Summary
Мы предлагаем протокол расширения клетки на Макропористые microcarriers и их использования в качестве системы доставки в биореакторе перфузии заполнить матрицу decellularized ткани. Мы также включать различные методы для определения клеточной пролиферации и жизнеспособность клеток, культивируемых на microcarriers. Кроме того мы демонстрируем функциональность клеток после биореактор культур.
Abstract
Тканевая инженерия является многообещающей областью, сосредоточена на разработке решений для растущего спроса на относительно целей трансплантации органов и тканей. Процесс для создания таких тканей является сложным и включает соответствующую комбинацию типов конкретных клеток, подмости и физическое или биохимических стимулы для руководства клеточный рост и дифференциацию. Microcarriers представляют собой привлекательный инструмент для расширения клеток в трехмерное (3D) микроокружения, поскольку они обеспечивают более высокие поверхности для соотношения объема и более тесно имитировать ситуации в естественных условиях , по сравнению с традиционными методами двумерной. Сосудистой системы, поставку кислорода и питательных веществ к клеткам и обеспечения удаления отходов, является важным строительным блоком при генерации инженерии тканей. В самом деле большинство конструкций не после имплантированных ввиду отсутствия сосудистой поддержки. В этом исследовании мы представляем собой протокол для расширения эндотелиальных клеток на рекомбинантных коллагена основе microcarriers в динамических условиях в колбу спиннер и биореакторов, и мы объясним, как определить этот параметр жизнеспособность клеток и функциональности. Кроме того мы предлагаем метод для доставки клеток для целей васкуляризации без дополнительных отряд необходимые шаги. Кроме того мы предоставляем стратегию оценки клетки васкуляризации потенциал в биореакторе перфузии на матрицу decellularized биологических. Мы считаем, что использование представленных методов может привести к разработке новых методов лечения на основе ячеек для большого спектра тканей, инженерных приложений в клинической практике.
Introduction
Одна общая проблема в инженерных приложениях ткани необходимо приносить высокий клеточной массы с фенотипом правильным дифференциация на месте. Применение microcarriers для решения этого вопроса началась в 1967 году с увеличением значение на сегодняшний день в таких областях, как ортопедические тканевой инженерии для крупномасштабных поколения кожи, костей, хрящей и сухожилий1. Они позволяют обработку адэрентных культур способами аналогична подвеска культур2 путем расширения клетки на микромасштабной трехмерные (3D) подложках. Таким образом клетки опыт однородной питательных и ячейки матрицы взаимодействий, что приводит к более эффективного обслуживания в естественных условияхдифференциации4 3,, который часто теряется во времени в 2D приближается к5. Более высокий коэффициент поверхности тома - в конечном итоге приводит к выше ячейке урожайность6,7, выше газа и питательных обменных курсов, сравнивая статических систем8, возможность регулировать и подлежащих физической культуры раздражители9и потенциал для дальнейшего развития процесса расширения7 далее являются преимущества. Некоторые функции, такие как диаметр, плотность, пористость, поверхности заряд и адгезии свойства10,11 различать различные коммерчески доступных микро - и макро перевозчиков. Однако одним из главных преимуществ является их поставка, потенциал как microtissues сайт дефекта или спроса.
Для применения microcarrier технологии в кости тканевой инженерии, мы показано в предыдущем докладе12 производства из новой microcarrier типа представляют собой рекомбинантные коллагена я пептида (RCP, коммерчески доступных как Cellnest). Этот новый microcarrier позволяет GMP-совместимый до масштабирование подмости и ячейки производства, необходимые для доставки клеток в клинической ситуации. В этом контексте тюнинг эшафот стабильности, степень деградации и свойств поверхности путем правильного выбора стратегии подходит сшивки позволяет адаптировать технику для выбранного приложения, ячейки тип интереса или целевой ткани13. В частности потенциал занятости этой microcarrier как инъекционные ячейки системы доставки для терапевтического применения14 делает их особенно интересными в клинических условиях.
В этой статье мы поэтому иллюстрируют культивирования процедура изоляции и расширение человеческих костного мозга-производные мезенхимальных стромальных клеток (hBMSCs) и человеческого кожного микрососудистой эндотелиальных клеток (HDMECs) на коллаген я-на основе рекомбинантной на основе пептида microcarriers и их подготовка для доставки в клинических условиях. Кроме того мы описываем дополнительные протоколы, полезных для поддержания жизнеспособности клеток после имплантации.
Жизнеспособность клеток после имплантации в действительности сильно зависит от васкуляризации15,16,,17, которая обеспечивает обмен кислорода и питательных веществ и облегчает удаление отходов. Биореакторов представляют собой один из подходов к преодолеть проблемы васкуляризации в тканевой инженерии и поддерживать жизнеспособность клеток, через перфузии питательной среды, тем самым обеспечивая18кислорода и питательных веществ. Здесь мы показываем в vitro метод для оценки возможности миграции микрососудистой эндотелиальных клеток от RCP microcarriers Биоматрикс и их способность вносить вклад в de novo васкуляризации и ангиогенеза. Этот Биоматрикс является сегмент decellularized свинину тощей кишки называется BioVaSc (биологические васкуляризированной леску), богатые коллагена и эластина и с сосудистых структур, которые включает в себя питание артерии и крылом вен19 , который был применяется для имплантации вопросы20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
hBMSCs были изолированы от головку бедренной кости артроз пациентов, перенесших операцию замены головки бедренной кости. Процедура была выполнена под номером официального утверждения местного комитета этики из Университета Вюрцбурга и осознанного согласия пациентов. Основная микрососудистой эндотелиальные клетки были изолированы от крайней плоти биопсий несовершеннолетних доноров. Их юридические представители представили информированное согласие в письменной форме. Исследования была одобрена местные этические Советом Университета Вюрцбурга (голосование 182/10).
