. Dopo la fase di battitore di perlina, centrifugare i campioni a 2.000 x g per 1 min.
- Incubare i campioni a 100 ° C per 10 min e lasciare per raffreddare. Centrifugare i campioni a 5.000 x g per 3 minuti, quindi trasferire il surnatante in singoli 1,5 mL Centrifuga micro provette e conservare a-20 ° C fino qPCR.
- Utilizzare la PCR quantitativa (qPCR) seguendo Boyle et al. 200418 per analizzare il carico di infezione. Utilizzare le seguenti modifiche:
- Diluire 6:100 campioni di DNA estrazione con acqua deionizzata doppia. Aggiungere 0,7 µ l di albumina di siero bovino (BSA) ad ogni pozzetto per aiutare a prevenire l'inibizione PCR. Eseguire ogni esempio in singlicate. Su ogni piatto utilizzare un controllo negativo (nessun modello) e un controllo positivo con una serie di diluizione standard per stimare il carico di zoospore (infezione).
3. inoculazione
- Cultura Bd
- Preparare brodo di cultura con l'aggiunta di 16 g di tryptone, 2 g di idrolizzato di gelatina e 4 g di lattosio (TGHL) a 1 L di acqua deionizzata. Autoclave (121 ° C per 40 min) e consentire il brodo raffreddare.
- Inoculare Bd isolato (in questo caso, isolato dal numero di New South Wales isolato, AbercrombieR-L.booroologensis-2009-LB1, passaggio 11) in un brodo TGHL e crescere per 7 d a 23 ° C, quindi trasferire il brodo di coltura per piastre di agar TGHL.
- Per rendere piatti, aggiungere 16 g di tryptone, 2 g di idrolizzato di gelatina, 4 g di lattosio (TGHL) e 10 g di agar batteriologico a 1 L di acqua deionizzata e autoclave (121 ° C per 40 min). Una volta che la miscela è abbastanza fredda al tatto, ma prima si solidifica, versare l'agar TGHL in 92 mm piastre di coltura di diametro quindi sono 1/4 a 1/3 pieno, in una cappa di sicurezza biologica classe II.
- Quando l'agar ha solidificato e raffreddato completamente, ogni inoculare con 0,5 mL di Bd dal brodo liquido e distribuire uniformemente. Lasciare Bd brodo miscela a secco sulla piastra per circa 1 h e poi sigillare piastre con pellicola di plastica paraffina. Incubare lato agar piastre giù a 23 ° C per 5-7 gg.
- Piastre di inondazione per soluzione di inoculazione di zoospore
- Verifica della motilità zoospore sotto un microscopio ottico invertito per garantire redditività al giorno prima dell'inoculazione. Quando rilascio di zoospore è alta, con molti zoospore piscina all'esterno di sporangi, la cultura è pronta per l'inoculo.
- Inondare ogni piatto con 3 mL di invecchiato acqua di rubinetto o acqua di laghetto artificiale, versando l'acqua nella piastra e incubare a temperatura ambiente per 10 min consentire le zoospore di rilasciare nell'acqua. Dopo il periodo di incubazione, decantare la sospensione di zoospore in un nuovo contenitore sterile.
- Stimare la concentrazione di zoospore seguendo le istruzioni del produttore utilizzando un emocitometro. Una volta nota la concentrazione della sospensione zoospore, diluire la sospensione ad una concentrazione di 1 x 106 zoospore / 3 mL con acqua di rubinetto invecchiata.
- Inoculare gli animali
- Inoculare ciascun animale versando 3 mL di miscela di inoculo sopra suo venter19 in contenitori singoli 50 mL. Consentire l'inoculo in eccesso raccogliere nella base del contenitore inoculazione. Lasciare ogni animale nel contenitore di inoculazione individuali per 24 h garantire l'infezione e dopo l'inoculazione di 24h, tornare ogni individuo un terrario disinfettato.
- Disinfettare i terrari con un 13% volume/volume (v/v) candeggina commerciale soluzione20, sciacquare almeno due volte con acqua, poi lasciare per asciugare per non meno di 24 ore.
