嗅覚ニューロンの光刺激に対する応答のショウジョウバエ幼虫の行動を追跡
Summary
このプロトコルは、その嗅覚ニューロンの同時光刺激に対する応答のショウジョウバエ幼虫のナビゲーション動作を分析します。630 nm の波長の光は、赤いシフト チャネル ロドプシンを表現する個々 の嗅覚ニューロンをアクティブに使用されます。幼虫の動きが同時に追跡、デジタル記録、カスタムで作成されたソフトウェアを使用して分析します。
Abstract
臭気源に向かって移動する昆虫の機能は (ORNs) 一次嗅覚受容ニューロンの活動に基づいています。ORN 匂いレスポンスに関する大量の情報が生成されている特定 ORNs 行動反応を推進する上での役割のままかりです。挙動解析における合併症を生じ個々 ORNs、単一の匂いと嗅覚刺激による自然観察された変化を複製の難しさによって活性化される複数 ORNs をアクティブな匂い分子の別のボラティリティ研究室では、従来の臭気配信方法。ここでは、その ORNs の同時光刺激に対する応答のショウジョウバエ幼虫の行動を分析するプロトコルについて述べる。ここで使用される光技術 ORN 活性化の特異性や ORN 活性化の時空間パターンの正確な制御ができます。対応する幼虫の動きは追跡され、デジタル記録、カスタム ソフトウェア書かれたを使用して分析します。光刺激と匂い刺激に置き換えて、このメソッドは、幼虫の行動への影響を研究するために個々 の ORN の活性化のより正確な制御できます。幼虫に及ぼす局所介在ニューロン (LNs) だけでなく、二次投射ニューロン (PNs) の影響を研究する手法をさらに拡張できます。このメソッドはこのように嗅覚回路関数の包括的な郭清を有効にして動作応答でどのように嗅覚ニューロン活動を補完する研究に翻訳します。
Introduction
ショウジョウバエ幼虫の環境で嗅覚情報を最終的に決定する幼虫の行動1,2,3,4のみ 21 機能的に異なる ORNs、活動によって検知されます。まだ、比較的少しはこれらの 21 ORNs の活動、感覚情報がエンコードされたロジックについていいます。こうして、実験的行動に各幼虫 ORN の機能の貢献を測定する必要があります。
ショウジョウバエ幼虫 ORNs の全体のレパートリーの感覚応答プロファイル詳細1,4、5、個々 ORNs 嗅覚回路を図りするの貢献研究されていますがナビゲーションの動作は不明します。幼虫の行動研究の難しさはこれまでのところ、時空間単一 ORNs をアクティブにすることができないのために発生します。21ショウジョウバエ幼虫 ORNs の 19 を明示的にアクティブに匂いのパネルは、最近は、1だった。低濃度で、パネルの各臭気物質は、その同種 ORN からのみ生理反応を引き出します。しかし、従来の動作の試金で使用される通常より高い濃度で各臭気物質は複数 ORNs1,5,6からの生理学的な応答を引き出します。さらに、このパネルで匂いは安定した臭気グラデーション7,8の形成に依存する行動の研究の解釈を複雑にする情勢に変わった。最後に、当然のことながら発生するニオイ刺激に対する実験室の条件の下で複製することは困難であるテンポラル コンポーネントが存在します。したがって、空間的で、一時的な方法で個々 の ORNs を同時にアクティブ化中の幼虫の行動を測定できる手法を開発する重要です。
ここでは、前述の幼虫のトラッキングの利点を持つメソッド1,8の試金を示しています。Gershowらに記載されている追跡アッセイは、動作アリーナ8内の臭気の安定勾配を維持するために電子制御バルブを使用します。ただし、臭気刺激セットアップを構築に関与する複雑なエンジニア リング レベルのため、このメソッドは他の所で複製することは困難です。さらに、単一 ORNs を明示的にアクティブにする匂いを使用に関連する問題が未解決のまま。マシューらに記載されている追跡分析簡単匂いの配信システムを使用しますが、生成される臭気グラデーションはテスト臭気物質の揮発性に依存してアッセイ1の長期間にわたって安定ではないです。したがって、臭気刺激を光刺激に置き換えることによって提案手法は制御 ORN 活性化の特異性の利点があり、異なる強度の臭気勾配の形成には依存しません。
私たちのメソッドは、簡単にセットアップショウジョウバエ幼虫ナビゲーションの側面を測定する際に興味を持って研究に適した。この手法は、研究者が選択の彼らのお気に入りのシステムの neuron(s) におけるCsChrimsonの発現をドライブすることができる他のモデル システムに合わせることができます。CsChrimsonは、チャネルのロドプシンの赤いシフト バージョンです。幼虫の走光性システムには見えない波長でアクティブには。したがって、特異性、信頼性、および再現性9ニューロンの活動を操作することがられます。カスタム主題のサイズの変更を考慮してソフトウェアを書かれたを変更すると、このメソッド簡単に他の昆虫の幼虫をクロールに適応できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、ショウジョウバエ幼虫嗅覚ニューロンの同時光活性化への応答挙動の測定では、方法について説明しました。前に説明したトラッキング方法1,幼虫8 ORNs をアクティブに異なる臭気配信技術を使用します。ただし、これらのメソッドは、特異性または ORN 活性化の時空間パターンのいずれかを制御できません。本手法は、ORN 活性化?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、ネバダ大学リノ校からスタートアップ資金、国立衛生研究所許可番号 P20 GM103650 の下の日の出にサポートされていました。
Materials
| Video camera to capture larval movement | |||
| CCD Camera | Edmund Optics | 106215 | |
| M52 to M55 Filter Thread Adapter | Edmund Optics | 59-446 | |
| 2" Square Threaded Filter Holder for Imaging Lenses | Edmund Optics | 59-445 | |
| RG-715, 2" Sq. Longpass Filter | Edmund Optics | 46-066 | |
| Electronics for optogenetic setup | |||
| Raspberry Pi 2B | RASPBERRY-PI.org | RPI2-MODB-V1.2 | |
| 3 Channel programmable power supply | newegg.com | 9SIA3C62037092 | |
| 8 Channel optocoupler relay | amazon.com | 6454319 | |
| 630nm Quad-row LED strip lights | environmentallights.com | red3528-450-reel | |
| 850nm LED strips | environmentallights.com | wp-4000K-CC5050-60×2-kit | |
| Software | |||
| Matlab | Mathworks Inc. | ||
| Ubuntu MATE v16.04 | Nubuntu | https://github.com/yslo/nubuntu | |
| Other items | |||
| Plexiglass black acrylic | Home Depot | MC1184848bl | |
| Fly food and other reagents | |||
| Nutrifly fly food | Genesee Scientific | 66-112 | |
| Agarose powder | Genesee Scientific | 20-102 | |
| 22cm X 22cm square petri-dish | VWR Inc. | 25382-327 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
| All trans-retinal | Sigma-Aldrich | R2500 | |
| Flies | |||
| UAS-IVS-CsChrimson | Bloomington Drosophila Stock Center | 55134 | |
| Orco-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 26818 | |
| Or42a-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 9970 | |
| Or7a-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 23907 |
References
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