Il comportamento larvale della drosofila in risposta alla stimolazione optogenetica dei neuroni olfattivi di rilevamento
Summary
Questo protocollo analizza il comportamento di navigazione di Drosophila larva in risposta alla stimolazione simultanea optogenetica dei suoi neuroni olfattivi. Luce di lunghezza d’onda di 630 nm viene utilizzata per attivare i singoli neuroni olfattivi, esprimendo una rodopsina canale rosso-spostato. Larvale movimento viene registrato contemporaneamente, registrato in digitale e analizzati utilizzando il software personalizzato.
Abstract
La capacità degli insetti di navigare verso le fonti di odore si basa sulle attività del loro primo ordine neuroni olfattivi (ORNs). Mentre una notevole quantità di informazioni è stata generata per quanto riguarda ORN risposte a odoranti, il ruolo di specifici ORNs in risposte comportamentali di guida rimane capito male. Complicanze nelle analisi di comportamento derivano a causa della diversa volatilità di odorizzazione che attivano ORNs singole, multiple ORNs attivato dal singolo odoranti e la difficoltà nella replica naturalmente osservate variazioni temporali in stimoli olfattivi utilizzando metodi convenzionali odore-consegna in laboratorio. Qui, descriviamo un protocollo che analizza il comportamento larvale della drosofila in risposta alla stimolazione simultanea optogenetica di sua ORNs. La tecnologia optogenetica qui permette per la specificità di attivazione ORN e un controllo preciso del pattern temporale di attivazione ORN. Corrispondente movimento larvale viene tenuta traccia, digitalmente registrati e analizzati utilizzando scritta software personalizzata. Sostituendo gli stimoli odore con stimoli leggeri, questo metodo consente un controllo più preciso di attivazione ORN individuale al fine di studiare il suo impatto sul comportamento larvale. Il nostro metodo potrebbe essere esteso a studiare l’impatto dei neuroni di proiezione di secondo ordine (PNs) così come i neuroni locali (LNs) sul comportamento larvale. Questo metodo permetterà dunque una dissezione completa della funzione olfattiva circuito e complemento studi sulle attività del neurone olfattivo come traducono risposte di comportamento.
Introduction
Informazioni olfattive in ambiente di una larva di Drosophila sono percepite dal solo 21 ORNs funzionalmente distinte, le attività di cui in definitiva determinare comportamento larvale1,2,3,4. Ancora, relativamente piccolo è conosciuto circa la logica con cui informazioni sensoriali sono codificate nelle attività di questi 21 ORNs. C’è quindi la necessità di misurare sperimentalmente i contributi funzionali di ogni ORN larvale di comportamento.
Anche se il profilo di risposta sensoriale di tutto il repertorio di Drosophila larvale ORNs è stato studiato in dettaglio1,4,5, i contributi dei singoli ORNs al circuito olfattivo e quindi a comportamento di navigazione rimangono in gran parte sconosciuti. Difficoltà negli studi di comportamento larvale, finora, a causa dell’incapacità spazialmente e temporalmente attivare singole ORNs. Un pannello di odorizzazione che specificamente attivare 19 del 21 ORNs larvale di Drosophila è stata recentemente descritta1. Ogni odorant nel pannello, a basse concentrazioni, suscita una risposta fisiologica solo da sue cognate ORN. Tuttavia, a concentrazioni più elevate che sono normalmente utilizzati per le analisi di comportamento convenzionale, ogni odorant suscita risposte fisiologiche da più ORNs1,5,6. Ulteriormente, odoranti in questo pannello hanno variato le volatilità che complicano l’interpretazione degli studi di comportamento che dipendono dalla formazione di odore stabile pendenze7,8. Infine, gli stimoli d’avvenimento di odore hanno naturalmente un componente temporale che è difficile da replicare in condizioni di laboratorio. Pertanto è importante sviluppare un metodo che può misurare il comportamento larvale durante l’attivazione simultanea di ORNs individuali in modo spaziale e temporale.