- Per Bd-controlli negativi, finto inoculare gli animali utilizzando gli stessi metodi impiegati negli 3.2-3.3, ma piena di Bd-piastre di agar gratuito con 5 mL di acqua di rubinetto invecchiata invece di Bd inoculate piastre di agar.
- Inoculare ciascun animale versando 3 mL di miscela di inoculo sopra suo venter19 in contenitori singoli 50 mL. Consentire l'inoculo in eccesso raccogliere nella base del contenitore inoculazione. Lasciare ogni animale nel contenitore di inoculazione individuali per 24 h garantire l'infezione e dopo l'inoculazione di 24h, tornare ogni individuo un terrario disinfettato.
4. TUNEL Assay
- Eutanasia di animali che presentano segni clinici di chytridiomycosis, come descritto nel passaggio 1.3.1 e un numero uguale di Bd-negativo animali di controllo.
- Sezionare la pelle (dorsali, ventrali e la coscia) campioni da ogni animale. Difficoltà i campioni di pelle per 2 h in formaldeide al 4% v/v tamponata con fosfato. Il breve e coerente tempo di fissaggio permette i tessuti essere completamente risolto, ma permette anche per la colorazione immunoistochimica efficace e precisa. Poi il trasferimento al 80% di etanolo fino all'incorporamento per il sezionamento.
- Incorporare pelle in cera di paraffina per preparazione istologica seguendo metodi standard21. In breve, il protocollo è il seguente:
- Disidratare i tessuti in una serie graduata di etanolo e deselezionare l'etanolo con xilene. Incorporare il tessuto in paraffina e posizionare tutti i campioni di pelle tre per ogni individuo in blocco una paraffina.
- Pelle di sezione utilizzando un microtomo seguendo la preparazione istologica standard21. Sezione del tessuto in serie a 5 µm e quindi apporre su vetrini idrofila. Inserire quattro histosections seriali per ogni tipo di pelle per ogni diapositiva. Fare tre diapositive per individuo con sezioni seriali della pelle, ricordate che ogni diapositiva ha quattro sezioni di ogni tessuto apposta.
- Colorare i vetrini nell'ordine seguente:
- Macchia la prima diapositiva con ematossilina seguita da eosina (H & E) una colorazione di contrasto. Questa diapositiva è quello di visualizzare la posizione di sporangi Bd all'interno della pelle.
- Macchia la seconda diapositiva seguendo un saggio TUNEL commercialmente disponibile per preparazione istologica e seguire le istruzioni del produttore, che sono descritte di seguito.
- In primo luogo, deparaffinizzare le sezioni di tessuto in una vaschetta di Coplin lavando le diapositive con tre cambi di xilene per 5 min per lavaggio e seguire con due cambi di etanolo al 100% per 5 min ogni lavaggio. Seguire con un lavaggio di etanolo al 95% per 3 minuti e poi etanolo al 70% per un minimo di 3 finitura con un lavaggio di PBS per 5 min.
- Pretrattare il tessuto con fresco diluita proteina digestione enzimatica (proteinasi K a una concentrazione di 20 μg/mL diluito in PBS) e aggiungere direttamente alla diapositiva. Lasciare per incubare per 15 minuti lavare con due cambi di PBS in una vaschetta di Coplin per 2 minuti ciascuno.
- Toccare il liquido in eccesso e dissetare in 3,0% perossido di idrogeno in PBS in una vaschetta di Coplin per 2 min a temperatura ambiente. Sciacquare due volte con PBS, per cinque minuti ogni lavaggio.
- Toccare il liquido in eccesso, quindi applicare 75 µ l/5 cm2 del buffer equilibrio direttamente sul tessuto sulla diapositiva. Incubare per 10 s. Picchiettare per eliminare il liquido in eccesso intorno alla sezione e applicare 55 µ l/5 cm2 di lavoro terminal deoxynucleotidyl trasferasi (TdT) enzima. Incubare in una camera umidificata per 1h a 37 ° C.
- Dopo l'incubazione di TdT, mettere il vetrino in un Coplin di tampone di lavaggio/fermata forza lavoro, agitare per 15 s e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Lavare il vetrino con tre cambi di PBS per 1 min a lavaggio. Toccare il liquido in eccesso.