1. изоляция hBMSCs и HDMECs
- Человека костный мозг производные Мезенхимальные стромальные клетки (hBMSCs)
- Помощью стерильной ложкой удалите губчатой кости от головки бедренной кости.
Примечание: Губчатой кости появляется как сыпучих и гранулированных вещество внутри кортикальной кости, которая является жесткий и жесткой. Это может быть необходимо нуля частей губчатой кости от кортикальной кости с помощью скальпеля. - Вставьте два 50 мл трубки удалены губчатой кости. Объем губчатой кости может варьироваться от 5 до 10 мл по данным измерения головку бедренной кости удалены во время операции эндопротезирования тазобедренного сустава.
- Мойка с DMEM-F12 (1:1 смесь DMEM и ветчиной F12 среды), заполнение трубку с примерно 30 мл среды.
- Встряхнуть трубки вручную, продольные способом, для 5 s чтобы жировых клеток из губчатой кости. Центрифуга на 300 x g и 22 ° C за 5 мин.
- Аспирационная с градуированной Пластиковые пипетки, слой жира клеток и приблизительно 20 мл оставшихся супернатант. Пусть достаточно среднего для покрытия губчатой кости.
- Заполнить трубы с 10 мл DMEM-F12 и встряхнуть продольно от руки, на 10-15 сек, чтобы клетки.
- Трансфер 10-15 мл суспензии клеток с градуированной Пластиковые пипетки из трубы в новый Тюбик 50 мл.
- Повторяйте 2 - 3 раза от шага 1.1.6 объединения подвеска полученные клетки, до тех пор, пока губчатой кости, собранные в Тюбик 50 мл белого.
- Передать два новых труб, избегая аспирационных Пелле коллагена, хранение в нижней части трубы 50 мл суспензии клеток с градуированной Пластиковые пипетки.
- Центрифуга суспензию клеток на 300 x g и 22 ° C за 5 минут отказаться от супернатанта, аспирационных с градуированной Пластиковые пипетки.
- Добавьте 40 мл DMEM-F12 10% FCS 1% перо/Strep 50 мкг/мл аскорбат-2-фосфат в третью трубку. Передача 5 мл этой среды для каждого трубка, содержащая ячейку Пелле. Вновь приостановить клетки окатышей, энергично мелькать в нижней части трубы и передать трубка, содержащая только средний клеточных суспензий.
- Дополнительно: Разбавляют 100 мкл суспензии клеток для подсчета клеток, разбавления 1: первые 100 с PBS и затем 1:10 в Трипановый синий, добавив 15 мкл первого разбавления до 15 мкл DPBS и 30 мкл Трипановый синий для получения DPBS: Трипановый синий в соотношении 1:1. Подсчет количества ячеек с камерой стандартного Нойбауэр.
- Заполнить клетки на 109 клеток/175 см2 T-колбу 25 мл среды, как описано в 1.1.11. Кроме того делят подвеска вся ячейка в культуре клеток колбах, до десяти 175 см2 без подсчета. На этой стадии hBMSCs не отличимые от эритроцитов, которые значительно превосходят их. hBMSCs будет отображаться как разреженными колониями (1-2/колба) в течение первых 7 дней.
- Изменение среднего после 4 дней от посева до разрешить взаимодействие клеток крови с hBMSCs. После первого среднего обмена измените носитель каждые 2-3 дня. Выполните средний обмен, полностью удаляя питательной среды с градуированной Пластиковые пипетки, мыть два раза с DPBS (путем добавления 10 мл DPBS для адэрентных клеток и удаления полностью DPBS с градуированной Пластиковые пипетки) и затем добавив 20 мл свежий средний, как описано в 1.1.11.
- Помощью стерильной ложкой удалите губчатой кости от головки бедренной кости.
- Кожной микрососудистой эндотелиальных клеток человека (HDMECs)
- Лечить биопсия кожи и изолировать HDMECs согласно ранее опубликованные протоколы21. Короче говоря после разделения дермы от эпидермиса, Инкубируйте дермы в трипсина 40 минут при 37 ° C и 5% CO2. После инкубации время передачи дермы в чашку Петри, содержащие питательной среды и нуля каждый фрагмент с помощью скальпеля. Передача полученных клеток подвеска пластиковый Тюбик 50 мл и центрифуги для 5 мин 300 x g и 22 ° C. Граф суспензию клеток с помощью камеры Нойбауэр и семян на плотности 1,2 х 104 клетки/см2. Изменения средство полностью каждый день.
