Bijhouden van Drosophila larvale gedrag in reactie op de stimulatie van de Optogenetic van olfactorische neuronen
Summary
Dit protocol analyseert navigatie gedrag van Drosophila larve in reactie op de stimulatie van de gelijktijdige optogenetic van haar olfactorische neuronen. Licht van 630 nm golflengte wordt gebruikt voor het activeren van individuele olfactorische neuronen uitdrukken van een rood-verschoven kanaal rodopsine. Larvale verkeer gelijktijdig wordt bijgehouden, digitaal opgenomen en geanalyseerd met behulp van aangepaste-geschreven software.
Abstract
Het vermogen van insecten om te navigeren naar de bronnen van de geur is gebaseerd op de activiteiten van hun eerste-orde olfactorische receptor neuronen (ORNs). Terwijl een aanzienlijke hoeveelheid informatie is gegenereerd met betrekking tot ORN reacties op reukstoffen, blijft de rol van specifieke ORNs in gedrags reacties rijden slecht begrepen. Complicaties bij gedrag analyse ontstaan als gevolg van verschillende volatiliteit van odorant die activeren van individuele ORNs, meerdere ORNs geactiveerd door één reukstoffen, evenals de moeilijkheid bij het repliceren van natuurlijk waargenomen temporele variaties in olfactorische stimuli gebruiken conventionele geur-leveringsmethoden in het laboratorium. Hier beschrijven we een protocol dat Drosophila larvale gedrag in reactie op de stimulatie van de gelijktijdige optogenetic van haar ORNs analyseert. De hier gebruikte optogenetic-technologie zorgt voor specificiteit van ORN activering en nauwkeurige controle van temporele patronen van ORN activering. Overeenkomstige larvale beweging wordt bijgehouden, digitaal opgenomen en geanalyseerd met behulp van aangepaste software geschreven. Door vervanging van geur stimuli met lichte prikkels, voorziet deze methode een meer nauwkeurige controle van individuele ORN-activering om het effect ervan op de larvale gedrag te bestuderen. Onze methode kan verder worden uitgebreid om te bestuderen van de gevolgen van de tweede orde projectie neuronen (PNs) evenals lokale neuronen (LNs) op larvale gedrag. Deze methode zal dus een uitgebreide dissectie van olfactorische circuit functie inschakelen en aanvulling studies over hoe olfactorische neuron activiteiten vertalen naar gedrag reacties.
Introduction
Olfactorische informatie in de omgeving van de larve van een Drosophila is gevoeld door slechts 21 functioneel verschillende ORNs, de activiteiten van die bepaalt uiteindelijk larvale gedrag1,,2,,3,4. Nog, is relatief weinig bekend over de logica die door die sensorische informatie is gecodeerd in de activiteiten van deze 21 ORNs. Er is dus behoefte aan de functionele bijdragen van elke larvale ORN gedrag experimenteel te meten.
Hoewel de zintuiglijke reactie-Profiel van het hele repertoire van Drosophila larvale ORNs is onderzocht in detail1,4,5, de bijdragen van individuele ORNs tot de olfactorische circuit en aldus te navigatie probleem blijven grotendeels onbekend. In de studie van de larvale gedrag, tot nu toe moeilijkheden als gevolg van het onvermogen om te activeren door het ruimtelijk en stoffelijk van één ORNs. Een panel van odorant die specifiek 19 van de 21 Drosophila larvale ORNs activeren werd recent beschreven1. Elke odorant in het deelvenster, in lage concentraties, lokt een fysiologische reactie alleen van haar cognaat ORN. Echter, bij hogere concentraties die normaal gesproken worden gebruikt voor conventionele gedrag testen, lokt elk odorant fysiologische reacties van meerdere ORNs1,5,6. Verder hebben odorant in dit deelvenster gevarieerd volatiliteiten die interpretatie van gedrag studies die afhangen van de vorming van stabiele geur verlopen7,8te bemoeilijken. Ten slotte, natuurlijk voorkomende geur prikkels hebben een temporele component die is moeilijk te repliceren onder laboratoriumomstandigheden. Daarom is het belangrijk om te ontwikkelen van een methode die larvale gedrag terwijl gelijktijdig het activeren van individuele ORNs in een ruimtelijke en temporele wijze kan meten.
Wij tonen hier, een methode die voordelen ten opzichte van de eerder beschreven larvale tracking heeft testen1,8. De bepaling van de tracking beschreven in Gershow et al. gebruikt elektronisch gestuurde kleppen te handhaven van een stabiel verloop van geur in de gedrag arena8. Echter, als gevolg van het niveau van complexe engineering betrokken te bouwen de geur stimulans setup, deze methode is moeilijk te repliceren in andere laboratoria. Verder, de kwesties met betrekking tot het gebruik van odorant specifiek het activeren van één ORNs onopgelost blijven. De bepaling van de tracking beschreven in Mathew et al. een eenvoudigere geur leveringssysteem gebruikt, maar de resulterende geur verloop is afhankelijk van de volatiliteit van de test odorant en is instabiel voor lange duur van de test1. Dus, door vervanging van geur stimuli met lichte prikkels, onze methode kent de voordelen van specificiteit en nauwkeurige temporele controle van ORN activering en is niet afhankelijk van de vorming van geur gradiënten van verschillende weerstandsniveau’s.
