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Bioengineering

संयोजक कोलेजन मैं सेल विस्तार और एक प्रतिक्रिया मॉडल में सेल वितरण प्रणाली के रूप में उनके संभावित उपयोग के लिए पेप्टाइड Microcarriers

Published: February 7, 2018 doi: 10.3791/57363
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 3, 1,2
1Department Tissue Engineering and Regenerative Medicine, University Hospital Wuerzburg, 2Translational Center Regenerative Therapies (TLC-RT), Fraunhofer Institute for Silicate Research ISC, 3Fujifilm Manufacturing Europe B.V.

Summary

हम एक macroporous microcarriers पर एक सेल विस्तार प्रोटोकॉल का प्रस्ताव है और एक छिड़काव में वितरण प्रणाली के रूप में उनके उपयोग एक सेलुलर ऊतक मैट्रिक्स बीज के लिए प्रतिक्रिया । हम भी सेल प्रसार और microcarriers पर प्रसंस्कृत कोशिकाओं की व्यवहार्यता का निर्धारण करने के लिए विभिंन तकनीकों में शामिल हैं । इसके अलावा, हम प्रतिक्रियात्मक संस्कृतियों के बाद कोशिकाओं की कार्यक्षमता का प्रदर्शन ।

Abstract

ऊतक इंजीनियरिंग एक होनहार क्षेत्र, ऊतकों और प्रत्यारोपण प्रयोजनों के बारे में अंगों पर बढ़ती मांग के लिए समाधान विकसित करने पर ध्यान केंद्रित है । इस प्रक्रिया के ऊतकों को उत्पन्न करने के लिए जटिल है, और सेल के विकास और भेदभाव का मार्गदर्शन करने के लिए विशिष्ट कोशिका प्रकार, पाड़, और शारीरिक या जैव रासायनिक उत्तेजनाओं का एक उपयुक्त संयोजन भी शामिल है । Microcarriers एक अपील उपकरण का प्रतिनिधित्व करने के लिए एक तीन आयामी (3 डी) microenvironment में कोशिकाओं का विस्तार, क्योंकि वे उच्च सतह प्रदान करने के लिए मात्रा अनुपात और अधिक निकटता की नकल vivo स्थिति में पारंपरिक दो आयामी तरीकों की तुलना में । संवहनी प्रणाली, कोशिकाओं के लिए ऑक्सीजन और पोषक तत्वों की आपूर्ति और अपशिष्ट हटाने सुनिश्चित करने, इंजीनियर ऊतकों पैदा जब एक महत्वपूर्ण इमारत ब्लॉक का गठन किया । वास्तव में, सबसे निर्माण के बाद विफल संवहनी समर्थन की कमी के कारण प्रत्यारोपित किया जा रहा है । इस अध्ययन में, हम संयोजक कोलेजन पर endothelial सेल विस्तार के लिए एक प्रोटोकॉल वर्तमान स्पिनर कुप्पी और उपप्रतिक्रियाओं में गतिशील शर्तों के तहत microcarriers आधारित है, और हम इस सेटिंग सेल व्यवहार्यता और कार्यशीलता में निर्धारित करने के लिए कैसे समझा । इसके अलावा, हम अतिरिक्त टुकड़ी आवश्यक कदम के बिना vascularization प्रयोजनों के लिए सेल डिलीवरी के लिए एक विधि का प्रस्ताव । इसके अलावा, हम एक सेलुलर जैविक मैट्रिक्स पर एक छिड़काव प्रतिक्रियाकर्ता में सेल vascularization क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए एक रणनीति प्रदान करते हैं । हम मानते है कि प्रस्तुत विधियों का उपयोग नैदानिक अभ्यास में ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों की एक बड़ी रेंज के लिए नए सेल आधारित उपचारों के विकास के लिए नेतृत्व कर सकता है ।

Introduction

ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों में एक सामांय समस्या की जरूरत के स्थान पर सही भेदभाव phenotype के साथ एक उच्च कोशिका द्रव्यमान उपज है । microcarriers के इस मुद्दे को संबोधित करने के लिए आवेदन १९६७ में इस तरह की त्वचा, हड्डी, उपास्थि, और tendons1के बड़े पैमाने पर पीढ़ी के लिए आर्थोपेडिक ऊतक इंजीनियरिंग के रूप में क्षेत्रों में तारीख को बढ़ाने के महत्व के साथ शुरू कर दिया । वे अतिसूक्ष्म तीन आयामी (3 डी) सब्सट्रेट पर कोशिकाओं का विस्तार करके निलंबन संस्कृतियों के2 के समान तरीके में अनुयाई संस्कृतियों की हैंडलिंग की अनुमति देते हैं । जिससे कोशिकाओं को एक सजातीय पोषक तत्व की आपूर्ति और सेल मैट्रिक्स बातचीत का अनुभव है कि vivo3,4 भेदभाव जो अक्सर 2d दृष्टिकोण5में समय पर खो दिया है के बेहतर रखरखाव के लिए सीसा । एक उच्च सतह से मात्रा अनुपात-अंततः उच्च कोशिका पैदावार के लिए अग्रणी6,7, उच्च गैस और पोषक तत्वों विनिमय स्थैतिक प्रणालियों के लिए8की तुलना दरों, संभावना को विनियमित करने के लिए और संस्कृति के अधीन करने के लिए शारीरिक 9उत्तेजनाओं, और विस्तार की प्रक्रिया7 के ऊपर स्केलिंग के लिए संभावित आगे लाभ कर रहे हैं । कई सुविधाओं जैसे व्यास, घनत्व, porosity, भूतल प्रभारी, और आसंजन गुण10,11 अलग व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सूक्ष्म और स्थूल-वाहक भेद । हालांकि, मुख्य लाभ में से एक साइट दोष या मांग करने के लिए microtissues के रूप में उनके प्रसव की क्षमता है ।

अस्थि ऊतक इंजीनियरिंग में microcarrier प्रौद्योगिकी के अनुप्रयोगों के लिए, हम एक पिछले रिपोर्ट में सचित्र12 एक नया microcarrier प्रकार का उत्पादन एक संयोजक कोलेजन का गठन मैं पेप्टाइड (आरसीपी, Cellnest के रूप में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध). यह नया microcarrier एक नैदानिक परिदृश्य में सेल डिलीवरी के लिए जरूरत के रूप में पाड़ और कोशिका उत्पादन के लिए जीएमपी-अनुरूपित अप स्केलिंग की अनुमति देता है । इस संदर्भ में, पाड़ स्थिरता, गिरावट की दर की ट्यूनिंग, और एक अनुकूल crosslinking रणनीति के उचित विकल्प के माध्यम से सतह संपत्तियों के लिए चयनित आवेदन, ब्याज या लक्ष्य ऊतक के सेल प्रकार13के लिए तकनीक अनुकूलन की अनुमति देता है । विशेष रूप से, चिकित्सीय आवेदन14 के लिए एक इंजेक्शन कोशिका वितरण प्रणाली के रूप में इस microcarrier के संभावित रोजगार एक नैदानिक सेटिंग में उन्हें विशेष रूप से दिलचस्प बनाता है.

