टर्मिनल ट्रांस्फ़्रेज़ का उपयोग-मध्यस्थता dUTP निक अंत लेबलिंग (TUNEL) और Caspase 3/7 परख एपिडर्मल के साथ मेंढक में Chytridiomycosis कोशिका मृत्यु को मापने के लिए
Summary
हम दो तरीकों का उपयोग chytridiomycosis के साथ मेंढ़क में एपिडर्मल कोशिका मौत यों तो । सबसे पहले, हम नैदानिक संक्रमित और संक्रमित पशुओं के बीच मतभेद का निर्धारण करने के लिए सीटू प्रोटोकॉल में टर्मिनल ट्रांस्फ़्रेज़-मध्यस्थता dUTP निक एंड-लेबलिंग (TUNEL) का उपयोग करें । दूसरा, हम एक caspase 3/7 प्रोटीन विश्लेषण का उपयोग कर संक्रमण पर apoptosis की एक समय श्रृंखला विश्लेषण आचरण ।
Abstract
उभयचर वैश्विक स्तर पर जैव विविधता में एक महान नुकसान का सामना कर रहे है और प्रमुख कारणों में से एक संक्रामक रोग chytridiomycosis है । यह रोग कवक रोगजनक Batrachochytrium dendrobatidis (Bd) के कारण होता है, जो मेंढक एपिडर्मिस को संक्रमित और बाधित कर जाता है; हालांकि, रोग परिवर्तन स्पष्ट रूप से विशेषता नहीं किया गया है । Apoptosis (क्रमादेशित सेल मौत) रोगज़नक़ों द्वारा इस्तेमाल किया जा सकता को नुकसान मेजबान ऊतक, लेकिन यह भी रोगज़नक़ हटाने के लिए रोग प्रतिरोध की एक मेजबान तंत्र हो सकता है । टर्मिनल ट्रांस्फ़्रेज़-मध्यस्थता dUTP निक अंत-लेबलिंग (TUNEL), और caspase 3/7: इस अध्ययन में, हम संक्रमित और संक्रमित दो अलग परख का उपयोग पशुओं के एपिडर्मल कोशिका मौत यों तो । TUNEL परख में ventral, पृष्ठीय, और जांघ त्वचा ऊतक का प्रयोग, हम नैदानिक संक्रमित पशुओं की सीटू में एपिडर्मल कोशिकाओं में कोशिका मृत्यु का पालन और फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग कर पशुओं के साथ सेल मौत की तुलना करें । आदेश में निर्धारित करने के लिए कैसे संक्रमण के पाठ्यक्रम पर एपिडर्मिस परिवर्तन में apoptosis स्तर हम पैर की अंगुली को हटाने-टिप नमूने एक 8 सप्ताह की अवधि में पाक्षिक, और निकाले गए प्रोटीन के साथ एक caspase 3/7 परख का उपयोग करने के लिए नमूने के भीतर गतिविधि यों तो । हम तो संक्रमण लोड के साथ caspase 3/7 गतिविधि सहसंबंधी बनाना । TUNEL परख सीटू मेंसेल मौत के स्थानीयकरण के लिए उपयोगी है, लेकिन महंगा है और नमूना प्रति गहन समय है । caspase 3/7 परख बड़े नमूना आकार और समय पाठ्यक्रम प्रयोगों के लिए कुशल है । हालांकि, क्योंकि मेंढक पैर की अंगुली टिप बायोप्सी छोटे है वहां सीमित निकालने प्रोटीन ठहराव तरीकों, जैसे ब्रैडफोर्ड परख के माध्यम से नमूना मानकीकरण के लिए उपलब्ध है । इसलिए, हम सुझाव है कि पैर की अंगुली बायोप्सी के फोटोग्राफिक विश्लेषण के माध्यम से त्वचा की सतह क्षेत्र का आकलन नमूना मानकीकरण के दौरान अर्क लेने से बचने के लिए ।
Introduction
उभयचर वर्तमान में किसी भी हड्डीवाला taxa1के वैश्विक जैव विविधता का सबसे बड़ा नुकसान का सामना कर रहे हैं । इन गिरावट का एक प्रमुख कारण घातक त्वचा रोग chytridiomycosis, कवक रोगज़नक़ Batrachochytrium dendrobatidis, Bd2की वजह से है । रोगज़नक़ सतही एपिडर्मिस, जो गंभीर इलेक्ट्रोलाइट हानि, हृदय की गिरफ्तारी, और मौत3में जिसके परिणामस्वरूप त्वचा समारोह के विघटन के लिए नेतृत्व कर सकते है संक्रमित । विभिंन संभावित मेजबान Bd के खिलाफ प्रतिरक्षा तंत्र वर्तमान में ऐसे रोगाणुरोधी पेप्टाइड्स के रूप में अध्ययन किया जा रहा है,4,5, त्वचा के जीवाणु वनस्पति6, प्रतिरक्षा सेल रिसेप्टर्स7,8, और लिम्फोसाइट गतिविधि9,10. हालांकि, कुछ अध्ययनों से पता लगाने कि क्या एपिडर्मल apoptosis और कोशिका मृत्यु इस घातक रोगज़नक़ के खिलाफ एक प्रतिरक्षा तंत्र है ।