- Applicare coniugato anti-digossigenina (rodamina) che è stato riscaldato a temperatura ambiente al tessuto, 65 µ l/5 cm2. Incubare in una camera umidificata per 30 min a temperatura ambiente ed evitare l'esposizione alla luce. Lavare con quattro cambi di PBS per 2 min a lavaggio. Toccare il liquido in eccesso.
- Finitura di aggiunta 15 µ l di 0,5 - 1 µ g/mL DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole) nel mezzo di montaggio diapositiva alla diapositiva, che agisce come una macchia di contatore. Poi coprire con un vetrino coprioggetto e sigillare con smalto o cemento di gomma. Lasciare i vetrini asciugare al buio come il test è sensibile alla luce.
- Macchia la terza diapositiva è colorato utilizzando il saggio TUNEL e colorante di contrasto DAPI, ma utilizzare come controllo positivo e negativo per ogni campione.
Nota: Del 4 histosections sui vetrini di controllo, i primi 2 sono repliche di controllo positivo e le ultime 2 sono repliche di controllo negativo.- Per i controlli positivi, invece passo 4.5.2.2, pre-trattare il tessuto con buffer di DN (30mm trizma base, pH 7,2, 4mM MgCl2, 0,1 mM DDT) e lasciare Incubare a temperatura ambiente per 5 minuti. Poi si dissolvono dnasi I nel DN tampone per una concentrazione finale di 0.1ug / mL e applicarlo direttamente alla diapositiva. Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. Quindi, lavare il vetrino con lavaggio 5 di dH2O per 3 minuti ogni lavaggio. Asciugare il liquido in eccesso. Quindi riprendere saggio TUNEL, come indicato nella sezione 4.5.2.3.
- Per i controlli negativi, non aggiungere l'enzima trasferasi (TdT) terminal deoxynucleotidyl a quei campioni (come descritto nella sezione 4.5.2.4).
- Osservare il TUNEL diapositive subito dopo il completamento del test.
- Prendere foto a caso intervalli lungo ogni sezione di pelle a 200 X utilizzando un microscopio a fluorescenza, utilizzando filtri per entrambi la macchia rodamina, che rivela cellule apoptotiche e appare rosso e DAPI che rivela tutti i nuclei e appare di colore blu, così che una sovrapposizione di le cellule possono essere generate. Garantire almeno 100 cellule vengono fotografate per ogni sezione di pelle per campione. Conservare i vetrini in una scatola di microscopio scuro a-20 ° C.
- Contare le celle (DAPI blu macchiato) per ogni immagine. Garantire almeno 100 celle vengono conteggiate per ogni sezione della pelle. Per raggiungere 100 celle, contare tutte le celle all'interno dell'immagine. Se meno di 100 cellule è presenti in una sola immagine, contare un'altra immagine fino al raggiungono di almeno 100 cellule per ogni sezione di pelle per animale.
- Quindi, contare il numero di cellule positive TUNEL nelle stesse immagini (rosso rodamina macchiato). Le cellule positive di TUNEL, che indicano l'apoptosi e necrosi non o sfondo, sono singole cellule con bordi di cellule chiare (le membrane sono intatte con nessun Lisi). A volte le cellule si restringono per formare corpi apoptotici.
- Individuare le aree conteggiate nel saggio TUNEL e analizzare le regioni corrispondenti sulla H & E tinto histosections. Confermare che la H & E sezioni colorate corrispondono ai siti di infezione di Bd , che assicura Bd-siti infetti vengono utilizzati quando si contano le cellule apoptotiche in analisi di TUNEL.
5. l'analisi di Caspase 3/7
- Raccogliere suggerimenti punta da ogni animale ( Bd- esposti e Bd- negativo) una volta settimanalmente attraverso Inoculazione post settimana 3 e ogni due settimane fino alla fine dell'esperimento, fino a 8 punte per ogni individuo.
- Tagliare la punta del dito del piede presso la seconda falange con forbici sterilizzate a fiamma e posto in una microprovetta 1,5 mL e congelare immediatamente a-80 ° C.
- Estrarre proteine dal campione congelato punta.
