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Bioengineering

Collagène recombinant j’ai microporteurs de Peptide pour l’Expansion des cellules et leur utilisation potentielle comme système de diffusion de cellule dans un bioréacteur modèle

Published: February 7, 2018 doi: 10.3791/57363
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 3, 1,2
1Department Tissue Engineering and Regenerative Medicine, University Hospital Wuerzburg, 2Translational Center Regenerative Therapies (TLC-RT), Fraunhofer Institute for Silicate Research ISC, 3Fujifilm Manufacturing Europe B.V.

Summary

Nous vous proposons un protocole d’expansion cellulaire sur Microsupports macroporeux et leur utilisation comme système de livraison dans un bioréacteur de perfusion pour amorcer une matrice de tissu DECELLULARISE. Nous incluons également différentes techniques pour déterminer la prolifération cellulaire et la viabilité des cellules cultivées sur Microsupports. En outre, nous démontrons la fonctionnalité des cellules après cultures bioréacteur.

Abstract

Génie tissulaire est un domaine prometteur, axé sur le développement de solutions pour la demande croissante sur les tissus et les organes au sujet des fins de transplantation. Le processus pour générer ces tissus est complex et comprend une combinaison appropriée de types spécifiques de cellules, échafaudages et des stimuli physiques ou biochimiques pour guider la croissance cellulaire et la différenciation. Microsupports représentent un outil attrayant pour étendre des cellules dans un micro-environnement (3D) en trois dimensions, puisqu’ils offrent plus de surface-à ratios volume et imitent plus étroitement la situation in vivo par rapport aux méthodes traditionnelles de deux dimensions. Le système vasculaire, fournissant l’oxygène et des nutriments vers les cellules et assurer l’enlèvement des déchets, constitue une composante importante lorsque génération conçu des tissus. En fait, la plupart des constructions échouent après être implanté en raison de manque de soutien vasculaire. Dans cette étude, nous présentons un protocole pour l’expansion des cellules endothéliales sur microporteurs d’à base de collagène recombinant dans des conditions dynamiques en fiole de spinner et bioréacteurs et nous expliquer comment déterminer dans cette viabilité cellulaire de réglage et de fonctionnalité. En outre, nous proposons une méthode pour la livraison de cellules à des fins de vascularisation sans étapes de détachement supplémentaires nécessaires. En outre, nous fournissons une stratégie pour évaluer la vascularisation de cellule potentielle dans un bioréacteur de perfusion sur une matrice biologique DECELLULARISE. Nous croyons que l’utilisation des méthodes présentées pourrait conduire au développement de nouvelles thérapies cellulaires pour une vaste gamme d’applications dans la pratique clinique en génie tissulaire.

Introduction

Un problème général dans les applications d’ingénierie tissulaire est pour donner une masse cellulaire élevée avec le phénotype de différentiation correcte à l’endroit du besoin. L’application des microporteurs pour régler ce problème a commencé en 1967 avec l’augmentation de l’importance à ce jour dans des domaines tels que l’ingénierie des tissus orthopédiques pour la production à grande échelle de la peau, des os, cartilages et tendons1. Ils permettent la manipulation des cultures adhérentes de façon semblable à celle des cultures de suspension2 par l’expansion des cellules sur des substrats (3D) en trois dimensions de micro-échelle. Ainsi les cellules expérience un apport nutritif homogène et interactions cellule-matrice que conduisent à mieux entretenir en vivodifférenciation4 3,, qui est souvent perdue au fil du temps en 2D s’approche de5. Un ratio plus élevé de la surface-volume - aboutissant à des cellules plus haut rendements6,7, plus de gaz et les taux de change des éléments nutritifs en comparant des systèmes statiques8, la possibilité de réglementer et de soumettre la culture physique des stimuli9et le potentiel d’intensification du processus expansion7 sont a d’autres avantages. Plusieurs caractéristiques comme diamètre, densité, porosité, charge superficielle et adhérence propriétés10,11 distinguent les différentes disponibles dans le commerce micro - et macro-transporteurs. Cependant, un des principaux avantages est leurs vecteurs potentiels comme microtissues, à défaut de site ou de la demande.

Pour les applications de la technologie avec des microporteurs en ingénierie tissulaire osseuse, nous a indiqué dans un précédent rapport12 la production d’un nouveau avec des microporteurs type constitué d’un collagène recombinant j’ai peptide (RCP, disponible dans le commerce comme Cellnest). Cette nouvelle avec des microporteurs permet la GMP compatible vers le haut de l’échelle de la production d’échafaudage et cellule, selon les besoins pour la livraison de cellule dans un scénario clinique. Dans ce contexte, réglage de la stabilité de l’échafaudage, le taux de dégradation et des propriétés de surface par le biais de choix d’une stratégie adaptée de réticulation permet d’adapter la technique à l’application sélectionnée, type d’intérêt de cellule ou cibler des tissus13. En particulier, l’emploi éventuel de ce avec des microporteurs comme un système de diffusion de cellule injectable pour application thérapeutique14 les rend particulièrement intéressants en milieu clinique.