इस पत्र में, हम इसलिए अलगाव और मानव अस्थि मज्जा के विस्तार के लिए संवर्धन प्रक्रिया वर्णन-व्युत्पंन mesenchymal stromal कोशिकाओं (hBMSCs) और मानव चमड़े का microvascular endothelial कोशिकाओं (HDMECs) पर कोलेजन-I-आधारित संयोजक पेप्टाइड-आधारित microcarriers, और एक नैदानिक सेटिंग में वितरण के लिए उनकी तैयारी. इसके अलावा, हम अतिरिक्त प्रोटोकॉल आरोपण पर सेल व्यवहार्यता के रखरखाव के लिए उपयोगी का वर्णन ।

कोशिका व्यवहार्यता के बाद आरोपण वास्तव में दृढ़ता से vascularization पर निर्भर है15,16,17, जो ऑक्सीजन और पोषक तत्वों का आदान प्रदान सुनिश्चित करता है और अपशिष्ट हटाने की सुविधा. एक दृष्टिकोण का गठन करने के लिए ऊतक इंजीनियरिंग में vascularization चुनौतियों को दूर करने और बनाए रखने के सेल व्यवहार्यता, संस्कृति माध्यम के छिड़काव जिससे ऑक्सीजन और पोषक तत्वों18प्रदान करने के माध्यम से । यहां, हम एक में इन विट्रो विधि का वर्णन करने के लिए आरसीपी microcarriers से एक microvascular endothelial कोशिकाओं के प्रवास की क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए एक और उनके लिए डी नोवो vascularization और angiogenesis में योगदान करने की क्षमता । इस जैव मैट्रिक्स सुअर jejunum BioVaSc (जैविक संवहनी पाड़), कोलेजन और elastin में अमीर और संरक्षित संवहनी संरचनाओं, जो एक खिला धमनी और एक draining नस19 है कि किया गया है शामिल है के साथ संपंन खंड है 20आरोपण मुद्दों के लिए आवेदन किया ।

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Protocol

hBMSCs पुराने ऑस्टियोआर्थराइटिस रोगियों फीमर सिर प्रतिस्थापन सर्जरी के दौर से गुजर के फीमर सिर से अलग थे । Wuerzburg विश्वविद्यालय की स्थानीय एथिक्स कमेटी की स्वीकृति के तहत प्रक्रिया का निष्पादन किया गया तथा मरीजों की सहमति की जानकारी दी गई । प्राथमिक microvascular endothelial कोशिकाओं किशोर दाताओं की चमड़ी बायोप्सी से अलग किया गया । उनके कानूनी प्रतिनिधि (ओं) को लिखित रूप में पूर्ण सूचित सहमति प्रदान की । यह अध्ययन Wuerzburg विश्वविद्यालय के स्थानीय एथिकल बोर्ड (182/10 वोट) द्वारा अनुमोदित किया गया था ।