Qui, dimostriamo che un metodo che presenta i vantaggi sopra precedentemente descritto rilevamento larvale dosaggi1,8. L’analisi di rilevamento descritto in Gershow et al. utilizza valvole controllate elettronicamente per mantenere un gradiente stabile di odore nel comportamento arena8. Tuttavia, a causa del livello di ingegneria complesso coinvolto costruire il setup di stimolo di odore, questo metodo è difficile da replicare in altri laboratori. Ulteriormente, i problemi relazionati all’utilizzo odoranti specificamente attivare singole ORNs rimangono irrisolti. L’analisi di rilevamento descritto in Mathew et al. utilizza un sistema di consegna di odore più semplice, ma la pendenza risultante di odore è dipenda dalla volatilità dei test odorant ed è instabile per lunghi periodi di analisi1. Così, sostituendo gli stimoli odore con stimoli leggeri, il nostro metodo ha i vantaggi della specificità e preciso controllo temporale di attivazione ORN e non è dipendente da formazione di gradienti di odore di diversi punti di forza.
Il nostro metodo è facile da configurare ed è adatto per i ricercatori interessati a misurare gli aspetti della navigazione larvale della drosofila . Questa tecnica potrebbe essere adattata ad altri sistemi di modello purché il ricercatore è in grado di guidare l’espressione di CsChrimson in neuron(s) del loro sistema preferito di scelta. CsChrimson è una versione del rhodopsin canale rosso-spostato. Si attiva a lunghezze d’onda che è invisibili al sistema fototassi di larva. Siamo quindi in grado di manipolare l’attività dei neuroni con specificità, affidabilità e riproducibilità9. Modificando l’usanza scritto software per tenere conto di modifiche delle dimensioni degli oggetti, questo metodo potrebbe essere facilmente adattato per la ricerca per indicizzazione larve di altre specie di insetti.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui, abbiamo descritto un metodo che consente la misurazione di Drosophila comportamento larvale in risposta all’attivazione di optogenetica simultanea dei neuroni olfattivi. Precedentemente descritto larvale metodi1,di rilevamento8 utilizzano la tecnologia di consegna di odore diverso per attivare ORNs. Tuttavia, questi metodi non possono controllare per la specificità o un pattern temporale di attivazione ORN. Il nostro metodo supera questi deficit ut…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da fondi di avvio dall’Università del Nevada, Reno e da NIGMS del National Institute of Health, sotto concessione numero P20 GM103650.
Materials
| Video camera to capture larval movement | |||
| CCD Camera | Edmund Optics | 106215 | |
| M52 to M55 Filter Thread Adapter | Edmund Optics | 59-446 | |
| 2" Square Threaded Filter Holder for Imaging Lenses | Edmund Optics | 59-445 | |
| RG-715, 2" Sq. Longpass Filter | Edmund Optics | 46-066 | |
| Electronics for optogenetic setup | |||
| Raspberry Pi 2B | RASPBERRY-PI.org | RPI2-MODB-V1.2 | |
| 3 Channel programmable power supply | newegg.com | 9SIA3C62037092 | |
| 8 Channel optocoupler relay | amazon.com | 6454319 | |
| 630nm Quad-row LED strip lights | environmentallights.com | red3528-450-reel | |
| 850nm LED strips | environmentallights.com | wp-4000K-CC5050-60×2-kit | |
| Software | |||
| Matlab | Mathworks Inc. | ||
| Ubuntu MATE v16.04 | Nubuntu | https://github.com/yslo/nubuntu | |
| Other items | |||
| Plexiglass black acrylic | Home Depot | MC1184848bl | |
| Fly food and other reagents | |||
| Nutrifly fly food | Genesee Scientific | 66-112 | |
| Agarose powder | Genesee Scientific | 20-102 | |
| 22cm X 22cm square petri-dish | VWR Inc. | 25382-327 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
| All trans-retinal | Sigma-Aldrich | R2500 | |
| Flies | |||
| UAS-IVS-CsChrimson | Bloomington Drosophila Stock Center | 55134 | |
| Orco-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 26818 | |
| Or42a-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 9970 | |
| Or7a-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 23907 |
References
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