Summary
우리는 macroporous microcarriers에 셀 확장 프로토콜 및 decellularized 조직 매트릭스를 시드하 관류 생물에서 배달 시스템으로 그들의 사용을 제안 합니다. 우리는 또한 세포 증식 및 microcarriers에 경작 하는 세포의 생존 능력을 결정 하기 위해 다른 기술을 포함 합니다. 또한, 생물 반응 기 배양 후 세포의 기능을 설명합니다.
Abstract
조직 공학 유망 분야, 조직 및 장기 이식 목적에 대 한 수요 증가 대 한 솔루션 개발에 초점을 맞춘입니다. 같은 조직을 생성 하는 과정 복잡, 고 특정 세포 유형, 건설 기계, 및 세포 성장 및 분화를 안내를 물리적 또는 생 화 확 적인 자극의 적절 한 조합을 포함 한다. Microcarriers 셀에 3 차원 (3D) microenvironment, 이후 그들은 더 높은 표면에 볼륨 비율을 제공 하 고 더 밀접 하 게 전통적인 2 차원 방법에 비해 vivo에서 상황을 모방 확장 하는 매력적인 도구를 나타냅니다. 혈관 시스템, 세포에 산소와 양분을 공급 하 고 폐기물 제거, 조직 설계를 생성 하는 때 중요 한 빌딩 블록을 구성 합니다. 사실, 대부분 구조 혈관 지원 부족 인해 이식 되 고 후 실패 합니다. 이 연구에서 우리 스피너 플라스 크 및 생물 반응 기, 동적 조건 하에서 재조합 형 콜라겐 기반 microcarriers에 내 피 세포 확장에 대 한 프로토콜을 제시 하 고이 설정 세포 생존 능력 및 기능을 결정 하는 방법을 설명. 또한, 우리는 필요한 추가 분리 단계 없이 vascularization 목적 셀 배달 하는 방법을 제안합니다. 또한, 우리 decellularized 생물 매트릭스에 관류 생물에 잠재적인 셀 vascularization를 평가 하는 전략을 제공 합니다. 제시 방법의 사용 조직 엔지니어링 임상 연습에서 응용 프로그램의 큰 범위에 대 한 새로운 세포 기반 치료법의 발전으로 이어질 수 믿습니다.
Introduction
조직 공학 응용 프로그램에 하나의 일반적인 문제는 수익률 높은 세포 질량의 위치에서 올바른 차별화 표현 형을 필요. 이 문제를 해결 하려면 microcarriers의 응용 프로그램은 피부, 뼈, 연골, 힘 줄1의 대규모 세대에 대 한 정형 외과 조직 공학 분야에서 최신의 증가 함께 1967 년에 시작 했다. 그들은 허용 부착 문화의 처리 방법으로 현 탁 액 문화2 와 비슷한 미 3 차원 (3D) 기판에 셀을 확장 하 여. 그로 인하여 세포 균질 영양소 공급 및 세포-매트릭스 상호 작용 vivo에서3,4 차별화의 차원에서 시간이 지남에 따라 자주 분실 되는 더 나은 유지 보수를 리드5접근 경험. 결국 높은 수익률6,7셀, 높은 가스 이어지는 높은 표면 볼륨 비율-고 영양 환율 정적 시스템8, 규제 하 고 물리적 문화 주제 가능성에 비교 자극9, 그리고 잠재적인 확장 과정7 확장 추가 이점이 있습니다. 직경, 밀도, 다공성, 표면, 그리고 접착 속성10,11 등 여러 가지 기능이 다른 상용 마이크로-와 매크로-사업자 구분. 그러나, 주요 장점 중 하나는 그들의 microtissues로 잠재적인 사이트 결함 또는 배달 수요입니다.
Microcarrier 기술 뼈 조직 공학에서의 응용 프로그램에 대 한 우리에 나와 있는 이전 보고서12 생산의 새로운 microcarrier 유형 구성 재조합 콜라겐의 나 펩 티 드 (RCP, Cellnest으로 상용). 임상 시나리오에 셀 납품을 위한 필요에 따라이 새로운 microcarrier는 GMP 준수 최대 비 계 및 셀 생산의 스케일링 수 있습니다. 이러한 맥락에서 비 계 안정성, 속도 저하, 및 적합 한 가교 전략의 적절 한 선택을 통해 표면 특성의 조정 선택 된 응용 프로그램에 기술을 적응, 관심 유형의 세포 또는 조직13을 대상 수 있습니다. 특히, 치료 응용 프로그램14 주 사용 셀 배달 시스템으로이 microcarrier의 잠재적인 고용 그들은 게 임상 설정에서 특히 흥미로운.
