Summary

Tracking von Drosophila Larven Verhalten als Reaktion auf optogenetische Stimulation der olfaktorischen Neuronen

Published: March 21, 2018
doi:

Summary

Dieses Protokoll analysiert Navigations Verhalten von Drosophila Larve in Reaktion auf die gleichzeitige optogenetische Stimulation der olfaktorischen Neuronen. 630 nm Wellenlänge wird verwendet, um einzelne olfaktorischen Neuronen mit dem Ausdruck einer rot-verschoben Kanal Rhodopsin zu aktivieren. Larval Bewegung gleichzeitig verfolgt, digital erfasst und mit individuell geschriebenen Software analysiert.

Abstract

Die Fähigkeit der Insekten zu navigieren in Richtung Geruch Quellen basiert auf die Aktivitäten von ihr erster Ordnung olfaktorischen Rezeptor Neuronen (ORNs). Während eine beträchtliche Menge an Informationen über ORN Antworten auf Geruchsstoffe generiert wurde, bleibt die Rolle der spezifischen ORNs in Fahrt Verhaltensreaktionen schlecht verstanden. Komplikationen bei Verhalten Analysen entstehen durch verschiedene Volatilitäten von Geruchsstoffen, die einzelnen ORNs, mehrere ORNs durch einzelne Riechstoffe und die Schwierigkeit bei der Replikation natürlich beobachteten zeitlicher Variationen in olfaktorische Reize mit aktiviert aktivieren konventionelle Geruch-Liefermethoden im Labor. Hier beschreiben wir eine Protokoll, die Drosophila Larven Verhalten in Reaktion auf die gleichzeitige optogenetische Stimulation von seiner ORNs analysiert. Die hier verwendete optogenetische-Technologie ermöglicht Spezifität der ORN Aktivierung und präzise Steuerung der zeitlichen Muster der ORN Aktivierung. Entsprechenden Larven Bewegung wird nachverfolgt, digital erfasst und mit individuell erstellten Software analysiert. Geruch-Reize durch Lichtreize ersetzen, ermöglicht diese Methode für eine präzisere Steuerung der einzelnen ORN Aktivierung um ihre Auswirkungen auf die Larven Verhalten zu studieren. Unsere Methode konnte weiter ausgebaut werden, um die Auswirkungen von zweiter Ordnung Projektion Neuronen (PNs) sowie lokale Neuronen (LNs) auf Larven Verhalten zu untersuchen. Diese Methode ermöglicht somit eine umfassende Dissektion der olfaktorischen Schaltung Funktion und Ergänzung Studien wie olfaktorischen Neuronen Aktivitäten übersetzen im Verhalten Antworten.

Introduction

Olfaktorische Informationen in eine Drosophila Larve Umgebung ist von nur 21 funktional unterschiedliche ORNs, die Aktivitäten spürte davon letztlich Larven Verhalten1,2,3,4bestimmen. Jedoch ist relativ wenig über die Logik bekannt durch die sensorischer Informationen an den Aktivitäten der diese 21 ORNs codiert ist. Es muss somit die funktionale Beiträge jedes Larven ORN Verhalten experimentell zu messen.

Obwohl das sensorische Reaktionsschema des gesamten Repertoires von Drosophila Larven ORNs in Detail1,4,5, die Beiträge der einzelnen ORNs, die olfaktorische Schaltung und damit untersucht worden Navigations Verhalten bleiben weitgehend unbekannt. Schwierigkeiten im Larvenstadium Verhalten Studien bisher aufgrund der Unfähigkeit, räumlich und zeitlich einzelne ORNs aktivieren. Ein Gremium von Geruchsstoffen, die speziell 19 der 21 Drosophila Larven ORNs aktivieren wurde kürzlich beschriebenen1. Jeder Geruchsstoff im Bereich bei niedrigen Konzentrationen löst eine physiologische Reaktion nur von seinen Verwandten ORN. Jedoch bei höheren Konzentrationen, die normalerweise für konventionelle Verhalten Assays verwendet werden, löst jeder Geruchsstoff physiologische Reaktionen von mehreren ORNs1,5,6. Darüber hinaus haben Geruchsstoffe in diesem Panel Volatilitäten variiert, die Interpretation von Verhalten Studien erschweren, die Bildung von stabilen Geruch Gradienten7,8abhängen. Zu guter Letzt müssen natürlich auftretenden Geruch Reize eine zeitliche Komponente, die schwer unter Laborbedingungen nachzuahmen ist. Es ist daher wichtig, eine Methode zu entwickeln, die Larven Verhalten messen kann, während gleichzeitig individuelle ORNs in einer räumlichen und zeitlichen Weise aktivieren.