Dans cet article, nous illustrons donc la procédure de culture pour l’isolement et l’expansion humaines moelle osseuse stromales cellules mésenchymateuses (hBMSCs) et humains par voie cutanée cellules endothéliales microvasculaires (HDMECs) sur je-base de collagène recombinant microsupports peptidique et leur préparation pour la livraison en milieu clinique. En outre, nous décrivons les protocoles additionnels utiles pour le maintien de la viabilité des cellules lors de l’implantation.

La viabilité cellulaire après l’implantation est en effet dépend fortement de la vascularisation15,16,17, qui assure l’échange d’oxygène et de nutriments et facilite l’élimination des déchets. Bioréacteurs constituent une approche pour relever les défis de la vascularisation en génie tissulaire et maintenir la viabilité des cellules, par le biais de la perfusion du milieu de culture, fournissant ainsi de l’oxygène et des nutriments18. Ici, nous montrons une méthode in vitro pour évaluer la capacité de migration des cellules endothéliales microvasculaires de la RCP microporteurs un biomatrix et leur capacité à contribuer à la vascularisation de novo et l’angiogenèse. Cette biomatrix est un segment DECELLULARISE de jéjunum de porc appelé BioVaSc (biologique vascularisé échafaudage), riche en collagène et d’élastine et avec préservé les structures vasculaires, qui comprend une alimentation artère et veine drainant19 qui a été appliqué pour l’implantation des questions20.

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Protocol

hBMSCs ont été isolées de la tête du fémur de l’arthrose les patients subissant une arthroplastie de la tête du fémur. La procédure s’est déroulée sous l’approbation du Comité Local d’éthique de l’Université de Würzburg et consentement éclairé des patients. Les cellules endothéliales microvasculaires primaires ont été isolées de biopsies du prépuce des donateurs juvéniles. Leurs représentants juridiques fournis plein consentement éclairé par écrit. L’étude a été approuvée par la Commission locale d’éthique de l’Université de Würzburg (vote 182/10).

1. isolement des hBMSCs et HDMECs

  1. Moelle osseuse mésenchymateuses stromales des cellules humaines (hBMSCs)
    1. Retirez l’os spongieux de la tête de fémur à l’aide d’une cuillère stérile.
      Remarque : L’os spongieux apparaît comme une substance granulaire et lâche à l’intérieur de l’os cortical, ce qui est dur et rigide. Il peut être nécessaire de gratter certaines parties de l’os spongieux de l’os cortical, à l’aide d’un scalpel.
    2. Insérer l’os spongieux supprimé dans deux tubes de 50 mL. Le volume de l’os spongieux peut varier de 5 à 10 mL selon la dimension de la tête de fémur enlevé au cours de la chirurgie de remplacement de la hanche.
    3. Lavage avec DMEM-F12 (mélange 1:1 du milieu DMEM et jambon F12), remplissage du tube environ 30 ml de milieu.
    4. Agiter le tube manuellement, de manière longitudinale, pour 5 s de laisser des cellules adipeuses de l’os spongieux. Centrifuger à 300 x g et 22 ° C pendant 5 min.
    5. Aspirer avec une pipette graduée en plastique, la couche de cellules adipeuses et environ 20 mL du surnageant restant. Laissez assez moyen pour couvrir l’os spongieux.
    6. Remplir les tubes de 10 ml de DMEM-F12 et agiter vigoureusement à la main, pour 10-15 s, pour évacuer les cellules longitudinalement.
    7. Transférer 10 à 15 mL de suspension cellulaire avec une pipette graduée en plastique provenant des tubes dans un nouveau tube de 50 mL.
    8. Répétez 2 ou 3 fois de l’étape 1.1.6 rassemblant la suspension cellulaire obtenue jusqu'à ce que l’os spongieux dans le tube de 50 mL est blanc.
    9. Transférer la suspension cellulaire avec une pipette graduée en plastique à deux nouveaux tubes, évitant l’aspiration du culot de collagène déposé sur le fond des tubes 50 mL.
    10. Centrifuger la suspension de cellules à 300 x g et 22 ° C pendant 5 min. éliminer le surnageant par aspiration il avec une pipette graduée en plastique.
    11. Ajouter 40 mL de DMEM-F12 10 % FCS 1 % Pen/Strep 50 µg/mL Ascorbate-2-phosphate dans un troisième tube. Transférer 5 mL de ce médium dans chaque tube contenant le culot cellulaire. Remettre en suspension les granules cellulaires par le scintillement de la partie inférieure des tubes vigoureusement et transférer les suspensions cellulaires dans le tube contenant le seul médium.
    12. En option : Diluer 100 µL de suspension de cellules pour le comptage des cellules, diluer la première au 1/100 avec PBS et puis 01:10 dans le bleu trypan, en ajoutant 15 µL de la première dilution à 15 µL de SPD et 30 µL Trypan Blue pour obtenir un SPD : ratio 1:1 le bleu Trypan. Compter les cellules avec une chambre standard de Neubauer.
    13. Les cellules à 109 cellules/175 cm2 T-flacon de 25 mL de milieu de graines comme décrit dans 1.1.11. Vous pouvez également diviser la suspension de germes entiers dans jusqu'à dix flacons de culture 175 cm2 cellules sans compter. À ce stade, les hBMSCs ne sont pas distinguables des érythrocytes, dont beaucoup sont plus nombreux que les. hBMSCs apparaîtra en tant que colonies éparses (1-2/ballon) au cours des 7 premiers jours.
    14. Moyen de changement après 4 jours d’ensemencement afin de permettre l’interaction entre les cellules sanguines et le hBMSCs. Après la première bourse moyenne, changer le milieu tous les 2-3 jours. Effectuer l’échange moyen en supprimant complètement le milieu de culture avec une pipette graduée en plastique, laver deux fois avec le SPD (en ajoutant 10 mL de SPD pour les cellules adhérentes et supprimant totalement le SPD avec une pipette graduée en plastique) et puis en ajoutant 20 mL de milieu frais, tel que décrit dans 1.1.11.
  2. Des cellules endothéliales microvasculaires cutanées (HDMECs)
    1. Traiter les biopsies de la peau et d’isoler les HDMECs selon les protocoles publiés antérieurement21. En bref, après la séparation du derme de l’épiderme, incuber le derme en trypsine pendant 40 min à 37 ° C et 5 % de CO2. Après un temps d’incubation, transférer le derme à une boîte de Pétri contenant le milieu de culture et gratter chaque pièce à l’aide d’un scalpel. Transférer la suspension cellulaire obtenue dans un tube en plastique de 50 mL et centrifuger pendant 5 min à 300 x g et 22 ° C. Compter de la suspension de cellules à l’aide d’une chambre de Neubauer et semences à une densité de 1,2 x 104 cellules/cm2. Changer le milieu complètement tous les deux jours.