2. Установка и стерилизации спиннер колбы, RCP microcarriers и биореакторов
- Спиннер колбы и RCP microcarriers
- Один день до экспериментов, установка счетчика колбы и подготовить их для стерилизации в автоклаве.
Примечание: Оставить крышки счетчика колбы сыпучих и, когда это возможно, стерилизовать их в вертикальном положении.- Оберните спиннер колбы с алюминиевой фольгой вокруг шапки отдельно во избежание загрязнения во время развертки. Оберните колбы с 1-2 слоя алюминиевой фольги для автоклавирования с целью минимизации рисков загрязнения после стерилизации.
- Необходимое количество RCP Макропористые microcarriers весят в 20 мл DPBS.
Примечание: 30 мг требуется за флакон спиннер. Пусть они увлажняют для по крайней мере 1 час перед тепловой стерилизации в автоклаве (121 ° C 15 мин).
- Один день до экспериментов, установка счетчика колбы и подготовить их для стерилизации в автоклаве.
- Биореактор перфузии
- Используйте систему биореактора, описал производить васкуляризированной ткани эквиваленты20. Этот реактор состоит из судна, в котором размещается Биоматрикс, средний водохранилище и бутылка давления.
- Подключите судна с средних водохранилище и бутылка давления через силиконовой трубки (см. рис. 3 c). Оставьте шапки сыпучих и поместите его в пластиковый пакет автоклава, закройте хорошо и это в второй автоклав пластиковый пакет. Стерилизуйте в автоклаве.
- Используйте систему биореактора, описал производить васкуляризированной ткани эквиваленты20. Этот реактор состоит из судна, в котором размещается Биоматрикс, средний водохранилище и бутылка давления.
3. Культура эпохи hBMSCs и HDMECs на microcarriers Макропористые RCP
Примечание: HDMECs, используется для инициализации RCP microcarriers были помечены ППП, лентивирусные трансдукции. Этот протокол был изменен после ранее опубликованного протокола5.
- Пусть RCP Макропористые microcarriers оседают на дно и мыть их с 10 мл питательной среды. Повторите 3 раза.
- Вымойте спиннер флакон с 10 мл питательной среды.
- Добавьте 30 мг RCP Макропористые microcarriers за счетчик флакон в 8 мл питательной среды. Сбалансировать колбы спиннер, содержащий RCP microcarriers при 37 ° C и 5% CO2 на 30 мин, до заполнения ячеек.
Примечание: Это основано на сухой вес RCP microcarriers до стерилизации. - Семена 5 x 105 hBMSCs или HDMECs (проход 3) за счетчик флакон 2 мл питательной среды.
- Место спиннер колбы на мешалкой пластины и начать помешивая на 90 об/мин за 5 мин и отдыха для 55 мин, при 37 ° C и 5% CO2, для в общей сложности 1 h статические/динамические инкубации. Повторите 4 раза.
- Добавить 10 мл среды культуры клеток за флакон спиннер, а затем начать непрерывного перемешивания на 95 об/мин. Инкубируйте на 37 ° C и 5% CO2.
- С использованием микропипеткой брать пробы в дни 1, 4 и 7:333 мкл для ДНК контента (~ 0,5 мг), 1000 мкл для анализа SEM (~ 1,5 мг) и 333 мкл для окрашивания мертвых и жить (~ 0,5 мг).
Примечание: Это основано на сухой вес RCP microcarriers до стерилизации. - Измените 10 мл питательной среды каждый день. Для этого подождите, пока RCP microcarriers оседают на дно и очень тщательно аспирационная от счетчика колбу с использованием пипетки 10 мл, 10 мл и затем добавляют 10 мл свежей питательной среды.
- Держите культур на плите мешалки в 95 об/мин, при 37 ° C и 5% CO2 на 7 дней.
4. ДНК содержание, анализ SEM, живут окрашивания мертвых и прорастания пробирного
- Содержание ДНК
- С использованием микропипеткой собирают около 0,5 мг microcarriers от каждого счетчика колбу (содержащихся в 333 мкл суспензии) и передачи в пластиковую трубку 2 мл.
Примечание: Это основано на сухой вес RCP microcarriers до стерилизации. - Мыть раз в 1 мл DPBS, а затем удалить супернатант.
- Удалите оставшиеся DPBS в лиофилизатор и вес лиофилизированные microcarriers для более поздних нормализации.
- Замораживание образцов на-80 ° C для по крайней мере 6 часов.
- Проинкубируйте образцы при 60 ° C ночь с 300 мкл папаин 5 ед/мл.
- Установить соответствующие титрования кривых следуя инструкциям manufacturer´s assay количественный (например, PicoGreen dsDNA пробирного) комплект и выполнять измерения флуоресцентного сигнала на 520 Нм с детектором люминесценции.
- С использованием микропипеткой собирают около 0,5 мг microcarriers от каждого счетчика колбу (содержащихся в 333 мкл суспензии) и передачи в пластиковую трубку 2 мл.
- Сканирование электронная микроскопия (SEM) анализ
- Соберите ОК. 1 мг microcarriers от каждого счетчика колбу и передачи 2 мл пластиковую трубку.