이 문서에서 우리는 따라서 분리와 인간 골 수 유래 중간 엽 stromal 세포 (hBMSCs)와 인간의 피부 microvascular 내 피 세포 (HDMECs) 콜라겐-난-기반 재조합에의 확장에 대 한 자란 절차 설명 펩타이드 기반 microcarriers, 그리고 임상 설정에서 납품을 위한 그들의 준비. 또한, 우리는 주입 시 세포 생존 능력의 유지 보수에 대 한 유용한 추가 프로토콜을 설명합니다.
이식 후 세포 생존 능력은 사실 vascularization15,,1617, 산소와 영양분의 교환을 보장 하 고 폐기물 제거를 용이 하 게에 강하게 의존 합니다. Bioreactors는 vascularization 극복해 조직 공학에서 그로 인하여 산소와 영양분18제공 하는 문화 매체의 관류를 통해 세포 생존 능력을 유지 하는 한 가지 방법은 구성 합니다. 여기, 우리는 biomatrix 하 데 노 보 vascularization와 신생 수 그들의 RCP microcarriers에서 microvascular 내 피 세포의 마이그레이션 기능을 평가 하기 위해 생체 외에서 메서드를 보여 줍니다. 이 biomatrix 이며 돼지 공장 decellularized 세그먼트 되 나 BioVaSc (생물 나가도록 비 계), 콜라겐과 엘라 스 틴에 풍부한 혈관 구조, 먹이 동맥을 포함 하 고는 배수 정 맥19 보존 이식 문제20적용.
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Protocol
hBMSCs 대 퇴 골 머리 대체 수술 관절염 환자의 대 퇴 골 머리에서 분리 했다. 절차는 뷔르츠부르크 대학의 로컬 윤리 위원회 및 환자의 동의의 승인 아래 수행 되었다. 기본 microvascular 내 피 세포 포 피 biopsies 청소년 기증자의 분리 했다. 그들의 법률 representative(s) 전체 동의 서 면을 제공합니다. 연구는 뷔르츠부르크 대학교 (182/10 투표)의 로컬 윤리 위원회에 의해 승인 되었다.
1입니다. hBMSCs 및 HDMECs의 격리
- 인간 골 수 유래 중간 엽 stromal 세포 (hBMSCs)
- 메 마른 숟가락을 사용 하 여 대 퇴 골 머리에서 해 면 뼈를 제거 합니다.
참고: 해 면 뼈는 단단하고 딱딱한 외피 뼈 내부 느슨하게 하 고 세분화 된 물질으로 나타납니다. 그것은 메스를 사용 하 여 외피 뼈에서 해 면 질 뼈의 스크래치 부분에 필요할 수 있습니다. - 2 50 mL 튜브에 제거 해 면 뼈를 삽입 합니다. 해 면 뼈의 볼륨 엉덩이 교체 수술 동안 제거 된 대 퇴 골 머리의 크기에 따라 10 mL에 5에서 달라질 수 있습니다.
- DMEM-F12 (DMEM 및 햄의 F12 매체의 1:1 혼합물), 세척 매체의 약 30 mL와 튜브를 작성.
- 5 경도 방식에서 튜브를 수동으로, 동요 해 면 뼈에서 지방 세포를 s. 원심 분리기 300g x와 22 ° C 5 분.
- 졸업된 플라스틱 피 펫, 지방 세포 층과 약 20 mL의 나머지 상쾌한 발음. 해 면 뼈를 충당 하기 위해 충분 한 매체를 하자.
- DMEM F12의 10 ml와 함께 튜브를 경도 손으로,에 대 한 10-15, 밖으로 셀 수 있도록 적극적으로 악수.
- 새로운 50 mL 튜브를 튜브에서 졸업된 플라스틱 피 펫으로 세포 현 탁 액의 10-15 mL을 전송.
- 단계의 1.1.6 풀링 함께 얻은 세포 현 탁 액 50 mL 튜브에 수집 해 면 뼈가 흰색 때까지 2-3 회 반복 합니다.
- 졸업된 플라스틱 피 펫으로 세포 현 탁 액 50 mL 튜브의 하단에 콜라겐 펠 릿을 발음을 피하 두 가지 새로운 튜브에 전송.
- 5 분에 대 한 300 x g 및 22 ° C에 세포 현 탁 액 분리기 졸업된 플라스틱 피 펫으로 발음 하 여는 상쾌한을 삭제 합니다.
- 제 3 관에서 10% FCS DMEM F12 1% 펜/Strep 50 µ g/mL 하는데-2-인산 염의 40 mL를 추가 합니다. 셀 펠 릿을 포함 하는 각 관에이 매체의 5 mL을 전송 합니다. 다시 튜브의 하단을 적극적으로 깜 빡 여 셀 알 약을 중단 하 고 유일한 매체 포함 된 튜브에 세포 정지를 전송.
