מעקב אחר התנהגות זחל דרוזופילה בתגובה Optogenetic גירוי של חוש הריח נוירונים
Summary
פרוטוקול זה מנתח התנהגות ניווט של זחל דרוזופילה בתגובה optogenetic בו זמנית גירוי של נוירונים חוש הריח שלו. אור של 630 ננומטר אורך גל משמש כדי להפעיל את חוש הריח נוירונים בודדים לבטא של אופסין # רודופסין אדום-העביר ערוץ. תנועת הזחל מתבצע בו זמנית, רשמה דיגיטלית, נותחה באמצעות תוכנה מותאמת אישית-נכתב.
Abstract
היכולת של חרקים כדי לנווט כלפי מקורות ריח מבוסס על הפעילות של הנוירונים שלהם קולטני ריח מסדר ראשון (ORNs). בעוד כמות ניכרת של מידע נוצרה בנוגע ולהתמכר התגובות odorants, תפקיד ספציפי ORNs נהיגה תגובות התנהגותיות נשאר ממעטים להבין. להתעורר סיבוכים בניתוח התנהגות עקב volatilities שונים של odorants להפעיל ORNs בודדים, ORNs מרובים מופעל על ידי יחיד odorants, ואת הקושי באופן טבעי שנצפה טמפורלית בווריאציות גירויים חוש הריח באמצעות שכפול שיטות קונבנציונאלי ריח-מסירה במעבדה. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול מנתח התנהגות זחל דרוזופילה בתגובה optogenetic בו זמנית גירוי של ORNs שלה. הטכנולוגיה optogenetic המשמש כאן מאפשר ירידה לפרטים של הפעלת ולהתמכר שליטה מדויקת של דפוסי הטמפורלי של הפעלת ולהתמכר. תנועת הזחל המתאימה מתבצע מעקב אחר רשמה דיגיטלית, נותחה באמצעות כתב תוכנה מותאמת אישית. על-ידי החלפת ריח גירויים גירויים קלים, שיטה זו מאפשרת שליטה מדויקת יותר של הפעלת ולהתמכר בודדים ללימוד השפעתה על התנהגות זחל. השיטה שלנו יכול ניתן להרחיב הלאה לחקור את ההשפעה של נוירונים מסדר שני הקרנה (מערכת העצבים ההיקפית) כמו גם המקומי נוירונים (ההגירה) על התנהגות זחל. שיטה זו ובכך יאפשר ניתוח מקיף של פונקציה מעגל חוש הריח, המשלים מחקרים על פעילויות נוירון איך הריח לתרגם להתנהגות תגובות.
Introduction
חוש הריח מידע בסביבה של זחל דרוזופילה הוא חש מאת רק 21 ORNs נפרדים פונקציונלית, הפעילויות אשר בסופו של דבר לקבוע את התנהגות זחל1,2,3,4. ובכל זאת, יחסית מעט מאוד ידוע על ההיגיון שלפיו מקודד מידע חושי בפעילויות של אלה ORNs 21. לכן יש צורך למדוד השפעול תרומות פונקציונלי של כל ולהתמכר זחל להתנהגות.
למרות הפרופיל תגובה חושית של רפרטואר שלם של ORNs הזחל דרוזופילה נחקרה פרט1,4,5, התרומות של בודדים ORNs המעגל חוש הריח, ובכך התנהגות ניווט נשאר ברובו לא ידוע. קשיים במחקרים התנהגות זחל, עולות עד כה, עקב חוסר יכולת להפעיל במרחב של חנותם ORNs יחיד. פאנל של odorants במיוחד להפעיל 19 של דרוזופילה 21 הזחל ORNs היה תיאר לאחרונה1. כל odorant בחלונית ‘, בריכוזים נמוכים, מעורר תגובה פיזיולוגית בלבד ולהתמכר cognate שלה. עם זאת, בריכוזים גבוהים המשמשים בדרך כלל עבור מבחני התנהגות המקובלת, כל odorant מעורר תגובות פיזיולוגיות מרובים ORNs1,5,6. עוד יותר, odorants בחלונית זו יש מגוון volatilities זה יסבך את הפרשנות של לימודי התנהגות תלויים היווצרות ריח יציב מעברי צבע7,8. לבסוף, באופן טבעי המתרחשים גירויים ריח יש רכיב טמפורלית שקשה לשחזר בתנאי מעבדה. לכן חשוב לפתח שיטה שיכול למדוד התנהגות זחל כאשר בו זמנית הפעלתי ORNs בודדים באופן מרחבי טמפורלית.