1. hBMSCs और HDMECs का अलगाव

  1. मानव अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न mesenchymal stromal कोशिकाओं (hBMSCs)
    1. एक बाँझ चम्मच का उपयोग करके फीमर सिर से चिमड़ा हड्डी निकालें.
      नोट: चिमड़ा हड्डी cortical हड्डी के अंदर एक ढीला और दानेदार पदार्थ के रूप में प्रकट होता है, जो कठिन और कठोर है । यह एक स्केलपेल का उपयोग करके cortical हड्डी से चिमड़ा हड्डी के भागों खरोंच करने के लिए आवश्यक हो सकता है ।
    2. २ ५० मिलीलीटर ट्यूबों में निकाली चिमड़ा हड्डी डालें । चिमड़ा हड्डी की मात्रा हिप रिप्लेसमेंट सर्जरी के दौरान निकाले फीमर सिर के आयाम के अनुसार 5 से 10 मिलीलीटर से भिन्न हो सकते हैं ।
    3. DMEM-F12 (DMEM और हैम F12 मध्यम के 1:1 मिश्रण) के साथ धो लें, ट्यूब मध्यम के लगभग 30 मिलीलीटर के साथ भरने ।
    4. ट्यूब को मैन्युअल रूप से हिलाएं, एक अनुदैर्ध्य तरीके से, 5 एस के लिए वसा कोशिकाओं को चिमड़ा की हड्डी से बाहर जाने के लिए । 5 मिनट के लिए ३०० x g और 22 ° c पर केंद्रापसारक ।
    5. महाप्राण के साथ एक एेसे प्लास्टिक पिपेट, फैट सेल की परत और शेष supernatant के करीब 20 मिलीलीटर । चिमड़ा हड्डी को कवर करने के लिए पर्याप्त माध्यम चलो ।
    6. DMEM-F12 के 10 मिलीलीटर के साथ ट्यूबों भरें और तेजी से हाथ से longitudinally शेक, 10-15 एस के लिए, कोशिकाओं को बाहर जाने के लिए ।
    7. एक नए ५० एमएल ट्यूब करने के लिए ट्यूबों से एक एेसे प्लास्टिक पिपेट के साथ सेल निलंबन के 10-15 एमएल स्थानांतरण ।
    8. दोहराएँ 2-3 बार से कदम 1.1.6 पूलिंग एक साथ प्राप्त सेल निलंबन जब तक चिमड़ा हड्डी में एकत्र ५० एमएल ट्यूब सफेद है.
    9. दो नए ट्यूबों के लिए एक स्नातक की उपाधि प्राप्त प्लास्टिक पिपेट के साथ सेल निलंबन स्थानांतरण, aspirating कोलेजन ५० मिलीलीटर ट्यूबों के तल पर जमा गोली से परहेज ।
    10. 5 मिनट के लिए ३०० x g और 22 ° c पर सेल निलंबन केंद्रापसारक । supernatant को एेसे प्लास्टिक पिपेट से aspirating करके त्यागें ।
    11. जोड़ें ४० मिलीलीटर की DMEM-F12 10% FCS 1% पेन/Strep ५० µ g/एमएल Ascorbate-2-फॉस्फेट एक तीसरी ट्यूब में । प्रत्येक सेल गोली युक्त ट्यूब के लिए इस माध्यम के 5 मिलीलीटर स्थानांतरण । फिर से, ट्यूब के नीचे चंचल द्वारा सेल छर्रों जोरदार निलंबित और केवल माध्यम युक्त ट्यूब के लिए सेल निलंबन स्थानांतरण ।
    12. वैकल्पिक: पतला १०० कोशिकाओं के µ एल सेल गिनती के लिए निलंबन, कमजोर पहले पंजाब के साथ 1:100 और फिर 1:10 trypan नीले रंग में, 15 µ एल जोड़ने के द्वारा 15 µ एल के DPBS और 30 µ एल trypan के लिए एक DPBS: trypan नीला अनुपात 1:1 की प्राप्त करने के लिए । एक मानक Neubauer कक्ष के साथ कोशिकाओं गिनती ।
    13. 1.1.11 में वर्णित के रूप में बीज की 25 मिलीलीटर में 109 कोशिकाओं/175 सेमी2 टी-कुप्पी पर कोशिकाओं । वैकल्पिक रूप से, गिनती के बिना १० १७५ सेमी 2 सेल संस्कृति कुप्पी में पूरे सेल निलंबन विभाजित । इस स्तर पर, hBMSCs एरिथ्रोसाइट्स है, जो बहुत उंहें संख्या से अलग नहीं कर रहे हैं । hBMSCs पहले 7 दिनों के दौरान विरल कालोनियों (1-2/कुप्पी) के रूप में दिखाई देगा ।
    14. hBMSCs के साथ रक्त कोशिकाओं के संपर्क की अनुमति के लिए सीडिंग से 4 दिनों के बाद मध्यम बदलें । पहले मीडियम एक्सचेंज के बाद हर 2-3 दिनों में मीडियम चेंज करें । एक एेसे प्लास्टिक पिपेट के साथ कल्चरल मीडियम को पूरी तरह से हटाकर मीडियम एक्सचेंज करें, DPBS के साथ दो बार धुलाई (अनुयाई कोशिकाओं में DPBS की 10 मिलीलीटर जोड़कर और पूरी तरह से DPBS को एेसे प्लास्टिक पिपेट के साथ निकालकर) और फिर 20 मिलीलीटर जोड़कर ताजा माध्यम, जैसा कि 1.1.11 में वर्णित है ।
  2. मानव अधययन microvascular endothelial कोशिकाओं (HDMECs)
    1. त्वचा बायोप्सी का इलाज करें और पहले से प्रकाशित प्रोटोकॉल के अनुसार HDMECs को अलग करें21। संक्षेप में, एपिडर्मिस से dermis की जुदाई के बाद, trypsin में ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% सह पर ४० मिनट के लिए dermis की मशीन । मशीन समय के बाद, एक पेट्री संस्कृति माध्यम युक्त पकवान के लिए dermis हस्तांतरण, और एक स्केलपेल के उपयोग के साथ एक टुकड़ा खरोंच । एक ५० मिलीलीटर प्लास्टिक ट्यूब करने के लिए प्राप्त सेल निलंबन हस्तांतरण और ३०० x g और 22 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए केंद्रापसारक । १.२ x 104 कोशिकाओं/सेमी2के घनत्व पर एक Neubauer चैंबर और बीज का उपयोग कर सेल निलंबन की गणना । मध्यम पूरी तरह से हर दूसरे दिन बदल जाते हैं ।

2. सेट अप और स्पिनर कुप्पी, आरसीपी microcarriers की नसबंदी, और प्रतिक्रिया

  1. स्पिनर कुप्पी और आरसीपी microcarriers
    1. प्रयोगों से एक दिन पहले सेट ऑफ स्पिनर कुप्पी और आटोक्लेव द्वारा नसबंदी के लिए उन्हें तैयार करते हैं.
      नोट: स्पिनर की टोपियां ढीला बोतल छोड़ दो और, जब संभव हो, उंहें एक ईमानदार स्थिति में निष्फल ।
      1. unwrapping के दौरान संदूषण से बचने के लिए अलग से साइड कैप्स के आसपास एल्यूमीनियम पंनी के साथ स्पिनर कुप्पी लपेटें । autoclaving के लिए एल्यूमीनियम पंनी की 1-2 परतों के साथ कुप्पी लपेटें क्रम में नसबंदी के बाद संदूषण जोखिम को कम करने के लिए ।
    2. DPBS के 20 मिलीलीटर में आरसीपी macroporous microcarriers की आवश्यक मात्रा को तौलना ।
      नोट: 30 मिलीग्राम प्रति स्पिनर कुप्पी की आवश्यकता है । उंहें आटोक्लेव (१२१ ° c 15 मिनट के लिए) द्वारा गर्मी नसबंदी से पहले कम से 1 ज के लिए हाइड्रेट ।
  2. छिड़काव प्रतिक्रियाकर्ता
    1. संवहनी ऊतक के बराबर का उत्पादन करने के लिए वर्णित उपप्रतिक्रिया प्रणाली का प्रयोग करें20। इस प्रतिक्रियाकर्ता एक पोत है, जिसमें है, जिसमें एक मध्यम जलाशय और एक दबाव बोतल रखा है ।
      1. मध्यम जलाशय और सिलिकॉन ट्यूबों के माध्यम से दबाव बोतल के साथ पोत कनेक्ट ( चित्र 3सी देखें). छोड़ कैप्स ढीला और यह एक आटोक्लेव प्लास्टिक की थैली में जगह है, अच्छी तरह से बंद है, और एक दूसरे आटोक्लेव प्लास्टिक की थैली में इस जगह । आटोक्लेव द्वारा निष्फल ।

3. आरसीपी macroporous microcarriers पर hBMSCs और HDMECs की संस्कृति

नोट: HDMECs आरसीपी microcarriers बीज के लिए इस्तेमाल किया आरएफपी के साथ lentiviral transduction द्वारा लेबल थे । इस प्रोटोकॉल को पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल5के बाद संशोधित किया गया था ।