- Мыть microcarriers раз с 1 мл DPBS.
- Удаление DPBS и инкубировать в 1 мл, этанол 70% за 1 час.
- Удалить супернатант и инкубировать в 1 мл этанола 80% за 1 час.
- Удалить супернатант и инкубировать в 1 мл, этанол 90% за 1 час.
- Удалить супернатант и инкубировать в 1 мл этанола 100% за 1 час.
- Удалить супернатант и инкубировать в 1 мл Гексаметилдисилазан за 10 мин.
- Откройте крышку и пусть сухой ночлег образцы под капотом химического.
- Fix образцы на соответствующую поддержку и провести анализ SEM в соответствии с установленными протоколами.
- DAPI и Live/мертвые пятнать
- В день 2, 4 и 7 после посева на microcarriers клетки Соберите 0,5 мг microcarriers от каждого счетчика колбу и передачи 2 мл пластиковую трубку. Мыть раз в 1 мл DPBS.
- DAPI
- Исправьте образцы для 10 мин в достаточно параформальдегида 4%, чтобы покрыть их.
- Мыть раз в 1 мл DPBS.
- Инкубации при комнатной температуре с окрашивание раствора для 45 мин на качалки шейкер.
- Обнаружить DAPI флуоресцентного сигнала на флуоресцентным микроскопом с 420 нм фильтра выбросов и приобрести изображений.
- / Мертвые пятнать
- Проинкубируйте образцы в 500 мкл раствора красителя Live/мертвых. Храните образцы при 37 ° C в течение 20 мин, защищенном от света.
- Мыть раз в 1 мл DPBS.
- Обнаружить сигнал флуоресценции живых клеток с 490 нм фильтра выбросов и омертвевших клеток с 545 нм фильтра выбросов на флуоресцентным микроскопом. Получение изображений.
- Прорастания assay для HDMECs
- Mix 330 мкл коллагена R раствор 0,4%, 170 мкл 0,1% уксусной кислоты и 50 мкл средних M199 в пластиковой трубке 15 мл. Держите на льду.
- Возьмите ~0.375 мг microcarriers (250 мкл) с использованием микропипеткой. Трансфер в 1,5 мл пластиковую трубку, ждать microcarriers RCP оседают на дно и полностью удалить носитель.
Примечание: Это основано на сухой вес RCP microcarriers до стерилизации. - Добавьте объем NaOH 0,2 N необходимые для нейтрализации смеси коллагена и сразу смешать его с RCP microcarriers.
Примечание: Определить необходимое количество NaOH 0,2 N заранее, добавив его в смеси до изменения рН (поворот от желтого цвета розовый) и затем поместить смесь в инкубаторе за 1 мин, после чего должен быть сформирован гель. - Пластина коллагена гель RCP microcarriers смесь в хорошо 24-ну плиты. Инкубируйте при 37 ° C и 5% CO2 на 30 мин.
- 200 мкл Сосудистый эндотелиальный фактор роста (например, VascuLife VEGF-Mv питательной среды). Инкубируйте при 37 ° C и 5% CO2 на 24 часа.
- Наблюдать под микроскопом контраст перевернутую фазы, используя 10 X увеличение объекта и получить изображения.
5. Биоматрикс посева и запуска системы биореактор для HDMECs
- Один день перед началом биореактор культур, вырезать открытых BioVaSc (Биоматрикс) продольно на стороне antimesenteric и исправить ее в ранее вылеченных поликарбоната кадров (см. рис. 3а, B).
Примечание: BioVaSc является Биоматрикс, полученные от сегмента decellularized свинину тощей кишки, подготовленных как ранее опубликованные21.
Примечание: как кадр поликарбоната не стерилизована тепла лечить его на 20 минут инкубации в sonic ванна (40 кГц) следуют 3 раза инкубации в этанол 70% за 25 мин. Затем вымойте кадр 3 раза с DPBS стерильные.- Разместите систему Биоматрикс кадр в 100 мм Петри и заполнить его с Сосудистый эндотелиальный фактор роста + 1% пенициллин стрептомицина (Pen/Strep).
- Сбалансировать Биоматрикс по инкубации на ночь при 37 ° C и 5% CO2.
- После отсоединения и подсчета клеток, придать 10 x 107 HDMECs в 1000 мкл питательной среды через сохранившийся сосудистую Биоматрикс, с использованием шприц 2 мл.
Примечание: Inject ~ 700 мкл через артериальной входе и ~ 300 мкл через Вену выход. - Инкубируйте при 37 ° C и 5% CO2 3 часа, чтобы разрешить вложение клеток.
- Заполнить систему биореактор с 350 мл Сосудистый эндотелиальный фактор роста + 1% перо/воспаление и Инкубируйте на 37 ° C и 5% CO2.
- Поместите кадр внутри сосуда биореактора. Подключите артериальной и венозной ножек на судно.
- Запустите перфузии, подключения системы биореактора к перистальтического насоса. Установите давление на 10 мм рт.ст и амплитуды ±1.
- Увеличение давления ступенчатой каждый час до достижения 100 мм рт.ст, давления, амплитуда ±20.
- Держите система биореактор для 7 дней при этих условиях при 37 ° C и 5% CO2.