. הנה, נדגים שיטה בעלת יתרונות על פני מעקב זחל שתואר לעיל מבחני1,8. וזמינותו מעקב המתוארים Gershow. et al. משתמש שסתומים מבוקר אלקטרונית כדי לשמור על מעבר צבע יציב של ריח ארנה התנהגות8. עם זאת, בשל רמת מעורב לבנות הגדרת גירוי ריח מורכבים הנדסה, שיטה זו קשה לשכפל במעבדות אחרות. יתרה מזאת, הנושאים הקשורים לשימוש odorants להפעלת במיוחד ORNs יחיד נותרו בלתי פתורות. וזמינותו מעקב שמתואר מתיו. ואח משתמש במערכת המסירה ריח פשוט יותר, אך מעבר הצבע ריח וכתוצאה מכך תלויה התנודתיות של מבחן odorant יציב עבור משך זמן של assay1. לפיכך, על-ידי החלפת ריח גירויים גירויים קלים, השיטה שלנו יש את היתרונות של ירידה לפרטים, שליטה מדויקת הטמפורלי של הפעלת ולהתמכר ואינה תלויה היווצרות ריח מעברי צבע בעלי חוזק שונה.
השיטה שלנו היא קל להגדיר, והוא מתאים מהחוקרים המעוניינים מדידה היבטים של ניווט זחל דרוזופילה . טכניקה זו יכולה להתאים למערכות אחרות דגם ובלבד החוקר הוא מסוגל לנהוג הביטוי של CsChrimson ב neuron(s) של המערכת האהוב שלהם להתמקד. CsChrimson היא גרסה אדום-העביר של אופסין # רודופסין ערוץ. . זה הופעל באורכי גל כי הם בלתי נראים למערכת phototaxis של הזחל . אנחנו ולכן יכולים לתמרן את פעילות הנוירונים עם ירידה לפרטים, אמינות וצריכת הפארמצבטית9… על-ידי שינוי המנהג לכתוב תוכנה לקחת בחשבון שינויים בגודל של הנושאים, שיטה זו יכול בקלות להיות מותאם עבור הזחלים סריקה של מינים חרקים אחרים.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן, אנחנו תיאר שיטה המאפשרת לשקילת דרוזופילה התנהגות זחל בתגובה optogenetic בו זמנית ההפעלה של נוירונים חוש הריח. שתואר קודם לכן זחל מעקב אחר שיטות1,8 להשתמש בטכנולוגיה משלוח ריח שונה כדי להפעיל את ORNs. עם זאת, שיטות אלה לא יכולים לשלוט על ירידה לפרטים או דפוס?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי אתחול בכספי האוניברסיטה של נבאדה, רינו ועל ידי NIGMS של המכון הלאומי לבריאות תחת גרנט מספר P20 GM103650.