- 선택 사항: 셀 계산을 위해 셀 서 스 펜 션의 100 µ L를 희석, DPBS의 15 µ L을 30 µ L 첫 번째 희석의 15 µ L을 추가 하 여 PBS와 trypan 파랑, 다음 1시 10분 첫 1: 100 희석 Trypan 파랑는 DPBS 얻을: Trypan 블루 1: 1의 비율. 표준 Neubauer 챔버와 셀을 계산 합니다.
- 1.1.11에 설명 된 대로 109 셀/175 cm2 T-플라스 크 25 mL 매체의 세포를 시드하십시오. 또는, 계산 하지 않고 최대 10 175 cm2 셀 문화 플라스 크에 전체 세포 현 탁 액을 나눕니다. 이 단계에서 hBMSCs는 그들을 숫 적으로 크게 적혈구에서 구별할 수 없습니다. hBMSCs 스파스 식민지로 나타날 것 이다 (1-2/플라스 크)는 첫 번째 7 일 동안.
- 매체는 hBMSCs와 혈액 세포의 상호 작용 수 있도록 시드 로부터 4 일 후 변경 합니다. 첫 번째 중간 교환 후 2-3 일 마다 매체를 변경 합니다. 추가 하 여 졸업된 플라스틱 피 펫으로 문화 매체를 완전히 제거, 세척 두 번 DPBS (부착 세포 DPBS의 10 mL를 추가 및 제거 하 여 완전히 졸업된 플라스틱 피 펫과 DPBS) 20 mL의 중간 교류를 수행 1.1.11에 설명 된 대로 신선한 매체입니다.
- 메 마른 숟가락을 사용 하 여 대 퇴 골 머리에서 해 면 뼈를 제거 합니다.
- 인간의 피부 microvascular 내 피 세포 (HDMECs)
- 피부 생 검 치료 하 고 분리 이전에 게시 프로토콜21에 따르면 HDMECs. 간단히, 표 피에서 진 피의 분리, 후 37 ° C, 5% CO2시 40 분에 대 한 트립 신에 진 피를 품 어. 시간 후에 부 화, 문화 매체를 포함 하는 배양 접시에 진 피를 전송 하 고 메스를 사용 하 여 각 조각을 스크래치. 얻은 세포 현 탁 액 50 mL 플라스틱 튜브와 g와 22 ° C x 300에 5 분 동안 원심 분리기에 전송 1.2 x 104 셀/c m2의 조밀도에 Neubauer 챔버와 씨앗을 사용 하 여 세포 현 탁 액을 계산 합니다. 완전히 다른 매일 매체를 변경 합니다.
2. 설치 및 스피너 플라스 크, RCP microcarriers, 및 생물의 살 균
- 스피너 플라스 크와 RCP microcarriers
- 하루 전에 실험, 설정 회전자 플라스 크 압력솥에 의해 살 균을 위해 그들을 준비 하 고.
참고: 회전자 플라스 크의 모자 풀어 두고, 가능 하면 수직 위치에 그들을 소독.- 풀기 중 오염을 방지 하기 위해 알루미늄 호 일 쪽 모자 주위 스피너 플라스 크를 별도로 포장. 살 균 후 오염 위험을 최소화 하기 위해 압력가 마로 소독을 위한 알루미늄 호 일의 1-2 층을 가진 플라스 크를 바꿈.
- 20 ml DPBS의 RCP macroporous microcarriers의 필요한 금액을 무게.
참고: 30 mg는 회전자 플라스 크 당 필요 합니다. 오토 클레이 브 (15 분 동안 121 ° C)에 의해 열 살 균 하기 전에 적어도 1 시간에 대 한 수 화 하자.
- 하루 전에 실험, 설정 회전자 플라스 크 압력솥에 의해 살 균을 위해 그들을 준비 하 고.
- 관류 생물
- Vascularized 조직 등가물20생산을 설명 하는 생물 시스템을 사용 합니다. 이 생물은 biomatrix 배치는 선박, 중간 저수지와 압력 병으로 구성 됩니다.
- 보통 저수지와 실리콘 튜브 ( 그림 3C참조)을 통해 압력 병 배를 연결 합니다. 느슨한 모자를 두고 고 압력솥 비닐 봉지에 잘, 가까이 하 고 두 번째 압력솥 비닐 봉투에서이 장소. 압력솥에 의해 소독.
- Vascularized 조직 등가물20생산을 설명 하는 생물 시스템을 사용 합니다. 이 생물은 biomatrix 배치는 선박, 중간 저수지와 압력 병으로 구성 됩니다.
3. hBMSCs와 RCP macroporous microcarriers에 HDMECs의 문화
참고: RCP microcarriers를 시드하는 데 사용 하는 HDMECs RFP와 lentiviral 변환에 의해 표시 되었다. 이 프로토콜은 이전에 게시 프로토콜5후 수정 되었습니다.