2. mise en place et stérilisation des flacons de spinner et RCP microporteurs bioréacteur

  1. Flacons de Spinner et RCP microporteurs
    1. Un jour avant les expériences, mise en place le fileur fioles et les préparer pour la stérilisation par autoclave.
      Remarque : Laissez les bouchons des flacons spinner lâche et, lorsque cela est possible, les stériliser en position verticale.
      1. Enveloppez séparément les fioles de cône avec du papier aluminium autour des protections latérales pour éviter toute contamination pendant le déballage. Envelopper les flacons avec 1-2 couches de papier d’aluminium pour autoclave afin de minimiser les risques de contamination après la stérilisation.
    2. Peser la quantité nécessaire de RCP macroporeux microporteurs dans 20 mL de SPD.
      Remarque : il faut 30 mg par flacon de spinner. Laissez-les vous hydrater pendant au moins 1 h avant la stérilisation par la chaleur par autoclave (121 ° C pendant 15 min).
  2. Bioréacteur à perfusion
    1. Utiliser le système de bioréacteur décrit pour produire les tissus vascularisés équivalents20. Ce bioréacteur compose d’un bâtiment, dans lequel est placé le biomatrix, un réservoir moyen et une bouteille de pression.
      1. Connectez le navire avec le réservoir moyen et la bouteille de pression par le biais de tubes de silicone (voir Figure 3). Laisser les capuchons de lâche et placez-le dans un sac en plastique de l’autoclave, fermez bien et cela placer dans un deuxième sac en plastique de l’autoclave. Stériliser à l’autoclave.

3. culture de hBMSCs et HDMECs sur Microsupports macroporeux RCP

Remarque : Les HDMECs utilisées pour amorcer la RCP microporteurs sont marquées avec le DP par transduction des gènes. Ce protocole a été modifié après un protocole déjà publiées5.