- Posizionare il campione in 100 µ l di sample buffer (25mm HEPES pH compreso tra 7, 5 mM MgCl2) con due perline in acciaio inox (3,2 mm) in una microprovetta di 1,5 mL tappo a vite. Lyse campioni da 4 cicli di 1 min perlina battendo alla massima velocità (nel battitore stesso tallone come usato nel passo 1.2.1) seguita da 3 min sul ghiaccio. Dopo la lisi, centrifugare i campioni a 12.000 x g e a 4 ° C per 5 min surnatante raccogliere da utilizzare nell'analisi.
- Quantificare la concentrazione di proteina per campione usando l'analisi di Bradford.
- In un piatto ben 384, mescolare 10 µ l di proteina Estratto con 10 µ l di reagente di Bradford e incubare per 2 min a temperatura ambiente. Eseguire ogni campione in duplicato, insieme a una serie di 5 piega standard di diluizione di BSA. Leggere l'assorbanza a 595 nm su un lettore di piastra di assorbanza.
- In alternativa, se i campioni di punta di punta sono troppo piccoli (la concentrazione nella proteina è vicino il minimo standard come determinato dall'analisi di Bradford nel passaggio 4.3.1, o se le rane che vengono campionate sono meno di 3 g di peso totale), standardizzare campioni stimando la superficie della pelle area utilizzando fotografie, invece l'analisi di Bradford.
- Prima di estrarre le proteine del campione per l'analisi di caspase, fotografare ogni dito a 40 ingrandimenti utilizzando un microscopio ottico invertito.
- Analizzare il campione di punta utilizzando un computer imaging software, stimando la zona della punta. Farlo di disegnare una linea attorno al bordo della tacchetta e hanno l'area di stima software imaging all'interno della forma. Quindi moltiplicare quella zona per pi greco (3.14), che si avvicinerà la superficie del campione della pelle 3-dimensionali (come lunghezza x area della sezione trasversale (pi x diametro) dà la superficie esterna di un tubo).
- Eseguire l'analisi di caspase 3/7.
- In un piatto di luminescenza ben 384, aggiungere 10 µ l di reagente commercialmente disponibili caspase 3/7 e 10 µ l di estratto proteico. Eseguire ogni esempio in triplice copia.
- Mescolare i reagenti agitando la piastra lentamente per 15 s. Incubare la piastra lontano dalla luce a temperatura ambiente per 30 minuti. Luminescenza di misura utilizzando un lettore di piastra luminescente.
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Representative Results
Analisi di TUNEL
C'erano altre cellule positive di TUNEL negli animali infetti che negli animali di controllo non infetto. La posizione in situ del TUNEL positivo differivano per cellule infetti e animali di controllo. Negli animali di controllo, c'era una distribuzione uniforme del TUNEL positivo cellule in tutto il derma e dell'epidermide della pelle strati a bassi livelli (Vedi Figura 1A), ma negli animali infetti, le cellule positive di TUNEL erano più frequenti nell'epidermide (Figura 1b). I siti di infezione (come osservato sulla H & E vetrini colorati) sono stati osservati come ragruppato Bd sporangi sparsi attraverso le sezioni di pelle ventrale con nessuno nelle sezioni dorsum e coscia. Mentre il TUNEL erano più concentrate alle cellule positive e direttamente adiacente ai siti delle cellule infettate (Figura 1), c'era anche più diffuse cellule positive di TUNEL sopra l'epidermide e negli strati epidermici che erano più profondi di dove Bd riseduto. In Bd infetti animali c'erano altre cellule positive TUNEL in tutti i tipi di pelle tre analizzati, ma un livello particolarmente elevato nella pelle della coscia e venter (12.01 volte superiore (95% CI: 4,92-26,30) nella pelle della coscia e 22,31 volte superiore (95% CI 5,25-94,82) nella pelle di Venter) (Figura 2).
Analisi di caspase 3/7
Nel corso dell'infezione c'era una differenza nell'attività di caspase. In Bd infettata animali, intensità di infezione è stata correlata positivamente con l'attività della caspasi 3/7 (Figura 3). C'era anche una differenza tra animali infetti e non infetti attraverso il tempo, l'inoculazione di post. L'attività della caspasi 3/7 diminuito entro le prime settimane dopo l'inoculazione (con 48,36% meno attività in animali infettati) e poi aumentato verso la fine della settimana 7 (Figura 4) in Bd animali infetti, ma è rimasto costante nel non infetti individui.