- RCP macroporous microcarriers는 바닥에 정착 하 고 문화 매체의 10 mL와 함께 그들을 씻어 보자. 3 회 반복 한다.
- 문화 매체의 10 mL와 함께 스피너 플라스 크를 씻으십시오.
- 문화 매체의 8 ml에서 RCP macroporous microcarriers 스피너 플라스 크 당 30 밀리 그램을 추가 합니다. 셀을 뿌리기 전에 30 분 동안 37 ° C, 5% CO2 에서 RCP microcarriers를 포함 하는 회전자 플라스 크 equilibrate
참고: 이것은 살 균 하기 전에 RCP microcarriers의 대략적인 건조 무게에 기반. - 씨앗 5 x 105 hBMSCs 또는 HDMECs (통로 3) 문화 매체의 2 mL 플라스 크 회전자 당.
- 활동가 접시와 5 분 동안 90 rpm 및 나머지 37 ° C, 5% CO2, 1 h 정적/동적 외피의 총 55 분 교 반 시작에 스피너 플라스 크를 놓습니다. 4 회 반복 한다.
- 스피너 플라스 크 당 세포 배양 매체의 10 mL을 추가 하 고 연속 95 rpm에서 교 반 시작. 37 ° C, 5% CO2에서 품 어.
- micropipette의 사용으로 걸릴 샘플 일 1, 4 및 7: 333 µ L에서 DNA에 대 한 콘텐츠 (~ 0.5 mg), 1000 µ L SEM 분석 (~ 1.5 mg) 및 라이브/죽은 얼룩에 대 한 333 µ L (~ 0.5 mg).
참고: 이것은 살 균 하기 전에 RCP microcarriers의 대략적인 건조 무게에 기반. - 문화 매체의 10 mL 매일 변경 합니다. 이 위해, RCP microcarriers는 바닥에 정착 하 고 매우 신중 하 게 10 mL 피 펫의 사용과 스피너 플라스 크에서 10 mL를 발음 다음 신선한 문화 매체의 10 mL를 추가할 때까지 기다립니다.
- 7 일 동안 37 ° C, 5% CO2 95 rpm에서 설정 하는 활동가 접시에 있는 문화를 유지.
4. DNA 콘텐츠, SEM 분석, 살고 죽은 얼룩이 지 고 분석 결과 돋 아
- DNA 콘텐츠
- micropipette 사용 2 ml 플라스틱 튜브를 사용 각 회전자 플라스 크 (서 스 펜 션의 333 µ L에 포함) 및 전송에서 microcarriers의 약 0.5 mg을 수집 합니다.
참고: 이것은 살 균 하기 전에 RCP microcarriers의 대략적인 건조 무게에 기반. - 한 번 DPBS의 1 mL로 씻어 후 상쾌한 발음.
- lyophilizer에 남아 있는 DPBS 제거 하 고 무게 나중 정규화에 대 한 동결 건조 된 microcarriers.
- 적어도 6 h-80 ° C에서 샘플을 동결.
- 300 µ L papain 5 60 ° C 하룻밤에 샘플을 품 어 U/mL.
- (예를 들어, PicoGreen dsDNA 분석 결과) 정량 분석 결과의 manufacturer´s 지침에 따라 적절 한 적정 곡선 키트 및 520에 형광 신호 측정을 수행 nm 발광 검출기.
- micropipette 사용 2 ml 플라스틱 튜브를 사용 각 회전자 플라스 크 (서 스 펜 션의 333 µ L에 포함) 및 전송에서 microcarriers의 약 0.5 mg을 수집 합니다.
- 스캐닝 전자 현미경 (SEM) 분석
- Ca. microcarriers의 1 밀리 그램에서 수집 각 회전자 플라스 크 및 전송 2 mL 플라스틱 튜브에.
- Microcarriers DPBS의 1 mL로 한 번 씻는 다.
- DPBS 제거 하 고 1 시간에 70% 에탄올의 1 mL에 품 어.
- 상쾌한을 제거 하 고 1 시간에 80% 에탄올의 1 mL에 품 어.
- 상쾌한을 제거 하 고 1 시간에 대 한 90% 에탄올의 1 mL에 품 어.
- 상쾌한을 제거 하 고 1 시간에 대 한 100% 에탄올의 1 mL에 품 어.
- 상쾌한을 제거 하 고 hexamethyldisilazane 10 분의 1 mL에 품 어.
- 뚜껑 열고 샘플 화학 후드 하룻밤을 건조 하 게 합니다.
- 적절 한 지원에 샘플을 수정 하 고 설립된 프로토콜에 따르면 SEM 분석을 진행 합니다.