  1. Laissez la RCP macroporeux microporteurs se déposent au fond et lavez-les avec 10 mL de milieu de culture. Répéter 3 fois.
  2. Laver les flacons de spinner avec 10 mL de milieu de culture.
  3. Ajouter 30 mg des microporteurs macroporeux RCP par flacon spinner dans 8 mL de milieu de culture. Equilibrer les fioles de spinner contenant les microporteurs RCP à 37 ° C et 5 % de CO2 pendant 30 min, avant d’ensemencer les cellules.
    NOTE : Ceci est basé sur poids sec approximatif des microporteurs RCP avant la stérilisation.
  4. Graines de 5 x 105 hBMSCs ou HDMECs (passage 3) par flacon de spinner dans 2 mL de milieu de culture.
  5. Placer les fioles de casserole sur la plaque de l’agitateur et la démarrer en remuant à 90 tr/min pendant 5 min et reste pendant 55 min, à 37 ° C et 5 % CO2, pour un total de 1 h statique/dynamique d’incubation. Répéter 4 fois.
  6. Ajouter 10 mL de milieu de culture cellulaire par flacon de spinner, puis lancez continue en remuant à 95 t/mn. Incuber à 37 ° C et 5 % de CO2.
  7. À l’aide d’une micropipette prélever des échantillons à jours 1, 4 et 7:333 µL d’ADN contenu (~ 0,5 mg), 1000 µL pour l’analyse de SEM (~ 1,5 mg) et 333 µL pour vivre/dé la souillure (~ 0,5 mg).
    NOTE : Ceci est basé sur poids sec approximatif des microporteurs RCP avant la stérilisation.
  8. Changement 10 mL de milieu de culture tous les deux jours. Pour ce faire, attendez que les microporteurs RCP se déposent au fond et aspirer très soigneusement 10 mL du flacon de cône d’hélice, à l’aide d’une pipette de 10 mL et puis ajouter 10 mL de milieu de culture frais.
  9. Garder les cultures sur la plaque de l’agitateur fixé à 95 tr/min, à 37 ° C et 5 % de CO2 pendant 7 jours.

4. la teneur en ADN, analyse de SEM, vivre coloration morts et test de germination

  1. Teneur en ADN
    1. À l’aide d’une micropipette, recueillir environ 0,5 mg des microporteurs de chaque fiole spinner (contenue dans 333 µL de suspension) et le transfert d’un tube en plastique de 2 ml.
      NOTE : Ceci est basé sur poids sec approximatif des microporteurs RCP avant la stérilisation.
    2. Laver une fois avec 1 mL de SPD, puis aspirer le surnageant.
    3. Enlevez restant SPD dans un lyophilisateur et poids les microporteurs lyophilisée pour normalisation ultérieure.
    4. Congeler les échantillons à-80 ° C pendant au moins 6 h.
    5. Incuber les échantillons à 60 ° C pendant la nuit avec 300 papaïne µL 5 U/mL.
    6. Établir les courbes de titrage approprié suivant les instructions de manufacturer´s de l’essai de quantification (p. ex., test d’ADN double brin PicoGreen) kit et effectuent la mesure du signal fluorescent à 520 nm avec un détecteur de luminescence.
  2. Scanning electron microscopy (SEM) analyse
    1. Recueillir env. 1 mg des microporteurs de chaque fiole spinner et le transfert d’un tube en plastique de 2 mL.
    2. Laver des microporteurs une fois avec 1 mL de SPD.
    3. Retirez la SPD et incuber dans 1 mL d’éthanol à 70 % pendant 1 h.
    4. Éliminer le surnageant et incuber dans 1 mL d’éthanol à 80 % pendant 1 h.
    5. Éliminer le surnageant et incuber dans 1 mL d’éthanol à 90 % pendant 1 h.
    6. Éliminer le surnageant et incuber dans 1 mL d’éthanol à 100 % pendant 1 h.
    7. Éliminer le surnageant et incuber dans 1 mL de hexaméthyldisilazane pendant 10 min.
    8. Ouvrir le bouchon et laisser sécher jusqu’au lendemain des échantillons sous une hotte chimique.
    9. Difficulté des échantillons sur un soutien approprié et procéder à l’analyse de SEM selon des protocoles établis.
  3. DAPI et Live/Dead coloration
    1. Au jour 2, 4 et 7 après cellule ensemencement sur les microporteurs recueillir 0,5 mg des microporteurs de chaque fiole spinner et le transfert d’un tube en plastique de 2 mL. Laver une fois avec 1 mL de SPD.
    2. DAPI
      1. Difficulté des échantillons pendant 10 min dans assez de paraformaldéhyde à 4 % pour les couvrir.
      2. Laver une fois avec 1 mL de SPD.
      3. Incuber à température ambiante avec la solution colorante pendant 45 min sur un agitateur basculant.
      4. Détecter le signal fluorescent DAPI sur un microscope à fluorescence avec un filtre de d’émission 420 nm et acquisition d’images.
    3. Live/Dead coloration
      1. Incuber les échantillons à 500 µL de solution de colorant Live/Dead. Conserver les échantillons à 37 ° C pendant 20 min, abri de la lumière.
      2. Laver une fois avec 1 mL de SPD.
      3. Détecter le signal de fluorescence des cellules vivantes avec une 490 nm-filtre d’émission et de cellules mortes avec un filtre d’émission 545 nm un microscope à fluorescence. Acquisition d’images.
    4. Test de germination pour HDMECs
      1. Mix 330 µL de solution de collagène R 0,4 %, 170 µL de 0,1 % d’acide acétique et 50 µL de milieu M199 dans un tube en plastique de 15 mL. Rester sur la glace.
      2. Prendre ~0.375 mg des microporteurs (250 µL) à l’aide d’une micropipette. Transférer dans un tube en plastique de 1,5 mL, attendez que les microporteurs RCP à déposer au fond et enlever le support complètement.
        NOTE : Ceci est basé sur poids sec approximatif des microporteurs RCP avant la stérilisation.
      3. Ajouter le volume de NaOH 0,2 N nécessaire pour neutraliser le mélange de collagène et mélanger immédiatement avec les microporteurs RCP.
        NOTE : Déterminer la quantité requise de NaOH 0,2 N à l’avance en l’ajoutant au mélange jusqu’au changement de pH (tourner, de couleur jaune à rose) et puis placer le mélange dans l’incubateur pendant 1 min, après quoi un gel doit être formé.
      4. Plaque de mélange collagène gel-RCP microporteurs dans un puits d’une plaque 24 puits. Incuber à 37 ° C et 5 % CO2 pendant 30 min.
      5. Ajouter 200 µL du facteur de croissance endothélial vasculaire (p. ex., milieu de culture VascuLife VEGF-Mv). Incuber à 37 ° C et 5 % de CO2 pendant 24 h.
      6. Observer sous un microscope à contraste de phase inversé, à l’aide d’un 10 X objet de grossissement et acquisition d’images.