6. Добавление ЗП-HDMECs к Биоматрикс
- Смешайте 330 мкл 0,4% раствора коллагена R, 170 мкл 0,1% уксусной кислоты и 50 мкл средних M199 в 15 мл трубки сокола. Держите на льду.
- Принять microcarriers РКП от счетчика колбы. Полностью удалите питательной среды.
- Добавьте объем NaOH 0,2 N необходимые для нейтрализации смеси коллагена и сразу смешать его с RCP microcarriers.
- Добавьте смесь microcarriers гель RCP коллагена на просвет Биоматрикс. Разрешить гелеобразования за 30 мин.
- Параллельно, изменить среднего биореактор, полностью удалив среднего и затем добавить 350 мл свежего, предварительно разогретую, Сосудистый эндотелиальный фактор роста + 1% перо/воспаление.
- Подключите биореактор Перистальтический насос и создать давление на 100 мм рт.ст и амплитуды ±20.
- Измените носитель каждые 7 дней.
- Держите биореактор в культуре для 21 дней.
7. анализ и read-outs биореактор культур
- Подготовка образцов
- Отключать Биоматрикс от биореактор и удалить его из поликарбоната кадров.
- Вырезать полученные кусок на 6 секций: 2 для МТТ, 2 для встраивания парафин/окрашивания и 2 для SEM анализа.
- Встраивание парафин
- Поместить эти разделы в чашку Петри и мыть с достаточно DPBS для их покрытия. Отказаться от DPBS.
- Исправьте в подразделах параформальдегида 4% на ночь.
- Подготовить кассеты для встраивания парафин и выполнить его согласно стандартных протоколов.
- Подготовка разделов в парафиновых блоков и вырезать образцы 3 мкм для H & E окраски, с использованием микротом.
- H & E пятнать
- Пятно Регидратированные разделы согласно стандартных протоколов32.
- Сканирование электронная микроскопия (SEM) анализ
- Поместить эти разделы в чашку Петри и мыть с достаточно DPBS для их покрытия. Отказаться от DPBS.
- Исправьте разделы с глютаральдегид 4,75% на ночь.
- Выполняйте обезвоживания цепи с увеличением концентрации этанола 50% - 100%.
- Охватывают разделы с Гексаметилдисилазан (ГМДО) на 10 мин отклонения используется HMDS и добавить свежие HMDS.
- Разрешить секций для высыхания на ночь под зонт, а затем подготовить образцы для изображений.
- 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-YL)-2,5-diphenyltetrazolium бромид (MTT)
- Смешайте МТТ реагента с Сосудистый эндотелиальный фактор роста, в концентрации 1 мг/мл.
- Инкубируйте разделы в МТТ решение для 90 минут при 37 ° C и 5% CO2.
- Соблюдайте сосудистых структур и клеток семенами microcarriers макроскопически или под микроскопом ярко поле, чтобы обнаружить метаболически активные клетки. Получение изображений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Как показано на рисунке 1A, мы получили большое количество жизнеспособных клеток на RCP microcarriers после 7 дней культуры, определяется жить/мертвые пятнать. Эти результаты были подтверждены SEM анализ, в котором полностью колониальных microcarriers были замечены вокруг поры, частично зарастание их (рис. 1B). С другой стороны эксперименты, в которых клетки не были посеяны равномерно привело к несколько пустых microcarriers. Неудачных экспериментов характеризуются аномально высокое количество мертвых клеток, которые не должны быть более чем 10% от суммы общего клеток (рис. 1 c). Кроме того содержание количественного определения ДНК HDMECs показали увеличение dsDNA со временем (рис. 1 d).
Кроме того ЗП-HDMECs смогли сохранить их функциональность после культуры на RCP microcarriers, как показано на рисунке 2, где клетки принял прорастания фенотип когда культивировали в гель коллагена.
Кроме того мы использовали microcarriers ЗП-HDMECs колонизировали RCP повторное заполнение в просвет Биоматрикс BioVaSc. Для этого мы используем систему биореактор для физиологических перфузии васкуляризированной ткани эквиваленты22 (рис. 3 c) в котором мы светотеневую открыть Биоматрикс и помещен в рамку из поликарбоната, так что просвета была разоблачена в даже set-up ( Рисунок 3B).
После 21 дней культур биореактора, метаболически активные клетки были представлены как на сохранившихся сосудистую Биоматрикс, так и на RCP microcarriers (рис. 4A и рисунок 3B). Неудачных экспериментов или неправильный выбор фрагментов при резании гистологические образцов может привести к отсутствие колонизировать эндотелиальных клеток в просвет сосудов Биоматрикс или на microcarriers. Эти результаты могут быть подтверждены SEM анализ Биоматрикс секций, где можно наблюдать, что клетки по-прежнему охвачены некоторые области RCP microcarriers и что РКП microcarriers находились в непосредственной близости от Биоматрикс (Рисунок 4 c и 4 D).