- DAPI 및 라이브/죽은 얼룩
- microcarriers에 시드 셀 후 2, 4, 및 7 일에서 2 mL 플라스틱 튜브를 사용 각 회전자 플라스 크 및 전송에서 microcarriers의 0.5 mg을 수집 합니다. 한 번 씻어 DPBS의 1 mL.
- DAPI
- 그들을 충당 하기 위해 충분 한 4 %paraformaldehyde 10 분에 대 한 샘플을 수정.
- 한 번 씻어 DPBS의 1 mL.
- 락 통에 45 분 동안 얼룩 솔루션으로 실 온에서 품 어.
- 420 nm 방출 필터 형광 현미경에 DAPI 형광 신호를 감지 하 고 이미지.
- 라이브/죽은 얼룩
- 라이브/죽은 염료 솔루션의 500 µ L에서 샘플을 품 어. 빛 으로부터 보호 20 분 동안 37 ° C에서 샘플을 유지.
- 한 번 씻어 DPBS의 1 mL.
- 490 nm 방출 필터와 살아있는 세포 형광 현미경에 545 nm 방출 필터와 죽은 세포의 형광 신호를 감지 합니다. 이미지를 취득 합니다.
- HDMECs에 대 한 분석 결과 돋 아
- 콜라겐 R 솔루션 0.4%의 혼합 330 µ L, 0.1% 아세트산의 170 µ L 그리고 중간 M199 15 mL 플라스틱 튜브에서의 50 µ L. 얼음에 계속.
- micropipette 사용 microcarriers (250 µ L) ~0.375 밀리 그램 가져가 라. 1.5 mL 플라스틱 튜브에 전송, 하단에 정착 하 고 매체를 완전히 제거 하는 RCP microcarriers에 대 한 대기.
참고: 이것은 살 균 하기 전에 RCP microcarriers의 대략적인 건조 무게에 기반. - 콜라겐 혼합물을 중화 하 고 즉시 RCP microcarriers와 함께 그것을 혼합 하는 데 필요한 0.2 N NaOH의 볼륨을 추가 합니다.
참고: ph에서 변화까지 혼합물에 추가 하 여 0.2 N NaOH의 필요한 금액을 사전에 결정 (노란색 컬러에서 차례 분홍색), 다음 후 젤을 형성 하는 1 분 동안 인큐베이터에 혼합물을 배치. - 플레이트 24-잘 접시의 우물에 콜라겐 젤-RCP microcarriers 혼합물. 37 ° C와 30 분 동안 5% CO2 에서 품 어.
- 혈관 내 피 성장 인자 (예, VascuLife VEGF Mv 문화 매체)의 200 µ L를 추가 합니다. 37 ° C, 5% CO2 24 h에서 품 어.
- 쏘아 단계 대조 현미경 배율 개체 X 10을 사용 하 여 관찰 하 고 이미지.
5. Biomatrix 시드 및 HDMECs에 대 한 생물 시스템의 시작
- 생물 문화를 시작 하기 전에 1 일 오픈 BioVaSc (biomatrix) 경도 antimesenteric 측에 자르고 이전 소독된 폴 리카 보 네이트 프레임에 고정 ( 그림 3A, B참조).
참고: 있는 BioVaSc biomatrix 게시21이전 준비 decellularized 돼지 jejunal 세그먼트에서 얻은입니다.
참고: 폴 리카 보 네이트 프레임 열, 소독 수로 소닉 목욕 (40khz) 25 분에 대 한 에탄올 70% 부 화 3 시간 뒤 부 화 20 분 여 소독. 다음, 3 번 DPBS와 프레임 살 균 세척.- 100 mm 페 트리 접시에에서 biomatrix 프레임 시스템을 배치 하 고 혈관 내 피 성장 인자 + 1% 채워 페니실린 스 (펜/Strep).
- 하룻밤에 37 ° C, 5% CO2배양으로 biomatrix equilibrate.
- 분리 후 셀 계산, 10 x 107 HDMECs biomatrix의 보존된 맥 관 구조를 통해 문화 매체의 1000 µ L에 2 mL 주사기를 사용 하 여 주사.
참고: 동맥 입구를 통해 µ L ~ 700 및 정 맥 출구를 통해 ~ 300 µ L를 주사. - 셀 첨부 파일을 허용 하도록 37 ° C, 5% CO2 3 h에서 품 어.
- 혈관 내 피 성장 인자 + 1%의 350 mL 생물 시스템을 채울 펜/Strep 고 37 ° C, 5% CO2에서 품 어.
- 장소는 생물의 선박 내부 프레임. 동맥 및 정 맥 pedicles 선박에 연결 합니다.
- 연동 펌프에 생물 시스템을 연결 하 여 재 관류를 시작 합니다. 10 mmHg와 진폭 ± 1에 압력을 설정 합니다.