5. Biomatrix amorçage et démarrage du système de bioréacteur pour HDMECs

  1. Un jour avant de démarrer les cultures de bioréacteur, couper BioVaSc ouvert (le biomatrix) longitudinalement sur le côté antimesenteric et le fixer dans un cadre préalablement désinfecté en polycarbonate (voir la Figure 3 a, B).
    Remarque : Le BioVaSc est un biomatrix obtenu à partir d’un segment de jéjunum de porc DECELLULARISE, préparé comme précédemment publié21.
    Remarque : comme le châssis en polycarbonate ne peuvent pas être stérilisé par la chaleur, désinfecter par incubation de 20 min dans le bain à ultrasons (40 kHz) suivie de 3 fois d’incubation dans l’éthanol 70 % pendant 25 min. Ensuite, lavez le cadre 3 fois avec SPD stérile.
    1. Placer le système de biomatrix-cadre dans une boîte de Pétri de 100 mm et remplissez-le avec le facteur de croissance endothélial vasculaire + 1 % pénicilline streptomycine (Pen/Strep).
    2. Equilibrer la biomatrix en incubant pendant une nuit à 37 ° C et 5 % de CO2.
  2. Après la séparation et les cellules de comptage, injecter 10 x 107 HDMECs à 1000 µL de milieu de culture par le biais de la vascularisation préservée de la biomatrix, à l’aide d’une seringue de 2 mL.
    NOTE : Injecter environ 700 µL à travers l’entrée artérielle et ~ 300 µL par la sortie de la veine.
  3. Incuber à 37 ° C et 5 % de CO2 pendant 3 h, pour permettre la fixation des cellules.
  4. Remplir le système de bioréacteur avec 350 mL du facteur de croissance endothélial vasculaire + 1 % Pen/Strep et incuber à 37 ° C et 5 % de CO2.
  5. Placer le cadre à l’intérieur du navire du bioréacteur. Connecter les pédicules artériels et veineux au navire.
  6. Commencer la perfusion en connectant le système de bioréacteur à une pompe péristaltique. Régler la pression à 10 ±1 mmHg et amplitude.
  7. Augmenter la pression progressivement toutes les heures jusqu'à 100 mmHg de pression, amplitude ±20.
  8. Maintenir le système de bioréacteur pendant 7 jours dans ces conditions à 37 ° C et 5 % de CO2.

6. Ajout de DP-HDMECs à la biomatrix

  1. Mix 330 µL d’une solution de collagène R de 0,4 %, 170 µL de 0,1 % d’acide acétique et 50 µL de milieu M199 dans un tube Falcon de 15 mL. Rester sur la glace.
  2. Prenons les microporteurs RCP de fioles spinner. Retirez complètement le milieu de culture.
  3. Ajouter le volume de NaOH 0,2 N nécessaire pour neutraliser le mélange de collagène et mélanger immédiatement avec les microporteurs RCP.
  4. Ajouter le mélange de microporteurs de gel-RCP de collagène sur la lumière de la biomatrix. Permettre la gélification pendant 30 min.
  5. En parallèle, changer le support du bioréacteur en enlevant le milieu complètement et puis ajouter 350 mL de frais, pré réchauffé, facteur de croissance endothélial vasculaire + 1 % Pen/Strep.
  6. Connectez le bioréacteur à la pompe péristaltique et la pression à 100 ±20 mmHg et amplitude.
  7. Changer le milieu tous les 7 jours.
  8. Gardez le bioréacteur en culture pendant 21 jours.