  1. चलो आरसीपी macroporous microcarriers नीचे करने के लिए व्यवस्थित और उंहें संस्कृति मध्यम के 10 मिलीलीटर के साथ धो लो । दोहराएं 3 बार ।
  2. संस्कृति माध्यम के 10 मिलीलीटर के साथ धो स्पिनर कुप्पी ।
  3. कल्चरल मीडियम के 8 एमएल में आरसीपी macroporous microcarriers के प्रति स्पिनर कुप्पी के 30 मिलीग्राम जोड़ें । Equilibrate ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% सह2 पर आरसीपी microcarriers युक्त स्पिनर कुप्पी कोशिकाओं को बोने से पहले, 30 मिनट के लिए ।
    नोट: यह बंध्याकरण से पहले आरसीपी microcarriers के अनुमानित शुष्क वजन पर आधारित है ।
  4. बीज 5 x 105 hBMSCs या HDMECs (गद्यांश 3) प्रति स्पिनर कुप्पी में 2 एमएल ऑफ कल्चरल मीडियम.
  5. सरगर्मी थाली पर स्पिनर कुप्पी प्लेस और 5 मिनट के लिए ९० rpm पर सरगर्मी शुरू और ५५ मिनट के लिए आराम, ३७ ° c और 5% सह पर, 1 की कुल के लिए एच स्थिर/ 4 बार दोहराएं ।
  6. सेल कल्चर मीडियम के प्रति स्पिनर कुप्पी के 10 मिलीलीटर जोड़ें और फिर ९५ rpm पर लगातार सरगर्मी शुरू । ३७ ° c और 5% कं2पर मशीन ।
  7. एक micropipette के उपयोग के साथ दिन में नमूने ले 1, 4 और 7:333 डीएनए सामग्री के लिए µ एल (~ ०.५ मिलीग्राम), १००० µ SEM विश्लेषण के लिए एल (~ १.५ मिलीग्राम) और ३३३ µ एल के लिए जीना/मृत धुंधला (~ ०.५ मिलीग्राम) ।
    नोट: यह बंध्याकरण से पहले आरसीपी microcarriers के अनुमानित शुष्क वजन पर आधारित है ।
  8. संस्कृति माध्यम के 10 मिलीलीटर हर दूसरे दिन बदलें । इसके लिए, आरसीपी microcarriers तक इंतजार करें और बहुत सावधानी से स्पिनर कुप्पी से 10 मिलीलीटर महाप्राण, एक 10 मिलीलीटर पिपेट के उपयोग के साथ, और फिर ताजा संस्कृति मध्यम के 10 मिलीलीटर जोड़ें ।
  9. ९५ rpm पर सेट चमचे थाली पर संस्कृतियों रखें, ३७ डिग्री सेल्सियस पर और 5% सह 7 दिनों के लिए2 ।

4. डीएनए सामग्री, SEM विश्लेषण, जी मर धुंधला, और अंकुरण परख

  1. डीएनए सामग्री
    1. एक micropipette के उपयोग के साथ, प्रत्येक स्पिनर कुप्पी से microcarriers के लगभग ०.५ मिलीग्राम (निलंबन के ३३३ µ एल में निहित) और एक 2 मिलीलीटर प्लास्टिक ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण ।
      नोट: यह बंध्याकरण से पहले आरसीपी microcarriers के अनुमानित शुष्क वजन पर आधारित है ।
    2. 1 मिलीलीटर DPBS के साथ एक बार धो लें, फिर महाप्राण supernatant ।
    3. शेष DPBS को एक lyophilizer में निकालें और बाद में सामान्यीकरण के लिए lyophilized microcarriers का वजन करें ।
    4. पर नमूने फ्रीज-८० ° c के लिए ंयूनतम 6 ज ।
    5. ३०० µ एल papain 5 यू/एमएल के साथ रातोंरात ६० डिग्री सेल्सियस पर मशीन नमूने ।
    6. quantitation परख के निर्माता ´ एस निर्देशों के बाद उपयुक्त अनुमापन curves स्थापित (उदा, PicoGreen dsDNA परख) किट और एक luminescence डिटेक्टर के साथ ५२० एनएम पर फ्लोरोसेंट संकेत की माप प्रदर्शन ।
  2. स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM) विश्लेषण
    1. लीजिए कै. 1 प्रत्येक स्पिनर कुप्पी से microcarriers की मिलीग्राम और एक 2 मिलीलीटर प्लास्टिक ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण ।
    2. DPBS की 1 मिलीलीटर के साथ एक बार microcarriers धो लें ।
    3. DPBS निकालें और 1 एच के लिए ७०% इथेनॉल के 1 मिलीलीटर में गर्मी ।
    4. supernatant निकालें और 1 एच के लिए ८०% इथेनॉल के 1 मिलीलीटर में गर्मी ।
    5. supernatant निकालें और 1 एच के लिए ९०% इथेनॉल के 1 मिलीलीटर में गर्मी ।
    6. supernatant निकालें और 1 एच के लिए १००% इथेनॉल के 1 मिलीलीटर में गर्मी ।
    7. supernatant निकालें और 10 मिनट के लिए hexamethyldisilazane के 1 मिलीलीटर में मशीन ।
    8. टोपी खोलें और एक रासायनिक डाकू के तहत रात भर के नमूने सूख जाते हैं ।
    9. उचित समर्थन पर नमूनों को ठीक करें और स्थापित प्रोटोकॉल के अनुसार SEM विश्लेषण करने के लिए आगे बढ़ें ।
  3. DAPI और जीवित/
    1. दिन में 2, 4, और 7 microcarriers पर सेल सीडिंग के बाद प्रत्येक स्पिनर कुप्पी से microcarriers के ०.५ मिलीग्राम इकट्ठा और एक 2 मिलीलीटर प्लास्टिक ट्यूब के लिए स्थानांतरण । DPBS के 1 मिलीलीटर के साथ एक बार धो लें ।
    2. dapi
      1. उंहें कवर करने के लिए पर्याप्त 4% paraformaldehyde में 10 मिनट के लिए नमूनों को ठीक करें ।
      2. DPBS के 1 मिलीलीटर के साथ एक बार धो लें ।
      3. एक कमाल की शेखर पर ४५ मिनट के लिए धुंधला समाधान के साथ कमरे के तापमान पर मशीन ।
      4. एक ४२० एनएम उत्सर्जन फिल्टर के साथ एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप पर DAPI फ्लोरोसेंट संकेत का पता लगाने और छवियों का अधिग्रहण ।
    3. Live/मृत धुंधला
      1. जीने/मृत डाई समाधान के ५०० µ एल में नमूनों की मशीन । नमूनों को 20 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर रखें, प्रकाश से सुरक्षित ।
      2. DPBS के 1 मिलीलीटर के साथ एक बार धो लें ।
      3. एक ४९० एनएम उत्सर्जन फिल्टर और एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप पर ५४५ एनएम उत्सर्जन फिल्टर के साथ मृत कोशिकाओं के साथ रहने वाले कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति संकेत का पता लगाने । छवियां प्राप्त ।
    4. HDMECs के लिए अंकुरण परख
      1. मिश्रण ३३० कोलेजन आर समाधान ०.४%, १७० µ एल के ०.१% एसिटिक एसिड की µ एल, और एक 15 मिलीलीटर प्लास्टिक ट्यूब में मध्यम M199 के ५० µ एल । बर्फ पर रखो ।
      2. ले ~ ०.३७५ microcarriers के मिलीग्राम (२५० µ एल) एक micropipette के उपयोग के साथ । एक १.५ एमएल प्लास्टिक ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण, आरसीपी microcarriers नीचे करने के लिए व्यवस्थित करने के लिए और मध्यम पूरी तरह से दूर करने के लिए रुको ।
        नोट: यह बंध्याकरण से पहले आरसीपी microcarriers के अनुमानित शुष्क वजन पर आधारित है ।
      3. NaOH ०.२ N की मात्रा जोड़ने के लिए कोलेजन मिश्रण बेअसर और तुरंत यह आरसीपी microcarriers के साथ मिश्रण की आवश्यकता है ।
        नोट: (पीले रंग से गुलाबी करने के लिए बारी) पीएच में परिवर्तन जब तक यह मिश्रण करने के लिए जोड़कर अग्रिम में NaOH ०.२ N की आवश्यक राशि का निर्धारण, और फिर 1 मिनट के लिए मशीन में मिश्रण रखने, जिसके बाद एक जेल का गठन किया जाना चाहिए ।
      4. प्लेट कोलेजन जेल-आरसीपी microcarriers मिश्रण एक अच्छी तरह से एक 24-अच्छी तरह से थाली में । ३७ ° c और 5% सह 30 मिनट के लिए2 पर मशीन ।
      5. संवहनी endothelial वृद्धि कारक के २०० µ एल जोड़ें (उदा., VascuLife वीईजीएफ़-एमवी कल्चर मीडियम) । ३७ ° c और 5% सह2 पर मशीन 24 एच के लिए ।
      6. एक व्युत्क्रम चरण कंट्रास्ट माइक्रोस्कोप के तहत निरीक्षण, एक 10x आवर्धन वस्तु का उपयोग कर, और छवियों का अधिग्रहण ।