- 매 시간 마다 100 mmHg의 압력, 진폭 ± 20 도달까지 단계적 압력 증가.
- 37 ° C, 5% CO2에서 이러한 조건 하에서 7 일 동안 생물 시스템을 유지.
6. RFP-HDMECs는 biomatrix에의 추가
- 0.4% 콜라겐 R 솔루션의 330 µ L, 0.1% 아세트산의 170 µ L 15 mL 송 골 매 관에에서 중간 M199의 50 µ L를 믹스. 얼음에 계속.
- 스피너 플라스 크에서 RCP microcarriers를 가져가 라. 문화 매체를 완전히 제거 합니다.
- 콜라겐 혼합물을 중화 하 고 즉시 RCP microcarriers와 함께 그것을 혼합 하는 데 필요한 0.2 N NaOH의 볼륨을 추가 합니다.
- biomatrix 루멘에 콜라겐 젤-RCP microcarriers 혼합물을 추가 합니다. 30 분 동안 겔 화를 허용 한다.
- 동시에는 생물의 중간 매체를 완전히 제거 하 여 변경 하 고 다음 350 mL 신선한, 사전 예 열, 혈관 내 피 성장 인자 + 1% 추가 펜/Strep.
- 연동 펌프에는 생물 반응 기를 연결 하 고 100 mmHg 및 진폭 ± 20에서 압력을 설정 합니다.
- 매체 7 일 마다 변경 합니다.
- 21 일에 대 한 문화에는 생물 반응 기를 유지.
7. 분석 및 생물 문화 지요
- 샘플의 준비
- biomatrix는 생물에서 분리 하 고 폴 리카 보 네이트 프레임에서 제거 합니다.
- 6 섹션으로 얻은 조각 잘라: MTT, 2 파라핀 포함/얼룩 및 SEM 분석을 위한 2 대 2.
- 파라핀 포함
- 페 트리 접시에 섹션을 배치 하 고 그들을 충당 하기 위해 충분 한 DPBS 세척. DPBS 삭제 합니다.
- 하룻밤에 4 %paraformaldehyde 섹션을 수정 합니다.
- 파라핀 포함 카세트를 준비 하 고 표준 프로토콜에 따라 수행.
- 파라핀 블록에서 섹션을 준비 하 고 H & E 염색는 톰의 사용에 대 한 3 µ m의 샘플을 잘라.
- H & E 염색
- 표준 프로토콜32에 따르면 rehydrated 섹션을 얼룩.
- 스캐닝 전자 현미경 (SEM) 분석
- 페 트리 접시에 섹션을 배치 하 고 그들을 충당 하기 위해 충분 한 DPBS 세척. DPBS 삭제 합니다.
- 밤새 4.75%도 함께 수정 섹션.
- 농도의 에탄올 50%-100% 증가 함께 탈수 체인을 수행 합니다.
- 10 분 사용된 HMDS 삭제에 대 한 hexamethyldisilazane (HMDS)와 섹션을 커버 하 고 신선한 HMDS를 추가 합니다.
- 연기 후드 건조 하룻밤 섹션을 허용 하 고 이미징에 대 한 샘플을 준비.
- 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium 브 로마 이드 (MTT)
- MTT 시 약 1 mg/mL의 농도에서 혈관 내 피 성장 인자와 함께 믹스.
- 37 ° C, 5% CO290 분에 대 한 MTT 솔루션 섹션을 품 어.
- 거시적 또는 metabolically 활성 셀을 검출 밝은 분야 현미경 혈관 구조 및 셀 시드 microcarriers를 준수 합니다. 이미지를 취득 합니다.
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Representative Results
그림 1A에서 같이, 우리는 문화의 라이브/죽은 얼룩에 의해 결정 7 일 후 RCP microcarriers에 가능한 셀의 높은 수를 얻었다. 그 결과 완전히 식민지 화 microcarriers 숨 구멍, 분할 그들 (그림 1B)를 overgrowing 주위 관찰 되었다 SEM 분석에 의해 확인 되었다. 다른 한편으로, 없는 셀은 균등 하 게 시드되지 않습니다 실험 결과 여러 빈 microcarriers. 실패 한 실험 해서는 안 이상 총 셀 금액 (그림 1C)의 10%는 죽은 세포의 비정상적으로 높은 숫자를 특징 이다. 또한, HDMECs의 DNA 콘텐츠 정량화 시간 (그림 1D) dsDNA의 증가 보였다.
또한, RFP HDMECs 그림 2, 셀 콜라겐 젤에서 교양 때 돋 아 형을 채택 RCP microcarriers에 문화 후 그들의 기능을 유지할 수 있었다.