Наконец H & E пятнать подтвердил наличие HDMECs на Биоматрикс, специально в сосудистых структур (Рисунок 5A). Когда под флуоресцентным микроскопом, клетки, колонизируя сосудистых структур Биоматрикс привели быть ЗП-HDMECs (Рисунок 5B), указывающее миграции клеток от RCP microcarriers Биоматрикс. Некоторые ЗП-HDMECs также наблюдались на microcarriers RCP (рис. 5 c и 5 D). В эксперименты, в которых клетки сделал не выжил благодаря изменены культивирования условий (например короче культуры раз) они могут не обнаруживаться внутри сосудов структуры с ни один из методов сообщалось ранее (Рисунок 5E и 5F ).
Рисунок 1: Культура HDMECs и hBMSCs на RCP microcarriers. (A, C) жить/мертвые пятная после 7 дней динамических культур. (B) анализ SEM HDMECs, культивируемых на RCP microcarriers после 7 дней динамических культур. (D) ДНК контента определяется PicoGreen пробирного комплект. Данные, выраженные как среднее ± стандартное отклонение (n = 3). Масштаб бары: 200 мкм для A, 88 мкм для B и 100 мкм для C. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: прорастания пробирного. Ростки ЗП-HDMECs можно наблюдать под ярко поля (A) и флуоресцентной микроскопии (B), выходящих из колониальных microcarrier RCP после 24 ч культуры в гель коллагена. (C) накладываемое изображение. Масштаб бары: 100 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Биоматрикс и биореактор set-up. (A) подготовка Биоматрикс и монтаж поликарбоната кадров (B). (C) биореактор set-up. Судно подключен к средних водохранилище и бутылка давления через кремний трубы, и вся система подключена к перистальтического насоса. Давление измеряется через датчик давления. AI: артериальная входе; VO: венозный розетки. Этот показатель был изменен с Groeber и др. 22 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: считывание биореактор. MTT пробирного над Биоматрикс секции после 21 дней культуры, в котором метаболически активные клетки были замечены в сохранившихся сосудистую Биоматрикс (A) , а также на microcarriers РКП (Б). (C, D) SEM образы microcarriers RCP на Биоматрикс секции. Масштаб бары: 0.28 см для A, 0,45 см для B, 47 мкм для C и 225 мкм для D. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: H & E окрашивание и флуоресценции изображения. (A, C, E) H & E пятнать. (B, D, F) После 21 дней культуры ЗП-HDMECs были замечены внутри сосудистую Биоматрикс (стрелки), а также на microcarriers RCP (стрел). Масштаб бары: 50 мкм для A-D и 30 мкм для E и F. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Одна Главная цель microcarrier является расширение клеток при сохранении их дифференциации для того, чтобы доставить клетки место необходимости. Представленный метод ввести microcarriers RCP, где клетки смогли прикрепить, размножаться и колонизировать microcarriers с плотностью высокого клеток. Это было отмечено жить/мертвые окрашивания, в которых были обнаружены более чем 90% жизнеспособных клеток пока только несколько мертвых клеток были получены после 7 дней динамических культур. Аналогичным образом SEM изображения подтвердил, что клетки охватывает всю поверхность microcarriers после 7 дней культур.
Чтобы обеспечить выживание клетки в 3D-моделях, важно поддерживать поставку кислорода и питательных веществ к клеткам и разрешить удаление отходов веществ. Кровеносные сосуды являются ответственные структуры этого процесса обмена, в котором эндотелиальные клетки играют ключевую роль, поскольку они являются клеток, выстилающих внутреннюю часть кровеносных сосудов23. Они имеют возможность размножаться, миграции, присоединиться, прорастают и сформировать структуры судна24. Эти свойства были сохранены после культуры ЗП-HDMECs на RCP microcarriers, поскольку было отмечено, что клетки были в состоянии принять прорастания фенотип (см. Рисунок 2). Здесь мы могли бы доказать, что эти колониальные microcarriers RCP эффективно доставлять первичных эндотелиальных клеток повторно заполнить просвет бывшего судов Биоматрикс BioVaSc. Это предполагает нашу систему, чтобы быть пригодным для улучшения васкуляризации ткани инженерии имплантатов для клинического применения. Успешно используются производные этой матрицы в васкуляризации подходы25, также как и опухоль в vitro тест sytems21,26,27,28 и для производства эквивалентов кожи как альтернативы29экспериментов на животных. Здесь он используется в открытой, плоский set-up и помещены в биореакторе перфузии как применяется для поколения ткани эквиваленты22.
Биореакторы были использованы в тканевой инженерии для производства ткани эквивалентов, которые могли бы помочь облегчить спрос органов при одновременном снижении связанных с этим рисков как неприятие и заболеваемости30. Однако производство ткани подобных конструкций является очень сложным процессом, который предполагает использование типов тканей специфических клеток, подходит леска и соответствующие факторы роста, которые позволяют надлежащим дифференциации и монтаж в 3D ткани. Один из основных недостатков инженерных конструкций является отсутствие надлежащего сосудистой сети, которая поддерживает выживания клетки как in vitro и in vivo17. Здесь мы объединяем RCP-колонизировали microcarriers с decellularized матрицей в биореакторе модели, предоставляя тип ячейки требуется, эшафот, что позволяет клеточной адгезии и формирования судна и конкретных питательной среды, которая обеспечивает основные факторы для клетки размножаются и поддерживать их функциональных свойств. Важным результатом этой модели является способность HDMECs мигрировать из RCP microcarriers на эшафот без каких-либо дополнительные подразделения или пищеварения при необходимости в другие подходы31. После этого они колонизировали специально сосудистых структур матрицы, доказав концепция что Макропористые, которую microcarriers может использоваться как системы доставки клеток для регенеративной медицины целей.