Figura 1: Terminal transferasi-mediata dUTP nick end-etichettatura (TUNEL) nell'analisi in situ di infetti e non infetti animali. A) Bd- sezione di controllo coscia pelle di Pseudophryne corroboree e B) Bd+ coscia pelle sezione di p. corroboree macchiato dall'analisi di TUNEL in situ . Il blu è DAPI macchiatura indicando i nuclei delle cellule, e il rosso è la macchia di rodamina, che indica la frammentazione del DNA tipicamente causata dal apoptosis. La freccia gialla indica la posizione del cluster Bd visto nel pannello di C. C) p. corroboree sezione della coscia pelle macchiata con H & E. La sezione H & E è seriale al pannello B. C'è un gruppo di vuoto Bd sporangi (freccia) e pochi sporangi immaturi scuri vicino alla superficie della pelle. Per tutti i tre pannelli l'epidermide è nella parte superiore della foto. Confrontando i pannelli B e C dimostra che la rodamina macchiato le cellule epidermiche sono concentrato intorno e sotto il cluster di Bd e danni della pelle dove è visibile, come la formazione di micro-vescicola tra cellule basali epidermiche. 400 ingrandimenti e la barra della scala indica 0,03 mm. adattato da Figura 2 in Brannelly et al 2017 Peer J22. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: la proporzione di TUNEL positivo (TUNEL +) cellule per ogni tipo di pelle. La proporzione di cellule apoptotiche positivo TUNEL per ogni tipo di pelle in p. corroboree, con animali infetti che indica gli animali che ha soccombuto alla malattia (n = 9) e gli animali di controllo non infetto (n = 10). Barre di errore indicano gli intervalli di confidenza del 95% di una proporzione e * indica un aumento significativo nel TUNEL + cella proporzioni. In pelle dorsale, gli animali infetti avevano 14,38 (CI di 95% 3,32-62.24) volte più cellule positive TUNEL rispetto agli animali controllo (Odds Ratio: Z = 3,57, p < 0.01). Nella pelle della coscia, animali infetti avevano 12,01 (95% CI: 4,92-26,30; Odds Ratio: Z = 5,46, p < 0.01) volte più cellule positive TUNEL rispetto agli animali di controllo (Chi quadrato di Pearson: χ21 = 44.30, p < 0.01). Nella pelle venter, animali infetti avevano 22,31 (CI di 95% 5,25-94,82) volte più cellule positive TUNEL rispetto agli animali controllo (Odds Ratio: Z = 4,21, p < 0.01). Adattato da Figura 3 in Brannelly et al 2017 Peer J22. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: La correlazione tra intensità di infezione, Log10(equivalenti di zoospore) e caspasi 3/7, Log10(caspasi) di inoculati Litoria verreauxii alpina nel corso dell'esperimento. La correlazione tra l'intensità di infezione e l'attività della caspasi è 0.463, e la linea di tendenza è un'equazione y = x (0,229) + 0.939. Adattato da Figura 4 a Brannelly et al. 2017 peer J22. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Attività di Caspase 3/7 attraverso settimana 7 per ogni gruppo di Litoria verreauxii alpina: Bd-infettati animali che ha soccombuto alla malattia (n = 4) e non infetti di controlli (n = 8). L'attività della caspasi è definito come la luminescenza lettura applicando per concentrazione di proteina per campione e quindi accedere trasformato in base 10. L'attività di caspase (Log.10 trasformato) per ogni gruppo a settimana. Barre di errore indicano l'errore standard. * indica che gli animali infetti ha differito dai controlli non infetti a quella settimana. (Modello lineare misto effetti: settimana, F4 = 11.974, p < 0.01; settimana * status, F8 = 2.139, p = 0,037; Settimana 3 ANOVA, F2,18 = 5.512, p = 0,014), adattato da Figura 5 in Brannelly et al 2017 Peer J22. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Abbiamo esplorato epidermica apoptosi e morte cellulare come un potenziale meccanismo di patologia del chytridiomycosis malattia mortale o un meccanismo di resistenza alle malattie in specie sensibili Bd . Abbiamo usato due metodi di valutazione della morte delle cellule nell'epidermide, analisi di TUNEL per analisi di morte in situ delle cellule epidermiche e l'analisi di caspase 3/7 per il monitoraggio di morte delle cellule epidermiche in tutto lo stato di avanzamento dell'infezione. Abbiamo trovato che l'apoptosi e la morte delle cellule sono correlato con carico di infezione e morte delle cellule è significativamente più alta nel sito di infezione. Nell'infezione iniziale, c'è una diminuzione nell'apoptosi nell'epidermide, ma aumenta l'apoptosi come agente patogeno aumenti di peso all'interno del tessuto infetto.