Hier zeigen wir, dass eine Methode, die Vorteile gegenüber den zuvor beschriebenen Larven Tracking hat1,8Proben. Der Tracking-Test in Gershow Et Al. beschrieben verwendet weiterhin ein stabiles Gefälle von Geruch im Verhalten Arena8elektronisch gesteuerte Ventile. Aufgrund der komplexen Technik beteiligt, die Geruch Reiz Einrichtung zu bauen, ist diese Methode jedoch schwierig, in anderen Labors zu replizieren. Weitere, ungelöste Fragen zur Verwendung von Geruchsstoffen, gezielt einzelne ORNs aktivieren. Die Tracking-Assay in Mathew Et Al. beschrieben verwendet ein einfacheres Geruch-Delivery-System, aber die resultierende Geruch Steigung ist abhängig von der Volatilität der Test Geruchsstoff und ist instabil für lange Laufzeiten der Assay-1. So Geruch Impulse durch Lichtreize ersetzen, unsere Methode hat die Vorteile der Spezifität und präzise zeitliche Steuerung der ORN Aktivierung und richtet sich nicht auf die Bildung von Geruch Gradienten in verschiedenen stärken.

Unsere Methode ist einfach einzurichten und eignet sich für Forscher interessiert Aspekte der Drosophila Larven Navigation zu messen. Diese Technik könnte zu Fremdsystemen Modell angepasst werden, vorausgesetzt, dass die Forscher in der Lage, die Expression von CsChrimson in ihre Lieblings-System Neuron(s) Wahl zu fahren ist. CsChrimson ist ein rot-verschoben Version des Kanals Rhodopsin. Die Aktivierung erfolgt bei Wellenlängen, die für die Larve Phototaxis System unsichtbar sind. Wir sind daher in der Lage, die Aktivität der Neuronen mit Genauigkeit, Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit9zu manipulieren. Durch Ändern der individuell erstellten Software um Größenänderungen der Themen Rechnung zu tragen, könnte diese Methode leicht kriechende Larven von anderen Insektenarten angepasst werden.

Protocol

1. Aufbau einer Verhalten-Arena und Vorbereitung Hardware optogenetische Stimulation im Bereich Verhalten aktivieren Um eine Licht-beraubt Verhalten-Arena zu bauen, bauen eine Box mit einer Dimension von 89 x 61 x 66 cm3 (35″ L x 24″ W x 26″ H) machte der schwarze farbige Plexiglas Acrylplatten (3 mm dick) (siehe Tabelle der Materialien). Materialien zu bauen so eine Box sollte bei lokalen Baumärkten erhältlich. Legen Sie dieses Feld auf eine Tischplatte im Verhalten Raum (<strong …

Representative Results

Um die Besonderheit der ORN Aktivierung zu demonstrieren, unsere Methode wurde erfolgreich angewandt, um die Auswirkungen von zwei verschiedenen ORN (ORN::7a & ORN::42a) bestimmen (ORNs auszudrücken, entweder Or7a oder Or42a) Aktivierung auf Larven Verhalten (Abbildung 3). Neuere Studien, dass einzelne Larven ORNs entsprechen funktional unterschiedliche1,10,13, unse…

Discussion

Wir hier eine Methode, die für die Messung von Drosophila Larven Verhalten als Reaktion auf gleichzeitige optogenetische Aktivierung der olfaktorischen Neuronen ermöglicht. Zuvor beschriebenen Larven tracking Methoden1,8 verwenden verschiedene Geruch-Delivery-Technologie um ORNs zu aktivieren. Jedoch können diese Methoden für die Spezifität oder zeitlichen Muster der ORN Aktivierung nicht kontrollieren. Unsere Methode überwindet diese Defizite durc…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde von Startup-Fonds von der University of Nevada, Reno und NIGMS des National Institute of Health unter Grant-Nummer P20 GM103650 unterstützt.

Materials

Video camera to capture larval movement
CCD Camera  Edmund Optics 106215
M52 to M55 Filter Thread Adapter Edmund Optics 59-446
2" Square Threaded Filter Holder for Imaging Lenses  Edmund Optics 59-445
RG-715, 2" Sq. Longpass Filter Edmund Optics 46-066
Electronics for optogenetic setup
Raspberry Pi 2B RASPBERRY-PI.org RPI2-MODB-V1.2
3 Channel programmable power supply newegg.com 9SIA3C62037092
8 Channel optocoupler relay amazon.com 6454319
630nm Quad-row LED strip lights environmentallights.com red3528-450-reel
850nm LED strips environmentallights.com wp-4000K-CC5050-60×2-kit
Software 
Matlab Mathworks Inc.
Ubuntu MATE v16.04 Nubuntu https://github.com/yslo/nubuntu
Other items
Plexiglass black acrylic Home Depot MC1184848bl
Fly food and other reagents
Nutrifly fly food Genesee Scientific 66-112
Agarose powder Genesee Scientific 20-102
22cm X 22cm square petri-dish VWR Inc. 25382-327
DMSO Sigma-Aldrich D2650
Sucrose Sigma-Aldrich 84097
All trans-retinal Sigma-Aldrich R2500
Flies
UAS-IVS-CsChrimson  Bloomington Drosophila Stock Center 55134
Orco-Gal4 Bloomington Drosophila Stock Center 26818
Or42a-Gal4 Bloomington Drosophila Stock Center 9970
Or7a-Gal4 Bloomington Drosophila Stock Center 23907

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Cite This Article
Clark, D. A., Kohler, D., Mathis, A., Slankster, E., Kafle, S., Odell, S. R., Mathew, D. Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons. J. Vis. Exp. (133), e57353, doi:10.3791/57353 (2018).

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