또한, 우리는 다시 시드하 biomatrix BioVaSc의 루멘 RFP HDMECs 식민지 RCP microcarriers를 사용. 이 위해, 우리 고용 vascularized 조직 등가물22 (그림 3C)는 우리는 biomatrix 컷-오픈 및 폴 리카 보 네이트 프레임에 배치의 생리 적 재 관류를 위한 생물 반응 기 시스템 있도록 루멘도 설정 (에서 노출 되었다 그림 3B)입니다.
21 일 후 생물 문화, metabolically 활성 셀 RCP microcarriers에 뿐만 아니라는 biomatrix의 보존된 맥 관 구조에 둘 다 참석 했다 (그림 4A 와 그림 3B). 루멘은 biomatrix의 나는 microcarriers에 혈관의 내 피 세포를 정착의 실패 한 실험 또는 조직학 샘플의 단면 중 조각의 잘못 된 선택 발생할 수 있습니다. 이러한 결과 biomatrix 섹션, 어디 그것은 일부 지역 RCP microcarriers의 세포에 의해 여전히 덮여 있었다 그리고 RCP microcarriers는 biomatrix에 가까운 근접에서 관찰 될 수 있었다의 SEM 분석에 의해 확인 될 수 있었다 (그림 4C 와 4 D)입니다.
마지막으로, H & E 염색 biomatrix 혈관 구조 (그림 5A)에 특히에 HDMECs의 존재를 확인 했다. 형광 현미경 관찰, 식민지는 biomatrix의 혈관 구조 셀 RFP-HDMECs (그림 5B)는 biomatrix RCP microcarriers에서 셀의 마이그레이션 나타내는 것 결과. 일부 RFP HDMECs 또한 RCP microcarriers (그림 5C 및 5d)에 관찰 되었다. 없는 셀 않았다로 인해 안 살아남은 배양 조건 (예: 짧은 문화 회) 변경 하는 실험에서 그들은 수 감지 되지 이전에 보고 된 기술 (그림 5E 와 5 층의 혈관 구조 내부 ).
그림 1: HDMECs와 RCP microcarriers에 hBMSCs의 문화. (A, C) 라이브/죽은 동적 문화의 7 일 후 얼룩. 동적 문화권의 7 일 후 RCP microcarriers에 경작 하는 HDMECs의 (B) SEM 분석. (D) DNA 콘텐츠 PicoGreen 분석 결과 키트에 의해 결정 됩니다. 평균 ± 표준 편차로 표현 하는 데이터 (n = 3). 스케일 바: a 200 µ m, 88 µ m b, 그리고 c 100 µ m 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 돋 아 분석 결과. 콩나물 RFP HDMECs의 밝은 분야 (A) 및 형광 현미경 검사 법 (B), 신흥 식민지 RCP microcarrier에서 콜라겐 젤에 문화의 24 h 후 관찰할 수 있습니다. (C) 이미지 오버레이. 스케일 바: 100 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: Biomatrix 및 생물 설정. (A) 준비 biomatrix 및 (B)폴 리카 보 네이트 프레임에 장착 합니다. (C) 생물 설정 했다입니다. 배 중간 저수지와 실리콘 튜브를 통해 압력 병에 연결 되 고 전체 시스템이 연동 펌프에 연결 되어. 압력은 압력 센서를 통해 측정 됩니다. 인공 지능: 동맥 입구; VO: 정 맥 출구. 이 그림 Groeber 그 외 여러분 에서 수정 되었습니다. 22 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 생물 읽어. MTT 분석 결과 metabolically 활성 셀 (A) biomatrix 뿐만 아니라 RCP microcarriers (B)에 보존 된 맥 관 구조에서 관찰 되었다 문화의 21 일 후 biomatrix 섹션에서 수행. (C, D) RCP biomatrix 섹션에 microcarriers의 SEM 이미지. 스케일 바: a, B, c, 47 µ m 및 디 대 한 225 µ m 0.45 cm 0.28 c m 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: H & E 염색 & 형광 이미지. (A, C, E) H & E 염색입니다. (B, D, F) 21 일 후 문화, RFP HDMECs RCP microcarriers (화살표 머리)에 뿐만 아니라 biomatrix (화살표)의 맥 관 구조 안에 관찰 되었다. 스케일 바: 50 µ m E 및 F. A-D 및 30 µ m에 대 한 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
Microcarrier의 하나의 주요 목표는 필요의 위치로 셀을 전달 하기 위하여 그들의 차별화를 유지 하면서 세포의 확장입니다. 표현된 방법 소개 RCP microcarriers 세포 부착, 증식, 및 높은 세포 밀도 microcarriers 식민지를 수 있었다. 이 라이브/죽은 얼룩, 어떤 실행 가능한 세포의 90% 이상 검색만 몇 죽은 세포의 동적 문화 7 일 후 가져온 동안에 의해 관찰 되었다. 마찬가지로, SEM 이미지 셀 문화의 7 일 후에 microcarriers의 전체 표면을 커버 확인.