Apoptosi nelle cellule possono essere testati utilizzando numerosi approcci diversi, ognuno con vantaggi e limitazioni. È importante studiare l'apoptosi e morte cellulare mediante saggi multipli al fine di confermare i risultati. In questo studio, abbiamo esplorato due dosaggi diversi per indagare la morte delle cellule epidermiche e apoptosi nelle rane con chytridiomycosis. Primo, abbiamo testato il TUNEL assay per valutare delle cellule morte in situ. Questo test è che richiede tempo e costoso per campione, e diapositive devono essere letto immediatamente come il segnale fluorescente svanisce rapidamente. Nonostante queste limitazioni, i risultati di questo esperimento in situ sono importanti per ulteriore comprensione dei meccanismi delle interazioni ospite-patogeno. Informazioni per quanto riguarda la localizzazione possono essere determinati utilizzando questo metodo, e nel nostro studio apoptosi erano presente in alti livelli presso il sito di infezione fungina e più diffuso in altri siti. Inoltre, si deve constatare che l'analisi di TUNEL misure danno al DNA, che può essere causato da una serie di meccanismi di morte cellulari differenti tra cui l'apoptosi, necrosi e pyroptosis17. Mentre ci sono le firme di morte delle cellule in apoptosi-collegata (come singole cellule con membrane ancora intatto, vedi protocollo linea 4.6.3, la classificazione si basa sull'interpretazione del ricercatore. Poiché il meccanismo di morte cellulare non è determinato dall'analisi di TUNEL, è possibile che un'altra via di morte delle cellule non-apoptosi può causare l'aumento in cellule positive TUNEL alle morbosità di animali infetti. La differenza nei quali ogni misure di analisi potrebbero spiegare le differenze di modello nei due dosaggi sperimentati qui.
L'analisi di caspase 3/7 può essere utilizzato per quantificare l'effetto dell'infezione attraverso il tempo. Tuttavia, come Rana punta campioni sono piccoli, non ci è campione limitato per l'analisi e standardizzazione. Un metodo comune per la standardizzazione di esempio è quello di determinare la concentrazione di proteine totali di ciascun estratto. Come l'analisi di quantificazione della proteina di Bradford consuma campione, non si tratta di un metodo efficace per piccoli estratti. Inoltre, abbiamo trovato che pigmenti all'interno la rana della pelle precluso analisi mediante spettrometria di nano UV-Vis. Campioni di piccole dimensioni inoltre ha impedito la standardizzazione in peso secco. Ti consigliamo di stimare la superficie della pelle della punta utilizzando la fotografia, come i campioni di punta di punta (queste rane erano meno di 3 g nella dimensione corporea) erano troppo piccoli per consentire analisi per concentrazione di proteine e la concentrazione di caspase. Abbiamo trovato che fotografare le dita dei piedi e utilizzando una stima di superficie della pelle è efficace come analisi concentrazione proteica tradizionale.
In questo studio, abbiamo utilizzato due tecniche standard per quantificare morte cellulare e apoptosi, ma adattato i metodi per anfibi e piccoli campioni di tessuto. Per l'analisi di TUNEL, abbiamo soppresso l'animale per garantire abbastanza tessuto era disponibile per il dosaggio e consentito per il confronto delle posizioni differenti della pelle. È possibile adattare questo metodo di più piccoli campioni di tessuto, ad esempio una biopsia di tessitura di punta, che non richiederebbe l'eutanasia dell'animale. A seconda delle dimensioni dell'animale, le biopsie potrebbero consentire per tempo serie prova simile al nostro approccio per l'analisi di caspase 3/7.