कोशिका मृत्यु, या तो apoptosis (क्रमादेशित सेल मौत) या परिगलन (unprogrammed मौत) के माध्यम से, एपिडर्मिस में Bd संक्रमण की विकृति हो सकती है । पिछले शोध से पता चलता है कि Bd संक्रमण apoptosis प्रेरित हो सकता है क्योंकि intracellular जंक्शनों के विघटन मनाया जाता है जब त्वचा explants इन विट्रो11में zoospore supernatants के संपर्क में हैं। इसके अतिरिक्त, Bd-संक्रमित मेंढक में अपक्षयी एपिडर्मल परिवर्तन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी12,13का उपयोग कर मनाया जाता है । Transcriptomic विश्लेषण संकेत मिलता है कि apoptosis रास्ते संक्रमित त्वचा14में विनियमित रहे हैं, और amphibian splenocytes से गुजरना apoptosis जब वे Bd supernatants करने के लिए इन विट्रो15में उजागर कर रहे हैं । सुझाव है कि Bd apoptosis और मेजबान सेल मौत इन विट्रोमें प्रेरित कर सकते हैं सबूत की बढ़ती मात्रा के बावजूद, vivo अध्ययन है कि पता लगाने या संक्रमण की प्रगति के माध्यम से apoptosis तंत्र को बढ़ाता है में कमी है । इसके अलावा, यह अज्ञात है अगर मेजबान एक रक्षात्मक प्रतिरक्षा रणनीति के रूप में apoptosis का उपयोग करता है Bd संक्रमण का मुकाबला, या यदि apoptosis रोग की एक विकृति है ।
इस अध्ययन में, हम एपिडर्मल कोशिका मौत का पता लगाने के उद्देश्य से और vivo में संक्रमित पशुओं में apoptosis दो तरीकों का उपयोग कर: caspase 3/7 प्रोटीन परख, और टर्मिनल ट्रांस्फ़्रेज़-मध्यस्थता dUTP निक अंत-लेबलिंग (TUNEL) में सीटू परख. के रूप में प्रत्येक परख सेल मौत के विभिंन पहलुओं16का पता लगाता है, एक साथ इन तरीकों कोशिका मृत्यु में शामिल तंत्र की एक पूरी समझ प्रदान करते हैं, और प्रभाव का एक सटीक उपाय सुनिश्चित करते हैं । caspase 3/7 परख quantifies caspases 3 और 7 है, जो आंतरिक और बाह्य apoptosis मार्ग दोनों के ठहराव सक्षम बनाता है की गतिविधि । इसके विपरीत, TUNEL परख डीएनए विखंडन है, जो apoptosis, परिगलन और pyroptosis17सहित कोशिका मृत्यु तंत्र के कारण होता है का पता लगाता है । हम TUNEL परख का उपयोग दोनों नैदानिक संक्रमित और संक्रमित तीन अलग त्वचा वर्गों का उपयोग पशुओं के एपिडर्मिस के भीतर कोशिका मृत्यु के स्थान की जांच: dorsum, वेंटर और Pseudophryne corroboreeकी जांघ । इस विधि कोशिका मृत्यु के संरचनात्मक साइट, साथ ही विशिष्ट एपिडर्मल परतों के भीतर अपने स्थान को पहचानने की पहचान करता है । हम तो caspase 3/7 परख का उपयोग एक समय श्रृंखला एक 8 में apoptosis के ठहराव सप्ताह के संचालन के लिए लिटौरिया verreauxii alpinaमें संक्रमण । हम एक ही जानवर से पैर की अंगुली टिप नमूने ले और caspase 3/7 गतिविधि के साथ रोगज़नक़ संक्रमण लोड सहसंबंधी करने में सक्षम हैं ।
Protocol
Representative Results
Discussion