Materials
| Video camera to capture larval movement | |||
| CCD Camera | Edmund Optics | 106215 | |
| M52 to M55 Filter Thread Adapter | Edmund Optics | 59-446 | |
| 2" Square Threaded Filter Holder for Imaging Lenses | Edmund Optics | 59-445 | |
| RG-715, 2" Sq. Longpass Filter | Edmund Optics | 46-066 | |
| Electronics for optogenetic setup | |||
| Raspberry Pi 2B | RASPBERRY-PI.org | RPI2-MODB-V1.2 | |
| 3 Channel programmable power supply | newegg.com | 9SIA3C62037092 | |
| 8 Channel optocoupler relay | amazon.com | 6454319 | |
| 630nm Quad-row LED strip lights | environmentallights.com | red3528-450-reel | |
| 850nm LED strips | environmentallights.com | wp-4000K-CC5050-60×2-kit | |
| Software | |||
| Matlab | Mathworks Inc. | ||
| Ubuntu MATE v16.04 | Nubuntu | https://github.com/yslo/nubuntu | |
| Other items | |||
| Plexiglass black acrylic | Home Depot | MC1184848bl | |
| Fly food and other reagents | |||
| Nutrifly fly food | Genesee Scientific | 66-112 | |
| Agarose powder | Genesee Scientific | 20-102 | |
| 22cm X 22cm square petri-dish | VWR Inc. | 25382-327 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
| All trans-retinal | Sigma-Aldrich | R2500 | |
| Flies | |||
| UAS-IVS-CsChrimson | Bloomington Drosophila Stock Center | 55134 | |
| Orco-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 26818 | |
| Or42a-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 9970 | |
| Or7a-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 23907 |
References
- Mathew, D., et al. Functional diversity among sensory receptors in a Drosophila olfactory circuit. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 2134-2143 (2013).
- Ramaekers, A., et al. Glomerular maps without cellular redundancy at successive levels of the Drosophila larval olfactory circuit. Current biology : CB. 15, 982-992 (2005).
- Couto, A., Alenius, M., Dickson, B. Molecular, anatomical, and functional organization of the Drosophila olfactory system. Current biology : CB. 15, 1535-1547 (2005).
- Kreher, S. A., Kwon, J. Y., Carlson, J. R. The molecular basis of odor coding in the Drosophila larva. Neuron. 46, 445-456 (2005).
- Kreher, S. A., Mathew, D., Kim, J., Carlson, J. R. Translation of sensory input into behavioral output via an olfactory system. Neuron. 59, 110-124 (2008).
- Hallem, E. A., Carlson, J. R. Coding of odors by a receptor repertoire. Cell. 125, 143-160 (2006).
- Monte, P., et al. Characterization of the larval olfactory response in Drosophila and its genetic basis. Behav Genet. 19, 267-283 (1989).
- Gershow, M., et al. Controlling airborne cues to study small animal navigation. Nature methods. 9, 290-296 (2012).
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature methods. 11, 338-346 (2014).
- Hernandez-Nunez, L., et al. Reverse-correlation analysis of navigation dynamics in Drosophila larva using optogenetics. eLife. 4, (2015).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Kabra, M., Robie, A. A., Rivera-Alba, M., Branson, S., Branson, K. JAABA: interactive machine learning for automatic annotation of animal behavior. Nature methods. 10, 64-67 (2013).
- Newquist, G., Novenschi, A., Kohler, D., Mathew, D. Differential contributions of Olfactory Receptor Neurons in a Drosophila olfactory circuit. eNeuro. 3, (2016).
- Schulze, A., et al. Dynamical feature extraction at the sensory periphery guides chemotaxis. eLife. 4, (2015).
- Tastekin, I., et al. Role of the Subesophageal Zone in Sensorimotor Control of Orientation in Drosophila Larva. Current Biology. 25, 1448-1460 (2015).
- Famiglietti, E. V., Kolb, H. Structural basis for ON-and OFF-center responses in retinal ganglion cells. Science. 194, 193-195 (1976).
- Luo, L., et al. Bidirectional thermotaxis in Caenorhabditis elegans is mediated by distinct sensorimotor strategies driven by the AFD thermosensory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 2776-2781 (2014).
- Berck, M. E., et al. The wiring diagram of a glomerular olfactory system. eLife. 5, (2016).