5. HDMECs के लिए और अधिक के लिए प्रतिक्रियाकर्ता प्रणाली की शुरुआत

  1. एक दिन से पहले प्रतिक्रियात्मक संस्कृतियों शुरू करने, antimesenteric पक्ष पर खुला BioVaSc (longitudinally मैट्रिक्स) में कटौती और यह एक पहले से संक्रमित पाली कार्बोनेट फ्रेम में ठीक ( चित्र 3ए, बी) देखें ।
    नोट: BioVaSc एक विसेलुलर सुअर jejunal खंड से प्राप्त एक, के रूप में पहले से प्रकाशित21तैयार मैट्रिक्स है ।
    नोट: के रूप में पाली कार्बोनेट फ्रेम गर्मी से निष्फल नहीं किया जा सकता है, यह ध्वनि स्नान में 20 मिनट की मशीन द्वारा विशुद्ध (४० kHz) 25 मिनट के लिए ७०% इथेनॉल में 3 बार मशीन के बाद । फिर, फ्रेम 3 बार DPBS बाँझ के साथ धो लें ।
    1. एक १०० mm पेट्री डिश में और यह संवहनी endothelial वृद्धि कारक + 1% पेनिसिलिन Streptomycin (कलम/Strep) के साथ भरें
    2. Equilibrate ३७ ° c और 5% CO2पर रातोंरात मशीनिंग द्वारा इस
  2. अलग करने और कोशिकाओं की गिनती के बाद, एक 2 मिलीलीटर सिरिंज के उपयोग के साथ, संस्कृति माध्यम के १००० µ एल में 10 x 107 HDMECs के संरक्षित vasculature के माध्यम से, सुई ।
    नोट:-नस आउटलेट के माध्यम से धमनी प्रवेश और ~ ३०० µ एल के माध्यम से ~ ७०० µ एल इंजेक्षन ।
  3. 3 एच के लिए ३७ ° c और 5% सह2 पर मशीन, सेल लगाव की अनुमति देने के लिए ।
  4. संवहनी endothelial वृद्धि कारक + 1% पेन/Strep और ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% सह पर मशीन की ३५० मिलीलीटर के साथ प्रतिक्रिया प्रणाली भरें2।
  5. इस फ्रेम को विस्थापनकर्ता के पोत के अंदर रखें । पोत के लिए धमनी और शिरापरक pedicles कनेक्ट ।
  6. एक सिकुड़नेवाला पंप करने के लिए इस प्रतिक्रियात्मक प्रणाली को जोड़ने के द्वारा छिड़काव शुरू करो । 10 mmHg और आयाम ± 1 पर दबाव सेट करें ।
  7. दबाव के १०० mmHg, आयाम ± 20 तक पहुंचने तक हर घंटे stepwise प्रेशर बढ़ाएं ।
  8. ३७ ° c और 5% CO2में इन शर्तों के तहत 7 दिनों के लिए प्रतिक्रियात्मक प्रणाली रखें ।