В целом этот протокол является перспективной стратегией в регенеративной медицине для получения максимальной клеток расширения и она могла бы служить клетки доставки для имплантации сайтов, где она может улучшить поддержку васкуляризации ткани инженерии графтов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Исследований, приведших к эти результаты получила финансирование от Европейского союза седьмой рамочной программы FP7/2007-2013 под Грант соглашение n ° 607051 (био-ВДОХНОВЛЯТЬ). Мы благодарим Кристина ван Spreuwel-Гуссенс от Fujifilm производства Europe B.V., для оказания технической помощи при производстве RCP и Вернер Страке из Института Фраунгофера силикатных исследования ISC, для помощи с SEM анализ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide (MTT) | Serva Electrophoresis GmbH | 20395.01 | |
| 4’,6-Diamidino-2-phenylindoldihydrochloride (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Acetic acid 100% | Sigma-Aldrich | 533,001 | |
| Analytical balance Kern EG 2200-2NM | Kern & Sohn GmbH | ||
| Ascorbate-2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| Bioreactor | Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Wuerzburg, Germany | ||
| Bright field microscope Axiovert 40C | Carl Zeiss AG | ||
| Cellnest | Fujifilm | ||
| Centrifuge tubes (15 mL, 50 mL) | Greiner Bio-One | ||
| Collagen R solution 0,4% | Serva Electrophoresis GmbH | 47254.01 | |
| DMEM-F12 | Gibco | 11320-033 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | Modified, without calcium chloride and magnesium chloride |
| Eosin 1% | Morphisto | 10177.01000 | |
| Ethanol 96% | Carl Roth GmbH | T171.4 | Denatured |
| Fetal calf serum (FCS) | Bio&SELL | FCS.ADD.0500 | not heat-inactivated |
| Fluorescence microscope BZ-9000 | Keyence | ||
| Haematoxylin | Morphisto | 10231.01000 | |
| Hexamethyldisilazane | Sigma-Aldrich | 440191 | Reagent grade, ≥99% |
| Incubator for bioreactor | Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Wuerzburg, Germany | ||
| Live/Dead Cell Double Staining Kit | Fluka | 04511KT-F | |
| Magnetic stirrer plate | 2Mag | 80002 | |
| Medium 199 | Sigma-Aldrich | M0650 | 10X |
| Microplate reader Tecan Infinite M200 |
Tecan | ||
| Needle 21G 16mm | VWR | 613-5389 | |
| Papain from papaya latex | Sigma-Aldrich | P4762 | lyophilized powder, ≥ 10 units/mg protein |
| Paraffin | Carl Roth GmbH | 6642.6 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Peristaltic pump | Ismatec | ||
| Quanti-iT PicoGreen dsDNA assay kit | Thermo Fischer Scientific | P7589 | |
| Histofix 4% | Carl Roth GmbH | P087 | |
| Scanning Electron Microscope Supra 25 | Carl Zeiss AG | ||
| Sodium hydroxide solution 1.0 N | Sigma-Aldrich | S2770 | |
| Spinner flasks (25 mL) | Wheaton | 356879 | |
| Syringe 1 mL | VWR | 720-2561 | |
| Tissue culture flasks (25 cm2, 75 cm2, 150 cm2) | TPP Techno Plastik Products AG | ||
| Trypan blue 0.4% | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| VascuLife VEGF-Mv | Lifeline cell technology | LL-0005 |
References
- Li, B., et al. Past, present, and future of microcarrier-based tissue engineering. Journal of Orthopaedic. 3 (2), Translation 51-57 (2015).
- Rodrigues, M. E., Costa, A. R., Henriques, M., Azeredo, J., Oliveira, R. Evaluation of solid and porous microcarriers for cell growth and production of recombinant proteins. Methods Mol Biol. 1104, 137-147 (2014).
- Akhmanova, M., Osidak, E., Domogatsky, S., Rodin, S., Domogatskaya, A. Physical, Spatial, and Molecular Aspects of Extracellular Matrix of In Vivo Niches and Artificial Scaffolds Relevant to Stem Cells Research. Stem Cells Int. 2015, 167025 (2015).
- Sart, S., Tsai, A. C., Li, Y., Ma, T. Three-dimensional aggregates of mesenchymal stem cells: cellular mechanisms, biological properties, and applications. Tissue Eng Part B. Rev. 20, 365-380 (2014).
- Fitzgerald, K. A., Malhotra, M., Curtin, C. M., Brien, F. J. O., O'Driscoll, C. M. Life in 3D is never flat: 3D models to optimise drug delivery. Journal of Controlled Release. 215, 39-54 (2015).