7. analyse et afficheurs des cultures de bioréacteur

  1. Préparation des échantillons
    1. Débranchez le biomatrix le bioréacteur et retirez-le du châssis en polycarbonate.
    2. Couper le morceau obtenu en 6 sections : 2 pour le MTT, 2 pour la paraffine incorporation/coloration et 2 pour l’analyse de la SEM.
  2. Enrobage de paraffine
    1. Déposer les éléments dans une boîte de Pétri et laver avec assez SPD pour les couvrir. Jeter le SPD.
    2. Difficulté les sections de paraformaldéhyde à 4 % du jour au lendemain.
    3. Préparer les cassettes pour l’enrobage de paraffine et effectuez-la conformément aux protocoles standards.
    4. Préparer les sections dans des blocs de paraffine et découpe des échantillons de 3 µm pour la coloration H & E, à l’aide d’un microtome.
  3. H & E coloration
    1. Tacher les sections réhydratées selon des protocoles standard32.
  4. Scanning electron microscopy (SEM) analyse
    1. Déposer les éléments dans une boîte de Pétri et laver avec assez SPD pour les couvrir. Jeter le SPD.
    2. Difficulté les sections au glutaraldéhyde 4,75 % du jour au lendemain.
    3. Effectuer la chaîne déshydratation avec augmentation des concentrations d’éthanol 50 % - 100 %.
    4. Couvrir les sections avec l’hexaméthyldisilazane (HMDS) pendant 10 min. jeter le HMDS usagé et ajouter HMDS fraîche.
    5. Laisser les sections sécher pendant la nuit sous la hotte et puis préparer les échantillons pour l’imagerie.
  5. 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)
    1. Mélanger le réactif MTT avec le facteur de croissance endothélial vasculaire, à une concentration de 1 mg/mL.
    2. Incuber les sections dans la solution MTT pendant 90 min à 37 ° C et 5 % de CO2.
    3. Observer les structures vasculaires et graines cellule microporteurs macroscopiquement ou sous un microscope lumineux-zone, pour détecter les cellules métaboliquement actives. Acquisition d’images.

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Representative Results

Comme le montre la Figure 1 a, nous avons obtenu un nombre élevé de cellules viables sur la RCP microporteurs après 7 jours de culture, déterminé par coloration au live/dead. Ces résultats ont été confirmés par l’analyse de SEM, dans lequel des microporteurs complètement colonisés ont été observées autour des pores, recouvrant en partie eux (Figure 1 b). En revanche, expériences dans lequel cellules n’étaient pas uniformément semés a entraîné plusieurs microporteurs vides. Expériences ratées sont caractérisent par un nombre anormalement élevé de cellules mortes qui ne devrait pas être plus 10 % du montant total de cellules (Figure 1). En outre, quantification contenue ADN de HDMECs ont montré une augmentation de l’ADN double brin au fil du temps (Figure 1).

En outre, DP-HDMECs ont pu maintenir leur fonctionnement après culture sur Microsupports RCP, comme illustré à la Figure 2, où les cellules a adopté un phénotype germination lorsqu’il est cultivé dans un gel de collagène.

En outre, nous avons utilisé microporteurs DP-HDMECs-colonisé RCP pour réensemencer la lumière de la biomatrix BioVaSc. Pour ce faire, nous avons utilisé un système de bioréacteur pour perfusion physiologique des tissus vascularisés équivalents22 (Figure 3) où l'on coupe ouverte la biomatrix et placé dans un cadre en polycarbonate, afin que la lumière a été exposée dans une même installation ( Figure 3 b).

Après 21 jours de cultures de bioréacteur, cellules métaboliquement actives étaient présents aussi bien sur la vascularisation préservée de la biomatrix, ainsi que sur les microporteurs RCP (Figure 4 a et Figure 3 b). Expériences ratées ou un mauvais choix de tranches au cours de la section des échantillons histologiques peut conduire à l’absence de colonisation des cellules endothéliales dans la lumière des vaisseaux de la biomatrix ou sur les microporteurs. Ces résultats pourraient être confirmées par analyse de SEM des sections biomatrix, où il pouvait observer que certaines zones de la RCP microporteurs étaient encore couvertes par les cellules et que les microporteurs RCP étaient à proximité immédiate de la biomatrix (Figure 4 et ( 4D).

