Usando o Terminal Transferase-mediada dUTP Nick End-rotulagem (TUNEL) e Caspase 3/7 ensaios a morte de células epidérmicas medida em sapos com quitridiomicose
Summary
Podemos quantificar a morte celular epidérmica em sapos com quitridiomicose usando dois métodos. Primeiro, usar terminal transferase-mediated dUTP nick em situ histologia rotulagem final (TUNEL) para determinar diferenças entre animais clinicamente infectados e não infectados. Em segundo lugar, realizamos uma análise de série de tempo da apoptose infecção usando uma análise de proteínas caspase 3/7.
Abstract
Anfíbios estão enfrentando uma grande perda de biodiversidade global e uma das principais causas é a doença infecciosa quitridiomicose. Esta doença é causada por patógeno fungo Batrachochytrium dendrobatidis (Bd), que infecta e interrompe a epiderme de rã; no entanto, as alterações patológicas não foram explicitamente caracterizadas. Apoptose (morte celular programada) pode ser usado por patógenos para danificar o tecido do hospedeiro, mas também pode ser um mecanismo de anfitrião de resistência a doenças, para a remoção do agente patogénico. Neste estudo, podemos quantificar a morte de células epidérmicas de animais infectados e não infectados, usando dois diferentes ensaios: terminal transferase-mediated dUTP nick end-rotulagem (TUNEL) e caspase 3/7. Usando ventral, dorsal e o tecido da pele da coxa no ensaio de TUNEL, observamos pilha morte no células epidérmicas em situ de animais clinicamente infectados e comparar a morte celular com animais não infectados usando microscopia fluorescente. A fim de determinar como os níveis de apoptose na epiderme mudam no curso da infecção, nós removemos amostras de ponta de dedo do pé-quinzenalmente durante um período de 8 semanas e use um ensaio do caspase 3/7 com proteínas extraídas para quantificar a atividade dentro das amostras. Nós então correlacionar atividade caspase 3/7 com carga de infecção. O ensaio TUNEL é útil para a localização da célula morte em situ, mas é caro e tempo intensivo por amostra. O ensaio do caspase 3/7 é eficiente para tamanhos de amostra grande e tempo experiências do curso. No entanto, porque biópsias de ponta de dedo de rã são pequenas há extrato limitado disponível para padronização de amostra através de métodos de quantificação da proteína, tais como o ensaio de Bradford. Portanto, sugerimos que estimar a área de superfície da pele através da análise fotográfica de biópsias do dedo do pé para evitar consumir extratos durante a padronização da amostra.
Introduction
Os anfíbios são actualmente uma as maiores perdas de biodiversidade global de qualquer vertebrado táxons1. Das principais causas destes declínios é a quitridiomicose de doença de pele fatal, causada por patógeno fungo Batrachochytrium dendrobatidis, Bd2. O patógeno infecta superficialmente a epiderme, que pode levar ao rompimento de função da pele, resultando em perda de eletrólito grave, parada cardíaca e morte3. Vários potenciais hospedeiro imune mecanismos contra Bd atualmente estão sendo estudados, tais como peptídeos antimicrobianos4,5, flora bacteriana cutânea6, imune celular receptores7,8, e linfócitos atividade9,10. No entanto, poucos estudos exploram se morte de apoptose e célula epidérmica é um mecanismo imune contra este agente patogénico mortal.
Morte celular, por meio de apoptose (morte celular programada) ou necrose (morte sem programado), a epiderme pode ser uma patologia de infecção de Bd . Pesquisas anteriores sugerem que Bd infecção pode induzir apoptose porque interrupção das junções intracelulares é observada quando a pele explantes estão expostos a zoospore sobrenadantes em vitro11. Além disso, alterações epidérmicas degenerativas em Bd-rãs infectadas são observadas usando microscopia eletrônica12,13. Transcriptomic análises indicam que as vias de apoptose são upregulated em pele infectada14, e anfíbios splenocytes sofrem apoptose quando eles são expostos a Bd sobrenadantes em vitro15. Apesar do volume crescente de evidências sugerindo que o Bd pode induzir apoptose e anfitrião pilha morte em vitro, estudos em vivo que explore ou quantificar a apoptose mecanismos através a progressão da infecção são escassos. Além disso, é desconhecido se o host usa apoptose como uma estratégia de defesa imune para combater infecção de Bd , ou se a apoptose é uma patologia da doença.