6. आरएफपी के अलावा-HDMECs के लिए

  1. मिक्स ०.४% कोलेजन आर समाधान के ३३० µ एल, ०.१% एसिटिक एसिड की १७० µ एल, और एक 15 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूब में मध्यम M199 के ५० µ एल । बर्फ पर रखो ।
  2. स्पिनर कुप्पी से आरसीपी microcarriers को लें. कल्चरल मीडियम को पूरी तरह से हटा दें ।
  3. NaOH ०.२ N की मात्रा जोड़ने के लिए कोलेजन मिश्रण बेअसर और तुरंत यह आरसीपी microcarriers के साथ मिश्रण की आवश्यकता है ।
  4. कोलेजन जेल-आरसीपी microcarriers मिश्रण के लुमेन पर जोड़ें । 30 मिनट के लिए जमाना की अनुमति दें ।
  5. समानांतर में, मध्यम पूरी तरह से हटाने और फिर ताजा, पूर्व गर्म, संवहनी endothelial वृद्धि कारक + 1% कलम Strep की ३५० मिलीलीटर जोड़ने के माध्यम से प्रतिक्रिया के माध्यम बदल जाते हैं ।
  6. सिकुड़नेवाला पंप के लिए प्रतिक्रिया से कनेक्ट और १०० mmHg और आयाम ± 20 पर दबाव की स्थापना की ।
  7. मीडियम को हर 7 दिन में चेंज कर लीजिये.
  8. 21 दिनों के लिए संस्कृति में प्रतिक्रिया रखो ।

7. विश्लेषण और पढ़ें-प्रतिक्रियात्मक संस्कृतियों के बहिष्कार

  1. नमूनों की तैयारी
    1. इस प्रतिक्रियाकर्ता से अधिक से अधिक मैट्रिक्स को डिस्कनेक्ट करें और इसे पाली कार्बोनेट फ्रेम से निकालें ।
    2. 6 वर्गों में प्राप्त टुकड़ा काट: 2 MTT के लिए, 2 आयल embedding के लिए/धुंधला और SEM विश्लेषण के लिए 2 ।
  2. आयल embedding
    1. एक पेट्री डिश में वर्गों प्लेस और पर्याप्त DPBS के साथ धोने के लिए उंहें कवर । DPBS को त्यागें ।
    2. 4% paraformaldehyde रात भर में वर्गों को ठीक करें ।
    3. तेल embedding के लिए कैसेट तैयार करने और मानक प्रोटोकॉल के अनुसार यह प्रदर्शन ।
    4. आयल ब्लॉक्स में सेक्शन तैयार करें और एच एंड ई धुंधलान के लिए 3 µm के नमूनों को एक microtome के प्रयोग के साथ काटें ।
  3. H र E सना
    1. ३२मानक प्रोटोकॉल के अनुसार reहाइड्रेटेड वर्गों दाग ।
  4. स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM) विश्लेषण
    1. एक पेट्री डिश में वर्गों प्लेस और पर्याप्त DPBS के साथ धोने के लिए उंहें कवर । DPBS को त्यागें ।
    2. ४.७५% glutaraldehyde रात भर के साथ वर्गों को ठीक करें ।
    3. ५० इथेनॉल की बढ़ती सांद्रता के साथ निर्जलीकरण श्रृंखला प्रदर्शन%-१००% ।
    4. hexamethyldisilazane के साथ वर्गों को कवर (HMDS) 10 मिनट के लिए इस्तेमाल किया HMDS को त्यागें और ताजा HMDS जोड़ें ।
    5. अनुमति देने के लिए खंड धुएं हूड के तहत रात भर सूखी, और फिर इमेजिंग के लिए नमूने तैयार ।
  5. 3-(4, 5-Dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium ब्रोमाइड (MTT)
    1. मिश्रण MTT एजेंट संवहनी endothelial वृद्धि कारक के साथ, एक एकाग्रता में 1 मिलीग्राम/
    2. ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% सह पर ९० मिनट के लिए MTT समाधान में वर्गों की मशीन2।
    3. संवहनी संरचनाओं और कोशिका-वरीयता प्राप्त microcarriers macroscopically या एक उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोप के तहत, चयापचय सक्रिय कोशिकाओं का पता लगाने के लिए निरीक्षण. छवियां प्राप्त ।

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Representative Results

के रूप में चित्र 1aमें दिखाया गया है, हम संस्कृति के 7 दिनों के बाद आरसीपी microcarriers पर व्यवहार्य कोशिकाओं की उच्च संख्या प्राप्त की, जीना द्वारा निर्धारित/ उन परिणामों SEM विश्लेषण द्वारा पुष्टि की गई, जिसमें पूरी तरह से microcarriers बृहदांत्र चारों ओर देखा गया pores, आंशिक रूप से उंहें तबदील (आंकड़ा 1b) । दूसरी ओर, प्रयोगों जिसमें कोशिकाओं को भी बीज नहीं थे कई खाली microcarriers में परिणाम । असफल प्रयोगों में मृत कोशिकाओं की असामान्य रूप से उच्च संख्या की विशेषता होती है जो कि कुल सेल राशि (figure 1C) के 10% से अधिक नहीं होनी चाहिए । इसके अलावा, HDMECs के डीएनए सामग्री ठहराव समय (चित्रा 1 डी) के साथ dsDNA की वृद्धि हुई दिखाया.

इसके अतिरिक्त, आरएफपी-HDMECs आरसीपी microcarriers पर संस्कृति के बाद अपनी कार्यक्षमता बनाए रखने में सक्षम थे, के रूप में चित्रा 2में दिखाया गया है, जहां कोशिकाओं को एक अंकुरित phenotype जब एक कोलेजन जेल में कल्चरल अपनाया ।

इसके अलावा, हम आरएफपी-HDMECs-कालोनी आरसीपी microcarriers को फिर से इस्तेमाल किया-बीज के लुमेन BioVaSc । इस के लिए, हम संवहनी ऊतक के बराबर शारीरिक छिड़काव के लिए एक प्रतिक्रिया प्रणाली कार्यरत22 (चित्रा 3) जिसमें हम कटौती-खुला और एक पाली कार्बोनेट फ्रेम में रखा है, ताकि लुमेन एक भी सेट अप में उजागर किया गया था ( चित्र बी) ।

प्रतिक्रियात्मक संस्कृतियों के 21 दिनों के बाद, चयापचय सक्रिय कोशिकाओं दोनों के संरक्षित vasculature पर मौजूद थे और साथ ही आरसीपी microcarriers (चित्र 4a और चित्र बी) पर । असफल प्रयोगों या ऊतकीय नमूनों के अनुभाग के दौरान स्लाइस का एक गलत विकल्प या microcarriers पर बस्तियां वाहिकाओं के लुमेन में endothelial कोशिकाओं की अनुपस्थिति के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. इन परिणामों की पुष्टि की जा सकता है SEM के विश्लेषण के द्वारा, जहां यह देखा जा सकता है कि आरसीपी microcarriers के कुछ क्षेत्रों अभी भी कोशिकाओं द्वारा कवर किया गया था और यह है कि आरसीपी microcarriers के निकट निकटता में थे (चित्र 4c और 4d) ।