हम घातक रोग chytridiomycosis की विकृति के एक संभावित तंत्र या Bd अतिसंवेदनशील प्रजातियों में रोग प्रतिरोध की एक प्रणाली के रूप में एपिडर्मल apoptosis और कोशिका मृत्यु का पता लगाया । हम एपिडर्मिस में सेल मौत का आकलन क?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम निंनलिखित लोग हैं, जो पशुपालन और डेटा संग्रह के साथ सहायता का धंयवाद: Tegtmeier, सी. डी जोंग, जे हॉकरों, के. Fossen, एस. Percival, एम. McWilliams, एल. Bertola, एम. स्टीवर्ट, एन Harney, और टी. Knavel; और विच्छेदों के साथ सहायता के लिए एम. Merces. हम यह भी एल. वी. alpinaस्थापना के लिए एम. McFadden, पी Harlow और Taronga चिड़ियाघर शुक्रिया अदा करना चाहूंगा पी. Marantelliस्थापना के लिए और जी. corroboree । हम Kladnik परख के साथ सहायता के लिए apoptosis परख, सी. Constantine, ए. TUNEL और आर. वेब पर सलाह के लिए एफ Pasmans, ए Martel धंयवाद, और Emeto 3/7 परख के लिए प्रोटोकॉल और किट के साथ मदद के लिए Weßels और डब्ल्यू caspase । यह पांडुलिपि और प्रोटोकॉल Brannelly एट अल २०१७ पीयर जे22से अनुकूलित है।
Materials
| POLARstar Omega | BMG Labtech | Luminescent plate reader | |
| 384 well flat clear bottom plate | Corning | 3707 | |
| 384 well low flange white flat bottom plate | Corning | 3570 | |
| Agar Bacteriological (Oxoid) | Fisher | OXLP0011B | |
| Formal-Fixx 10% Neutral Buffered Formalin | Fisher | 6764254 | |
| Lactose Broth (Oxoid) | Fisher | OXCM0137B | |
| Sodium Bicarbonate | Fisher | BP328-500 | |
| Tricane-S (MS-222) | Fisher | NC0872873 | |
| Tryptone | Fisher | BP1421-500 | |
| Bovine Serum Albumin | Invitrogen | 15561020 | |
| Sterile rayon swab | Medical Wire & Equipment | MW-113 | |
| ApopTag Red In Situ Apoptosis Detection Kit | Merck Millipore | S7165 | |
| Coomassie Bradford reagent | Pierce | 23200 | |
| Caspase Glo 3/7 | Promega | G8090 | |
| HEPES buffer | Sigma Aldrich | H0887-20ML | |
| Magnesium chloride | Sigma Aldrich | 1374248-1G | |
| Gelatin hydrolysate Enzymatic | Sigma-Aldrich | G0262 | |
| PBS (Phosphate Buffered Saline), pH 7.2 (1X) | Thermo/Life | 20-012-043 | |
| Prepman | Thermo/Life | 4318930 | |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | ThermoFisher | 4444556 | |
| Parafilm | Bemis | PM996 | |
| Clorox bleach | Clorox | ||
| Ethanol, 200 Proof, Molecular Grade | Fisher | BP2818500 | |
| ZEISS Axio Scan florescent miscroscope | Carl Zeiss | Florescent microscope | |
| 3.2mm stainless steel beads | BioSpec | 11079132SS | |
| Primer ITSI-3 Chytr (5′-CCTTGATATAATACAGTGTGCCATATGTC-3′) | Taqman | Individual design for primers and probe | |
| Primer 5.8S Chytr (5′-TCGGTTCTCTAGGCAACAGTTT-3′) | Taqman | Individual design for primers and probe | |
| Minor groove binder probe Chytr MGB2(5′-CGAGTCGAAC-3′) | Taqman | Individual design for primers and probe | |
| Rotor-Gene qPCR Instruments | Qiagen | qPCR machine | |
| Microcentrifuge tubes 1.5ml | Fisher | 02-681-372 | |
| Cell culture petri plates | Nunc | 263991 | |
| Mini-beadBeater Zircornia-Silicate Beads, 0.5mm | BioSpec | 11079105Z |
References
- Stuart, S. N., et al. Status and trends of amphibian declines and extinctions worldwide. Science. 306 (5702), 1783-1786 (2004).