In futuro gli studi, consigliamo l'utilizzo di ulteriori saggi per esplorare la morte cellulare e apoptosi nel corso dell'infezione chytridiomycosis perché c'è ancora molto da apprendere i meccanismi causali della patogenesi chytridiomycosis. Questi risultati indicano che l'apoptosi e la morte delle cellule epidermiche possono essere importanti nella patogenesi della Bd; Tuttavia, più ricerca è necessaria al fine di determinare l'influenza dell'apoptosi sui risultati di malattia, particolarmente in padroni di casa che non soccombere alla infezione.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano concorrenti interessi finanziari.
Acknowledgments
Si ringraziano le seguenti persone che ci ha assistito con allevamento e raccolta di dati: Tegtmeier D., C. De Jong, J. Hawkes, K. Fossen, S. Percival, M. McWilliams, L. Bertola, M. Stewart, Harney N. e T. Knavel; e M. Merces per assistenza con le dissezioni. Vorremmo anche ringraziare M. McFadden, P. Harlow e Taronga Zoo per la raccolta di L. v. alpinae G. Marantelli per sollevare il p. corroboree. Si ringrazia F. Pasmans, r. Martel per consigli su saggi di apoptosi, C. Costantino, r. Kladnik e R. Webb per assistenza con analisi di TUNEL, e Salvatore T. e W. Weßels per aiutare con protocollo e kit per l'analisi di caspase 3/7. Questo manoscritto e protocollo è adattato da Brannelly et al 2017 Peer J22.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| POLARstar Omega | BMG Labtech | Luminescent plate reader | |
| 384 well flat clear bottom plate | Corning | 3707 | |
| 384 well low flange white flat bottom plate | Corning | 3570 | |
| Agar Bacteriological (Oxoid) | Fisher | OXLP0011B | |
| Formal-Fixx 10% Neutral Buffered Formalin | Fisher | 6764254 | |
| Lactose Broth (Oxoid) | Fisher | OXCM0137B | |
| Sodium Bicarbonate | Fisher | BP328-500 | |
| Tricane-S (MS-222) | Fisher | NC0872873 | |
| Tryptone | Fisher | BP1421-500 | |
| Bovine Serum Albumin | Invitrogen | 15561020 | |
| Sterile rayon swab | Medical Wire & Equipment | MW-113 | |
| ApopTag Red In Situ Apoptosis Detection Kit | Merck Millipore | S7165 | |
| Coomassie Bradford reagent | Pierce | 23200 | |
| Caspase Glo 3/7 | Promega | G8090 | |
| HEPES buffer | Sigma Aldrich | H0887-20ML | |
| Magnesium chloride | Sigma Aldrich | 1374248-1G | |
| Gelatin hydrolysate Enzymatic | Sigma-Aldrich | G0262 | |
| PBS (Phosphate Buffered Saline), pH 7.2 (1X) | Thermo/Life | 20-012-043 | |
| Prepman | Thermo/Life | 4318930 | |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | ThermoFisher | 4444556 | |
| Parafilm | Bemis | PM996 | |
| Clorox bleach | Clorox | ||
| Ethanol, 200 Proof, Molecular Grade | Fisher | BP2818500 | |
| ZEISS Axio Scan florescent miscroscope | Carl Zeiss | Florescent microscope | |
| 3.2mm stainless steel beads | BioSpec | 11079132SS | |
| Primer ITSI-3 Chytr (5′-CCTTGAT ATAATACAGTGTGCCATATGTC-3′) |
Taqman | Individual design for primers and probe | |
| Primer 5.8S Chytr (5′-TCGGTT CTCTAGGCAACAGTTT-3′) |
Taqman | Individual design for primers and probe | |
| Minor groove binder probe Chytr MGB2(5′-CGAGTCGAAC-3′) | Taqman | Individual design for primers and probe | |
| Rotor-Gene qPCR Instruments | Qiagen | qPCR machine | |
| Microcentrifuge tubes 1.5ml | Fisher | 02-681-372 | |
| Cell culture petri plates | Nunc | 263991 | |
| Mini-beadBeater Zircornia-Silicate Beads, 0.5mm | BioSpec | 11079105Z |
References
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