Neste estudo, tivemos como objetivo detectar morte celular epidérmica e apoptose em animais infectados na vivo usando dois métodos: ensaio de proteínas caspase 3/7 e terminal transferase-mediated dUTP nick rotulagem final (TUNEL) em situ do ensaio. Como cada ensaio detecta diferentes aspectos da célula morte16, juntos, esses métodos fornecem uma completa compreensão dos mecanismos envolvidos na morte celular e certifique-se de uma medida exata do efeito. O ensaio do caspase 3/7 quantifica a atividade das caspases efetoras 3 e 7, que permite a quantificação de ambas as vias de apoptose intrínseca e extrínseca. Em contraste, o ensaio TUNEL detecta fragmentação de DNA, que é causada por mecanismos de morte celular, incluindo apoptose, necrose e pyroptosis17. Nós usamos o ensaio do TUNEL para investigar o local da morte de pilha dentro da epiderme dos animais clinicamente infectados e não infectados usando três seções de pele diferentes: o dorso, o ventre e a coxa de Pseudophryne corroboree. Este método identifica o site anatômico de morte celular, bem como distinguir sua localização dentro de específicas camadas epidérmicas. Em seguida, usamos o ensaio do caspase 3/7 para conduzir uma quantificação de série de tempo da apoptose durante uma infecção de 8 semanas em Litoria verreauxii alpina. Tomamos amostras de ponta de dedo quinzenal dos mesmos animais e são capazes de correlacionar a carga de infecção do patógeno com atividade da caspase 3/7.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nós exploramos epidérmico apoptose e morte celular, como um mecanismo potencial de patologia de quitridiomicose a doença mortal ou um mecanismo de resistência a doenças em espécies sensíveis de Bd . Usamos dois métodos de avaliação de morte celular na epiderme, ensaio TUNEL para em situ análise de morte de células epidérmicas e ensaio do caspase 3/7 para monitoramento morte celular epidérmica em todo o progresso da infecção. Descobrimos que apoptose e morte celular é correlacionadas com…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos às seguintes pessoas que ajudaram com criação e recolha de dados: Tegtmeier D. C. De Jong, J. Hawkes, Fossen K., S. Percival, M. McWilliams, L. Bertola, M. Stewart, s. Harney e T. Knavel; e M. Mercês para obter assistência com dissecações. Também gostaríamos de agradecer a M. McFadden, P. Harlow e Taronga Zoo para elevar o L. v. alpinae G. Marantelli para elevar o p. corroborre. Agradecemos a F. Pasmans, r. Martel para aconselhamento sobre ensaios de apoptose, C. Constantino, r. Kladnik e R. Webb para obter assistência com ensaio TUNEL, e T. Emeto e W. Weßels para ajudarem com o protocolo e kit de ensaio do caspase 3/7. Este manuscrito e o protocolo é adaptado de Brannelly et al 2017 Peer J22.
Materials
| POLARstar Omega | BMG Labtech | Luminescent plate reader | |
| 384 well flat clear bottom plate | Corning | 3707 | |
| 384 well low flange white flat bottom plate | Corning | 3570 | |
| Agar Bacteriological (Oxoid) | Fisher | OXLP0011B | |
| Formal-Fixx 10% Neutral Buffered Formalin | Fisher | 6764254 | |
| Lactose Broth (Oxoid) | Fisher | OXCM0137B | |
| Sodium Bicarbonate | Fisher | BP328-500 | |
| Tricane-S (MS-222) | Fisher | NC0872873 | |
| Tryptone | Fisher | BP1421-500 | |
| Bovine Serum Albumin | Invitrogen | 15561020 | |
| Sterile rayon swab | Medical Wire & Equipment | MW-113 | |
| ApopTag Red In Situ Apoptosis Detection Kit | Merck Millipore | S7165 | |
| Coomassie Bradford reagent | Pierce | 23200 | |
| Caspase Glo 3/7 | Promega | G8090 | |
| HEPES buffer | Sigma Aldrich | H0887-20ML | |
| Magnesium chloride | Sigma Aldrich | 1374248-1G | |
| Gelatin hydrolysate Enzymatic | Sigma-Aldrich | G0262 | |
| PBS (Phosphate Buffered Saline), pH 7.2 (1X) | Thermo/Life | 20-012-043 | |
| Prepman | Thermo/Life | 4318930 | |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | ThermoFisher | 4444556 | |
| Parafilm | Bemis | PM996 | |
| Clorox bleach | Clorox | ||
| Ethanol, 200 Proof, Molecular Grade | Fisher | BP2818500 | |
| ZEISS Axio Scan florescent miscroscope | Carl Zeiss | Florescent microscope | |
| 3.2mm stainless steel beads | BioSpec | 11079132SS | |
| Primer ITSI-3 Chytr (5′-CCTTGATATAATACAGTGTGCCATATGTC-3′) | Taqman | Individual design for primers and probe | |
| Primer 5.8S Chytr (5′-TCGGTTCTCTAGGCAACAGTTT-3′) | Taqman | Individual design for primers and probe | |
| Minor groove binder probe Chytr MGB2(5′-CGAGTCGAAC-3′) | Taqman | Individual design for primers and probe | |
| Rotor-Gene qPCR Instruments | Qiagen | qPCR machine | |
| Microcentrifuge tubes 1.5ml | Fisher | 02-681-372 | |
| Cell culture petri plates | Nunc | 263991 | |
| Mini-beadBeater Zircornia-Silicate Beads, 0.5mm | BioSpec | 11079105Z |
References
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