Enfin, la coloration H & E a confirmé la présence de HDMECs sur le biomatrix, spécifiquement dans les structures vasculaires (Figure 5 a). Observés sous microscope à fluorescence, les cellules qui colonisent les structures vasculaires de la biomatrix entraîné pour être DP-HDMECs (Figure 5 b), indiquant la migration des cellules de la RCP microporteurs à la biomatrix. Certains DP-HDMECs ont aussi été observés sur la RCP microporteurs (Figure 5 et 5D). Dans les expériences où les cellules n’ont pas survécu à cause de modifié (p. ex. temps de culture plus courts) des conditions de culture, ils ne pouvaient être détectées à l’intérieur de la structure vasculaire avec aucun des techniques a déjà été indiqués (Figure 5E et 5F ).

Figure 1
Figure 1 : Culture de HDMECs et hBMSCs sur Microsupports RCP. (A, C) live/dead coloration après 7 jours de cultures dynamiques. (B) analyse des SEM de HDMECs cultivés sur Microsupports RCP après 7 jours de cultures dynamiques. Contenu en ADN (D) déterminé par kit de dosage PicoGreen. Données exprimées en moyenne ± écart-type (n = 3). Barreaux de l’échelle : 200 µm pour A, 88 µm pour B et 100 µm pour C. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : test de germination. Germes de DP-HDMECs peuvent être observées sous lumineux-zone (A) et la fluorescence microscopy (B), qui sortent d’un l’avec des microporteurs RCP colonisés après 24h de culture dans un gel de collagène. (C) image de superposition. Barreaux de l’échelle : 100 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : installation Biomatrix et bioréacteur. (A) préparation du biomatrix et montage sur le cadre en polycarbonate (B). (C) montage de bioréacteur. Le navire est relié au réservoir moyen et la bouteille de pression par le biais de tubes de silicone, et l’ensemble du système est relié à une pompe péristaltique. La pression est mesurée par un capteur de pression. AI: entrée d’artérielle ; VO: sortie veineuse. Ce chiffre a été modifié par Groeber et al. 22 S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : lecture de bioréacteur. MTT test réalisé sur une section biomatrix après 21 jours de culture, dans lequel les cellules métaboliquement actives ont été observés dans la vascularisation préservée de la biomatrix (A) ainsi que sur la RCP microporteurs (B). (C, D) Images de SEM des microporteurs RCP sur une section biomatrix. Barreaux de l’échelle : 0,28 cm pour A, 0,45 cm pour B, 47 µm pour C et 225 µm pour D. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : images de coloration & fluorescence H & E. (A, C, E) H & E de coloration. (B, D, F) Après 21 jours de culture, DP-HDMECs ont été observés à l’intérieur de la vascularisation de la biomatrix (flèches), ainsi que sur la RCP microporteurs (têtes de flèche). Barreaux de l’échelle : 50 µm pour A-D et 30 µm pour E et F. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Un des buts principaux d’avec des microporteurs sont l’expansion des cellules tout en conservant leur différenciation afin de livrer des cellules au lieu de nécessité. La méthode représentée introduire des microporteurs RCP où les cellules ont pu fixer, prolifèrent et coloniser les microporteurs avec haute densité cellulaire. Cela a été observé par live/dead coloration, dans lequel plus de 90 % des cellules viables ont été détectés alors que seulement quelques cellules mortes ont été obtenus après 7 jours de cultures dynamiques. De même, les images de SEM a confirmé que les cellules couvert toute la surface de la microporteurs après 7 jours de cultures.

Afin d’assurer la survie des cellules dans des modèles 3D, il est important de maintenir l’approvisionnement en oxygène et des nutriments vers les cellules et permet l’élimination des déchets. Les vaisseaux sanguins sont les structures responsables de ce processus d’échange, dans lequel les cellules endothéliales jouent un rôle clé puisqu’ils sont les cellules qui tapissent la partie intérieure des vaisseaux sanguins,23. Ils ont la capacité à proliférer, migrer, adhérer, germent et forment des structures ressemblant à des navires24. Ces propriétés ont été maintenues après culture de DP-HDMECs sur les microporteurs RCP, puisqu’il a été observé que les cellules étaient en mesure d’adopter le phénotype sprouting (voir Figure 2). Ici, nous pourrions prouver que ces colonisés microporteurs RCP ont été livrer efficacement primaires cellules endothéliales pour réensemencer le lumen d’anciens navires de la BioVaSc biomatrix. Ceci suggère notre système pour être utilisés améliorer la vascularisation des implants de tissus conçus pour des applications cliniques. Dérivés de cette matrice ont été utilisés avec succès dans la vascularisation approches25, ainsi que dans in vitro tumeur tester sytems21,26,27,28 et pour la production des équivalents de la peau comme des alternatives à l’expérimentation animale29. Ici il est utilisé dans un ouvert, aplatie Set-up et placés dans un bioréacteur de perfusion tel qu’appliqué pour la génération de tissus équivalents22.