- Tan, K. Y., Reuveny, S., Oh, S. K. W. Recent advances in serum-free microcarrier expansion of mesenchymal stromal cells: Parameters to be optimized. Biochemical and Biophysical Research Communications. 473, 769-773 (2016).
- de Soure, A. M., Fernandes-Platzgummer, A., da Silva, C. L., Cabral, J. M. Scalable microcarrier-based manufacturing of mesenchymal stem/stromal cells. J Biotechnol. 236, 88-109 (2016).
- Schop, D., et al. Expansion of human mesenchymal stromal cells on microcarriers: growth and metabolism. J Tissue Eng Regen. Med. 4, 131-140 (2010).
- Carmelo, J. G., Fernandes-Platzgummer, A., Diogo, M. M., da Silva, C. L., Cabral, J. M. A xeno-free microcarrier-based stirred culture system for the scalable expansion of human mesenchymal stem/stromal cells isolated from bone marrow and adipose tissue. Biotechnol J. 10, 1235-1247 (2015).
- Malda, J., Frondoza, C. G. Microcarriers in the engineering of cartilage and bone. Trends Biotechnol. 24, 299-304 (2006).
- Chen, A. K., Reuveny, S., Oh, S. K. Application of human mesenchymal and pluripotent stem cell microcarrier cultures in cellular therapy: achievements and future direction. Biotechnol Adv. 31, 1032-1046 (2013).
- Confalonieri, D., La Marca, M., van Dongen, E., Walles, H., Ehlicke, F. An Injectable Recombinant Collagen I Peptide-Based Macroporous Microcarrier Allows Superior Expansion of C2C12 and Human Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stromal Cells and Supports Deposition of Mineralized Matrix. Tissue Eng Part A. , (2017).
- Davidenko, N., et al. Control of crosslinking for tailoring collagen-based scaffolds stability and mechanics. Acta biomaterialia. 25, 131-142 (2015).
- Jin, G. Z., Park, J. H., Seo, S. J., Kim, H. W. Dynamic cell culture on porous biopolymer microcarriers in a spinner flask for bone tissue engineering: a feasibility study. Biotechnol Lett. 36, 1539-1548 (2014).
- Bae, H., et al. Building Vascular Networks. Science Translational Medicine. 4 (160), 160ps23 (2012).
- Cao, L., Wang, J., Hou, J., Xing, W., Liu, C. Vascularization and bone regeneration in a critical sized defect using 2-N, 6-O-sulfated chitosan nanoparticles incorporating BMP-2. Biomaterials. 35 (2), 684-698 (2014).
- Novosel, E., Kleinhans, C., Kluger, P. Vascularization is the key challenge in tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4-5), 300-311 (2011).
- Cartmell, S. H., Porter, B. D., García, A. J., Guldberg, R. E. Effects of medium perfusion on cell-seeded three-dimensional bone constructs in vitro. Tissue Engineering. 9 (6), 1197-1203 (2004).
- Schanz, J., Pusch, J., Hansmann, J., Walles, H. Vascularised human tissue models: a new approach for the refinement of biomedical research. Journal of biotechnology. 148 (1), 56-63 (2010).
- Steinke, M., Gross, R., Walles, H., Schütze, K., Walles, T. An engineered 3D human airway mucosa model based on a SIS scaffold. Biomaterials. 35 (26), 7355-7362 (2014).
- Moll, C., et al. Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System. J. Vis. Exp. (78), e50460 (2013).
- Groeber, F., Kahlig, A., Loff, S., Walles, H., Hansmann, J. A bioreactor system for interfacial culture and physiological perfusion of vascularized tissue equivalents. Biotechnology Journal. 8, 308-316 (2013).
- Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Walter, P. Blood vessels and endothelial cells. Molecular Biology of the Cells. , New York. (2002).
- Logsdon, E. A., Finley, S. D., Popel, A. S., Gabhann, F. M. A systems biology view of blood vessel growth and remodeling. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 18 (8), 1491-1508 (2014).
- Scheller, K., Dally, I., Hartmann, N., Münst, B., Braspenning, J., Walles, H. Upcyte® Microvascular endothelial cells repopulate decellularized scaffold. Tissue Engineering Part C: Methods. 19 (1), 57-67 (2012).
- Nietzer, S., et al. Mimicking Metastases Including Tumor Stroma: A New Technique to Generate a Three-Dimensional Colorectal Cancer Model Based on a Biological Decellularized Intestinal Scaffold. Tissue Engineering Part C: Methods. 22 (7), 621-635 (2016).
- Göttlich, C., et al. A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds. J. Vis. Exp. (110), e53885 (2016).
- Stratmann, A. T., et al. Establishment of a human 3D lung cancer model based on a biological tissue matrix combined with a Boolean in silico model. Molecular oncology. 8 (2), 351-365 (2014).
- Groeber, F., et al. A first vascularized skin equivalent for as an alternative to animal experimentation. Altex. 33 (4), 415-422 (2016).
- Plunkett, N., O'Brien, F. J.
- Nienow, A. W., Rafiq, Q. A., Coopman, K., Hewitt, C. J. A potentially scalable method for the harvesting of hMSCs from microcarriers. Biochemical Engineering Journal. 85, 79-88 (2014).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2008 (5), pdb-prot4986 (2008).