अंत में, एच एंड ई धुंधला HDMECs की उपस्थिति की पुष्टि की, विशेष रूप से संवहनी संरचनाओं में (चित्र 5) । जब प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत मनाया, कोशिकाओं बस्तियां के संवहनी संरचनाओं के परिणामस्वरूप आरएफपी-HDMECs (चित्रा 5B), आरसीपी microcarriers से कोशिकाओं के प्रवास का संकेत है कि करने के लिए. आरसीपी microcarriers (चित्र 5C और 5d) पर कुछ आरएफपी-HDMECs भी देखे गए । प्रयोग में जो कोशिकाओं में बदल संवर्धन स्थितियों के कारण बच नहीं किया (जैसे छोटे संस्कृति बार), वे पहले रिपोर्ट तकनीकों में से कोई भी के साथ संवहनी संरचना के अंदर नहीं पाया जा सकताहै (चित्रा 5E और 5F ).

Figure 1
चित्रा 1: आरसीपी microcarriers पर HDMECs और hBMSCs की संस्कृति । (A, C) गतिशील संस्कृतियों के 7 दिनों के बाद जीवित/ (ख) आरसीपी microcarriers पर HDMECs संस्कृति का SEM विश्लेषण गतिशील संस्कृतियों के 7 दिनों के बाद । (घ) डीएनए PicoGreen परख किट द्वारा निर्धारित सामग्री । डेटा मतलब ± मानक विचलन के रूप में व्यक्त (n = 3) । स्केल सलाखों: २०० µm के लिए A, B के लिए ८८ µm, और C. के लिए १०० µm कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: अंकुरण परख । आरएफपी के अंकुरित-HDMECs उज्ज्वल क्षेत्र के तहत देखा जा सकता है (एक) और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (बी), एक कोलेजन जेल में संस्कृति के 24 ज के बाद आरसीपी microcarrier कालोनी से उभर रहे हैं । (C) ओवरले छवि । स्केल बार्स: १०० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3:--मैट्रिक्स और प्रतिक्रिया के सेट अप । (क) तैयार करने के लिए और (ख)कार्बोनेट फ्रेम पर बढ़ते है । (C) सेट-अप प्रतिक्रिया । यह पोत सिलिकॉन ट्यूबों के जरिए मीडियम जलाशय और प्रेशर बॉटल से जुड़ा होता है और यह पूरी व्यवस्था एक सिकुड़नेवाला पंप से जुड़ी होती है । दबाव एक दबाव संवेदक के माध्यम से मापा जाता है । ऐ: धमनी प्रवेश; VO: शिरापरक आउटलेट । यह आंकड़ा Groeber एट अल से संशोधित किया गया है । 22 कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: प्रतिक्रिया पढ़ें-बाहर । MTT परख संस्कृति, जिसमें चयापचय सक्रिय कोशिकाओं के संरक्षित vasculature में मनाया गया के 21 दिनों के बाद एक और मैट्रिक्स खंड पर प्रदर्शन किया गया था के रूप में अच्छी तरह से आरसीपी microcarriers (ख)पर (a) के रूप में । (सी, डी) आरसीपी microcarriers की SEM छवियां एक और मैट्रिक्स अनुभाग पर । स्केल बार्स: ०.२८ cm के लिए A, ०.४५ cm के लिए B, ४७ µm के लिए C, और २२५ के लिए µm D. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: एच और ई धुंधला और प्रतिदीप्ति छवियों. (A, C, E) H र E सना. (B, D, F) संस्कृति के 21 दिनों के बाद, आरएफपी-HDMECs (तीर) के रूप में अच्छी तरह के रूप में आरसीपी microcarriers (एरो सिर) पर vasculature के अंदर देखा गया । स्केल बार्स: ५० ई और एफ के लिए µm ए-डी और 30 µm के लिए कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

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Discussion

microcarrier का एक मुख्य लक्ष्य कोशिकाओं के विस्तार है, जबकि अपने विभेद को बनाए रखने के क्रम में जरूरत के स्थान पर कोशिकाओं को वितरित करने के लिए । प्रतिनिधित्व विधि आरसीपी microcarriers जहां कोशिकाओं को संलग्न कर रहे थे, पैदा, और उच्च कोशिका घनत्व के साथ उपनिवेश microcarriers परिचय । यह जीना/मृत धुंधला, जिसमें व्यवहार्य कोशिकाओं के ९०% से अधिक पाया गया था जबकि केवल कुछ मृत कोशिकाओं गतिशील संस्कृतियों के 7 दिनों के बाद प्राप्त किए गए द्वारा मनाया गया । इसी तरह, SEM छवियों की पुष्टि की है कि कोशिकाओं की संस्कृतियों के 7 दिनों के बाद microcarriers की पूरी सतह को कवर किया ।

3 डी मॉडल में सेल अस्तित्व सुनिश्चित करने के लिए, यह कोशिकाओं को ऑक्सीजन और पोषक तत्वों की आपूर्ति बनाए रखने और अपशिष्ट पदार्थों को हटाने की अनुमति के लिए महत्वपूर्ण है । रक्त वाहिकाओं इस विनिमय प्रक्रिया के जिंमेदार संरचनाओं, जिसमें endothelial कोशिकाओं के बाद से वे रक्त वाहिकाओं के भीतरी भाग23अस्तर कोशिकाओं रहे है एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा रहे हैं । वे पैदा, विस्थापित, पालन, अंकुरित करने की क्षमता है, और फार्म पोत की तरह24संरचनाओं । इन संपत्तियों को आरसीपी microcarriers पर आरएफपी-HDMECs की संस्कृति के बाद बनाए रखा गया था, क्योंकि यह देखा गया था कि कोशिकाएं अंकुरण phenotype को अपनाने में सक्षम थीं ( चित्र 2देखें) । हम यहां साबित हो सकता है कि इन बृहदांत्र आरसीपी microcarriers प्रभावी रूप से प्राथमिक endothelial कोशिकाओं को पुन: BioVaSc के पूर्व जहाजों के लुमेन बीज देने थे । यह हमारे सिस्टम नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए ऊतक इंजीनियर प्रत्यारोपण के vascularization में सुधार करने के लिए उपयुक्त होने के लिए पता चलता है । इस मैट्रिक्स के डेरिवेटिव सफलतापूर्वक vascularization दृष्टिकोण में इस्तेमाल किया गया है25, के रूप में अच्छी तरह के रूप में में इन विट्रो ट्यूमर परीक्षण sytems21,26,27,28 और उत्पादन के लिए पशु प्रयोग29के लिए विकल्प के रूप में त्वचा समकक्षों की । यहां यह एक खुले में प्रयोग किया जाता है, सेट अप चपटा और एक छिड़काव में रखा के रूप में ऊतक के समकक्ष की पीढ़ी के लिए लागू22।