Bioréacteurs ont été utilisés en génie tissulaire pour produire des équivalents de tissus qui pourraient aider à soulager la demande d’organes tout en réduisant les risques associés comme le rejet et la morbidité30. Cependant, produisant des tissus comme des constructions est un processus très complexe qui implique l’utilisation de types de cellules de tissu-spécifique, un échafaudage approprié et des facteurs de croissance qui permettent la différenciation adéquate et l’assemblage en 3D tissus. Un inconvénient majeur de l’ingénierie constructions est l’absence d’un véritable réseau vasculaire qui prend en charge la survie des cellules in vitro et in vivo17. Ici, nous combinons les microporteurs RCP-colonisé avec une matrice DECELLULARISE dans un modèle de bioréacteur, fournissant le type de cellule requis, un échafaudage qui permet l’adhésion cellulaire et la formation de vaisseaux et un milieu de culture spécifique qui fournit les facteurs essentiels pour les cellules prolifèrent et maintenir leurs propriétés fonctionnelles. Un résultat significatif de ce modèle est la capacité des HDMECs pour migrer de la RCP microporteurs vers l’échafaud sans détachement supplémentaire ou digestion comme nécessaires dans les autres approches31. Par la suite, ils ont colonisé spécifiquement les structures vasculaires de la matrice, prouver le concept que macroporeux microporteurs peut servir comme système de diffusion des cellules à des fins de la médecine régénérative.

Au total, ce protocole représente une stratégie prometteuse en médecine régénératrice pour l’obtention d’une expansion des cellules agrandie et il pourrait servir de livraison de la cellule à des sites d’implantation, où il pourrait améliorer le soutien de la vascularisation des greffes de tissus conçus.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

La recherche ayant abouti à ces résultats a reçu un financement de l’Union européenne septième cadre Programme FP7/2007-2013 au titre de la subvention contrat n ° 607051 (BIO-inspirer). Nous remercions Carolien van Spreuwel-Goossens de Fujifilm fabrication Europe B.V., de l’assistance technique pendant la fabrication de RCP et Werner Stracke Fraunhofer Institute pour l’ISC de Silicate de recherche, d’aide à l’analyse de la SEM.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide (MTT) Serva Electrophoresis GmbH 20395.01
4’,6-Diamidino-2-phenylindoldihydrochloride (DAPI) Sigma-Aldrich D9542
Acetic acid 100% Sigma-Aldrich 533,001
Analytical balance Kern EG 2200-2NM Kern & Sohn GmbH
Ascorbate-2-phosphate Sigma-Aldrich A8960
Bioreactor Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Wuerzburg, Germany
Bright field microscope Axiovert 40C Carl Zeiss AG
Cellnest Fujifilm
Centrifuge tubes (15 mL, 50 mL) Greiner Bio-One
Collagen R solution 0,4% Serva Electrophoresis GmbH 47254.01
DMEM-F12 Gibco 11320-033
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich D8537 Modified, without calcium chloride and magnesium chloride
Eosin 1% Morphisto 10177.01000
Ethanol 96% Carl Roth GmbH T171.4 Denatured
Fetal calf serum (FCS) Bio&SELL FCS.ADD.0500 not heat-inactivated
Fluorescence microscope BZ-9000 Keyence
Haematoxylin Morphisto 10231.01000
Hexamethyldisilazane Sigma-Aldrich 440191 Reagent grade, ≥99%
Incubator for bioreactor Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Wuerzburg, Germany
Live/Dead Cell Double Staining Kit Fluka 04511KT-F
Magnetic stirrer plate 2Mag 80002
Medium 199 Sigma-Aldrich M0650 10X
Microplate reader
Tecan Infinite M200		 Tecan
Needle 21G 16mm VWR 613-5389
Papain from papaya latex Sigma-Aldrich P4762 lyophilized powder, ≥ 10 units/mg protein
Paraffin Carl Roth GmbH 6642.6
Penicillin/Streptomycin Sigma-Aldrich P4333
Peristaltic pump Ismatec
Quanti-iT PicoGreen dsDNA assay kit Thermo Fischer Scientific P7589
Histofix 4% Carl Roth GmbH P087
Scanning Electron Microscope Supra 25 Carl Zeiss AG
Sodium hydroxide solution 1.0 N Sigma-Aldrich S2770
Spinner flasks (25 mL) Wheaton 356879
Syringe 1 mL VWR 720-2561
Tissue culture flasks (25 cm2, 75 cm2, 150 cm2) TPP Techno Plastik Products AG
Trypan blue 0.4% Sigma-Aldrich T8154
VascuLife VEGF-Mv Lifeline cell technology LL-0005

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