- Skerratt, L. F., et al. Spread of chytridiomycosis has caused the rapid global decline and extinction of frogs. EcoHealth. 4, 125-134 (2007).
- Voyles, J., et al. Pathogenesis of chytridiomycosis, a cause of catastrophic amphibian declines. Science. 326 (5952), 582-585 (2009).
- Woodhams, D. C., et al. Population trends associated with skin peptide defenses against chytridiomycosis in Australian frogs. Oecologia. 146 (4), 531-540 (2006).
- Woodhams, D. C., Voyles, J., Lips, K. R., Carey, C., Rollins-Smith, L. A. Predicted disease susceptibility in a Panamanian amphibian assemblage based on skin peptide defenses. Journal of Wildlife Diseases. 42 (2), 207-218 (2006).
- Woodhams, D. C., Rollins-Smith, L. A., Alford, R. A., Simon, M. A., Harris, R. N. Innate immune defenses of amphibian skin: antimicrobial peptides and more. Animal Conservation. 10, 425-428 (2007).
- Savage, A. E., Zamudio, K. R. MHC genotypes associate with resistance to a frog-killing fungus. PNAS. 108 (40), 16705-16710 (2011).
- Bataille, A., et al. Susceptibility of amphibians to chytridiomycosis is associated with MHC class II conformation. Proceeding of the Royal Society B. 282, 20143127 (2015).
- Fites, J. S., Reinert, L. K., Chappell, T. M., Rollins-Smith, L. A. Inhibition of local immune responses by the frog-killing fungus Batrachochytrium dendrobatidis. Infection and Immunity. 82 (11), 4698-4706 (2014).
- Brannelly, L. A., Webb, R. J., Skerratt, L. F., Berger, L. Effects of chytridiomycosis on hematopoietic tissue in the spleen, kidney and bone marrow in three diverse amphibian species. Pathogens and Disease. 74 (7), ftw069 (2016).
- Brutyn, M., et al. Batrachochytrium dendrobatidis zoospore secretions rapidly disturb intercellular junctions in frog skin. Fungal Genetics and Biology. 49 (10), 830-837 (2012).
- Berger, L., Hyatt, A. D., Speare, R., Longcore, J. E. Life cycle stages of the amphibian chytrid Batrachochytrium dendrobatidis. Diseases of Aquatic Organisms. 68 (1), 51-63 (2005).
- Pasmans, F., et al. Chytridiomycosis related mortality in a midwife toad (Alytes obstetricans) in Belgium. Vlaams Diergeneeskundig Tijdschrift. 79 (6), 460-462 (2010).
- Ellison, A. R., et al. More than skin deep: Functional genomic basis for resistance to amphibian chytridiomycosis. Genome Biology and Evolution. 7 (1), 286-298 (2014).
- Fites, J. S., et al. The invasive chytrid fungus of amphibians paralyzes lymphocyte responses. Science. 342 (6156), 366-369 (2013).
- Galluzzi, L., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes. Cell Death and Differentiation. 16 (8), 1093-1107 (2009).
- Kelly, K. J., Sandoval, R. M., Dunn, K. W., Molitoris, B. A., Dagher, P. C. A novel method to determine specificity and sensitivity of the TUNEL reaction in the quantitation of apoptosis. American Journal of Cell Physiology. 284 (5), C1309-C1318 (2003).
- Boyle, D. G., Boyle, D. B., Olsen, V., Morgan, J. A. T., Hyatt, A. D. Rapid quantitative detection of chytridiomycosis (Batrachochytrium dendrobatidis) in amphibian samples using real-time Taqman PCR assay. Diseases of Aquatic Organisms. 60 (2), 141-148 (2004).
- Brannelly, L. A., Webb, R., Skerratt, L. F., Berger, L. Amphibians with infectious disease increase their reproductive effort: evidence for the terminal investment hypothesis. Open Biology. 6 (6), 1-24 (2016).
- Webb, R., Mendez, D., Berger, L., Speare, R. Additional disinfectants effective against the amphibian chytrid fungus Batrachochytrium dendrobatidis. Diseases of Aquatic Organisms. 74 (1), 13-16 (2007).
- Woods, A., Ellis, R. . Laboratory Histopathology: A Complete Reference. , (1994).
- Brannelly, L. A., Roberts, A. A., Skerratt, L. F., Berger, L. Epidermal cell death in frogs with chytridiomycosis. PeerJ. 5, e2925 (2017).