Onze methode is gemakkelijk aan opstelling en is geschikt voor onderzoekers kochten meten van aspecten van Drosophila larvale navigatie. Deze techniek kan worden aangepast aan andere modelsystemen, mits de onderzoeker in staat om te rijden de expressie van CsChrimson in hun favoriete systeem neuron(s) van keuze is. CsChrimson is een rood-verschoven versie van kanaal rodopsine. Het is geactiveerd bij golflengten die onzichtbaar voor de larve van phototaxis systeem zijn. Daarom zijn wij kundig voor het manipuleren van de activiteit van neuronen met specificiteit, betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid9. Door aanpassing van de maat geschreven software ter verantwoording voor formaatwijzigingen van de onderwerpen, kan deze methode gemakkelijk worden aangepast voor kruipen larven van andere insecten soorten.
Protocol
Representative Results
Discussion
We beschreven hier, een methode die het mogelijk voor de meting van Drosophila larvale gedrag in reactie op de activering van de gelijktijdige optogenetic van olfactorische neuronen maakt. Eerder beschreven larvale bijhouden methoden1,8 verschillende geur levering technologie gebruiken om te activeren ORNs. Echter controle geen over deze methodes voor zowel de specificiteit of temporele patronen van ORN activering. Onze methode overwint deze tekorten met…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door opstarten middelen uit de University of Nevada in Reno en NIGMS van het National Institute of Health onder grant nummer P20 GM103650.
Materials
| Video camera to capture larval movement | |||
| CCD Camera | Edmund Optics | 106215 | |
| M52 to M55 Filter Thread Adapter | Edmund Optics | 59-446 | |
| 2" Square Threaded Filter Holder for Imaging Lenses | Edmund Optics | 59-445 | |
| RG-715, 2" Sq. Longpass Filter | Edmund Optics | 46-066 | |
| Electronics for optogenetic setup | |||
| Raspberry Pi 2B | RASPBERRY-PI.org | RPI2-MODB-V1.2 | |
| 3 Channel programmable power supply | newegg.com | 9SIA3C62037092 | |
| 8 Channel optocoupler relay | amazon.com | 6454319 | |
| 630nm Quad-row LED strip lights | environmentallights.com | red3528-450-reel | |
| 850nm LED strips | environmentallights.com | wp-4000K-CC5050-60×2-kit | |
| Software | |||
| Matlab | Mathworks Inc. | ||
| Ubuntu MATE v16.04 | Nubuntu | https://github.com/yslo/nubuntu | |
| Other items | |||
| Plexiglass black acrylic | Home Depot | MC1184848bl | |
| Fly food and other reagents | |||
| Nutrifly fly food | Genesee Scientific | 66-112 | |
| Agarose powder | Genesee Scientific | 20-102 | |
| 22cm X 22cm square petri-dish | VWR Inc. | 25382-327 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
| All trans-retinal | Sigma-Aldrich | R2500 | |
| Flies | |||
| UAS-IVS-CsChrimson | Bloomington Drosophila Stock Center | 55134 | |
| Orco-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 26818 | |
| Or42a-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 9970 | |
| Or7a-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 23907 |
References
- Mathew, D., et al. Functional diversity among sensory receptors in a Drosophila olfactory circuit. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 2134-2143 (2013).
- Ramaekers, A., et al. Glomerular maps without cellular redundancy at successive levels of the Drosophila larval olfactory circuit. Current biology : CB. 15, 982-992 (2005).
- Couto, A., Alenius, M., Dickson, B. Molecular, anatomical, and functional organization of the Drosophila olfactory system. Current biology : CB. 15, 1535-1547 (2005).
- Kreher, S. A., Kwon, J. Y., Carlson, J. R. The molecular basis of odor coding in the Drosophila larva. Neuron. 46, 445-456 (2005).
- Kreher, S. A., Mathew, D., Kim, J., Carlson, J. R. Translation of sensory input into behavioral output via an olfactory system. Neuron. 59, 110-124 (2008).
- Hallem, E. A., Carlson, J. R. Coding of odors by a receptor repertoire. Cell. 125, 143-160 (2006).
- Monte, P., et al. Characterization of the larval olfactory response in Drosophila and its genetic basis. Behav Genet. 19, 267-283 (1989).
- Gershow, M., et al. Controlling airborne cues to study small animal navigation. Nature methods. 9, 290-296 (2012).
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature methods. 11, 338-346 (2014).
- Hernandez-Nunez, L., et al. Reverse-correlation analysis of navigation dynamics in Drosophila larva using optogenetics. eLife. 4, (2015).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Kabra, M., Robie, A. A., Rivera-Alba, M., Branson, S., Branson, K. JAABA: interactive machine learning for automatic annotation of animal behavior. Nature methods. 10, 64-67 (2013).
- Newquist, G., Novenschi, A., Kohler, D., Mathew, D. Differential contributions of Olfactory Receptor Neurons in a Drosophila olfactory circuit. eNeuro. 3, (2016).
- Schulze, A., et al. Dynamical feature extraction at the sensory periphery guides chemotaxis. eLife. 4, (2015).
- Tastekin, I., et al. Role of the Subesophageal Zone in Sensorimotor Control of Orientation in Drosophila Larva. Current Biology. 25, 1448-1460 (2015).
- Famiglietti, E. V., Kolb, H. Structural basis for ON-and OFF-center responses in retinal ganglion cells. Science. 194, 193-195 (1976).
- Luo, L., et al. Bidirectional thermotaxis in Caenorhabditis elegans is mediated by distinct sensorimotor strategies driven by the AFD thermosensory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 2776-2781 (2014).
- Berck, M. E., et al. The wiring diagram of a glomerular olfactory system. eLife. 5, (2016).