प्रतिक्रिया ऊतक इंजीनियरिंग में इस्तेमाल किया गया है ऊतक समकक्ष है कि मदद कर सकता है अंगों की मांग को कम करते हुए अस्वीकृति और30रुग्णता जैसे जुड़े जोखिम को कम करने का उत्पादन । हालांकि, ऊतक की तरह constructs उत्पादन एक बहुत ही जटिल प्रक्रिया है कि ऊतक विशिष्ट कोशिका प्रकार, एक उपयुक्त पाड़ और उचित विकास कारकों है कि उचित भेदभाव और 3 डी ऊतकों में कोडांतरण की अनुमति का उपयोग शामिल है । इंजीनियर का एक प्रमुख दोष constructs एक उचित संवहनी नेटवर्क है कि दोनों विट्रो में और vivo में17में कोशिकाओं के अस्तित्व का समर्थन करता है की कमी है । यहां हम एक विआरसीपीी मैट्रिक्स के साथ एक विmicrocarriersी मॉडल में एक विनिवेशित मेट्रिक्स, सेल प्रकार की आवश्यकता प्रदान, एक पाड़ कि सेल आसंजन और पोत गठन और एक विशिष्ट संस्कृति माध्यम है कि के लिए आवश्यक कारक प्रदान करता है की अनुमति देता है उपलब्ध कराने के गठबंधन कोशिकाओं को पैदा और उनके कार्यात्मक गुण बनाए रखने के लिए । इस मॉडल का एक महत्वपूर्ण परिणाम HDMECs की क्षमता को आरसीपी microcarriers से पाड़ के लिए किसी भी अतिरिक्त टुकड़ी या पाचन के रूप में अंय दृष्टिकोण में आवश्यक के रूप में31प्रवास के लिए है । बाद में, वे विशेष रूप से मैट्रिक्स के संवहनी संरचनाओं बृहदांत्र, अवधारणा है कि macroporous microcarriers reअपक्षयी चिकित्सा प्रयोजनों के लिए सेल डिलीवरी प्रणाली के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता साबित ।

कुल मिलाकर, इस प्रोटोकॉल एक बड़ा सेल विस्तार प्राप्त करने के लिए अपक्षयी दवा में एक होनहार रणनीति का प्रतिनिधित्व करता है और यह आरोपण साइटों, जहां यह ऊतक इंजीनियर भ्रष्टाचारियों के लिए vascularization समर्थन में सुधार कर सकता है सेल डिलीवरी के रूप में सेवा कर सकता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इन परिणामों के लिए अग्रणी अनुसंधान अनुदान समझौते n ° ६०७०५१ (जैव प्रेरणा) के तहत यूरोपीय संघ के सातवें ढांचे के कार्यक्रम FP7/2007-2013 से धन प्राप्त हुआ है । हम धंयवाद Carolien वान Spreuwel-Goossens Fujifilm विनिर्माण यूरोप B.V. से, आरसीपी विनिर्माण के दौरान तकनीकी सहायता के लिए, और वर्नर Stracke Fraunhofer अनुसंधान सिलिकेट के लिए आईएससी संस्थान से, SEM विश्लेषण के साथ सहायता के लिए ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide (MTT) Serva Electrophoresis GmbH 20395.01
4’,6-Diamidino-2-phenylindoldihydrochloride (DAPI) Sigma-Aldrich D9542
Acetic acid 100% Sigma-Aldrich 533,001
Analytical balance Kern EG 2200-2NM Kern & Sohn GmbH
Ascorbate-2-phosphate Sigma-Aldrich A8960
Bioreactor Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Wuerzburg, Germany
Bright field microscope Axiovert 40C Carl Zeiss AG
Cellnest Fujifilm
Centrifuge tubes (15 mL, 50 mL) Greiner Bio-One
Collagen R solution 0,4% Serva Electrophoresis GmbH 47254.01
DMEM-F12 Gibco 11320-033
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich D8537 Modified, without calcium chloride and magnesium chloride
Eosin 1% Morphisto 10177.01000
Ethanol 96% Carl Roth GmbH T171.4 Denatured
Fetal calf serum (FCS) Bio&SELL FCS.ADD.0500 not heat-inactivated
Fluorescence microscope BZ-9000 Keyence
Haematoxylin Morphisto 10231.01000
Hexamethyldisilazane Sigma-Aldrich 440191 Reagent grade, ≥99%
Incubator for bioreactor Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Wuerzburg, Germany
Live/Dead Cell Double Staining Kit Fluka 04511KT-F
Magnetic stirrer plate 2Mag 80002
Medium 199 Sigma-Aldrich M0650 10X
Microplate reader
Tecan Infinite M200		 Tecan
Needle 21G 16mm VWR 613-5389
Papain from papaya latex Sigma-Aldrich P4762 lyophilized powder, ≥ 10 units/mg protein
Paraffin Carl Roth GmbH 6642.6
Penicillin/Streptomycin Sigma-Aldrich P4333
Peristaltic pump Ismatec
Quanti-iT PicoGreen dsDNA assay kit Thermo Fischer Scientific P7589
Histofix 4% Carl Roth GmbH P087
Scanning Electron Microscope Supra 25 Carl Zeiss AG
Sodium hydroxide solution 1.0 N Sigma-Aldrich S2770
Spinner flasks (25 mL) Wheaton 356879
Syringe 1 mL VWR 720-2561
Tissue culture flasks (25 cm2, 75 cm2, 150 cm2) TPP Techno Plastik Products AG
Trypan blue 0.4% Sigma-Aldrich T8154
VascuLife VEGF-Mv Lifeline cell technology LL-0005

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Suarez Muñoz, M., Confalonieri, D., Walles, H., van Dongen, E. M. W. M., Dandekar, G. Recombinant Collagen I Peptide Microcarriers for Cell Expansion and Their Potential Use As Cell Delivery System in a Bioreactor Model. J. Vis. Exp. (132), e57363, doi:10.3791/57363 (2018).

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