3D 모델에서 세포 생존을 보장 하기 위해, 그것은 세포에 산소와 양분의 공급을 유지 하 고 폐기물 물질의 제거를 허용 하는 것이 중요. 혈관에는 있는 내 피 세포 들은 혈관23의 안쪽 부분을 일렬로 세우는 세포 때문 핵심적인 역할을 담당할이 교환 과정의 책임 구조. 그들은 격 증, 마이그레이션, 준수, 새싹, 및24배 모양의 구조 형성 하는 기능이 있다. 이러한 속성 때문에 셀 돋 아 형을 채택할 수 있었다 관찰 되었다 RCP microcarriers에 RFP HDMECs의 문화 후 유지 되었다 ( 그림 2참조). 우리 여기에 이러한 식민지 RCP microcarriers 다시 시드하 루멘 BioVaSc biomatrix의 전 혈관의 내 피 세포를 기본 제공 효과적으로 되었다 증명할 수 있습니다. 이 임상 응용 프로그램에 대 한 설계 조직 이식의 vascularization를 개선 하기 위해 적합 하다 우리의 시스템을 제안 합니다. Vascularization 접근25, 뿐만 아니라 종양 체 외에 시스템21,26,,2728 테스트 및 생산을 위해이 매트릭스의 파생 상품 성공적으로 사용 되었습니다. 동물 실험29대신에 피부 해당의 여기 사용 되는 오픈에서 설정 평평 하 고 조직 등가물22의 세대에 대 한 적용으로 관류 생물에 배치.
생물 반응 기 생산 용이성을 도울 수 있는 조직을 등가물 제거와 사망률30같은 관련 된 위험을 줄이면서 장기의 수요 조직 공학에 사용 되었습니다. 그러나, 조직 같은 구문을 생산 조직의 특정 세포 유형, 적합 한 비 계 및 적절 한 차별화 및 3 차원 조직으로 조립 허용 하는 적절 한 성장 요인의 사용을 포함 하는 매우 복잡 한 과정 이다. 설계 구조에의 한 주요 단점은 세포 생존을 지 원하는 적절 한 혈관 네트워크의 부족 이다 생체 외에서 그리고 vivo에서17. 여기 우리가 결합 RCP 식민지 microcarriers bioreactor 모델에서 decellularized 매트릭스 셀 형식이 필요한 세포 접착 및 혈관 형성을 위한 필수 요소를 제공 하는 특정 문화 매체를 허용 하는 비 계를 제공 하 격 증 및 그들의 기능 특성을 유지 하는 세포. 이 모델의 중요 한 결과 추가 분리 또는 필요한 다른 접근31소화 하지 않고 발판 RCP microcarriers에서 마이그레이션하는 HDMECs의 능력입니다. 이후에, 그들은 특히 혈관 구조 개념을 증명 하는 그 macroporous microcarriers 재생 의학 목적을 위해 셀 배달 시스템으로 사용할 수 있습니다 매트릭스의 식민지.
모두,이 프로토콜 최대화 셀 확장 위한 재생 의학에서 유망한 전략 나타내고 이식 사이트, 어디 그것은 vascularization 설계 조직 이식에 대 한 지원을 향상 시킬 수 있습니다 셀 배달 될 수 있는.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이러한 결과 연구 자금에서 유럽 연합 7 번째 프레임 워크 프로그램 FP7/2007-2013 부여 계약 n ° 607051에서 (바이오 영감)을 받고 있다. SEM 분석에 대해 규 산 연구 ISC를 위한 RCP 제조, 프라 운 호퍼 연구소에서 베르너 Stracke 동안 기술 지원에 감사 반 Carolien Spreuwel-후 지 필름 제조 유럽 변환기에서 Goossens 하 고.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide (MTT) | Serva Electrophoresis GmbH | 20395.01 | |
| 4’,6-Diamidino-2-phenylindoldihydrochloride (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Acetic acid 100% | Sigma-Aldrich | 533,001 | |
| Analytical balance Kern EG 2200-2NM | Kern & Sohn GmbH | ||
| Ascorbate-2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| Bioreactor | Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Wuerzburg, Germany | ||
| Bright field microscope Axiovert 40C | Carl Zeiss AG | ||
| Cellnest | Fujifilm | ||
| Centrifuge tubes (15 mL, 50 mL) | Greiner Bio-One | ||
| Collagen R solution 0,4% | Serva Electrophoresis GmbH | 47254.01 | |
| DMEM-F12 | Gibco | 11320-033 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | Modified, without calcium chloride and magnesium chloride |
| Eosin 1% | Morphisto | 10177.01000 | |
| Ethanol 96% | Carl Roth GmbH | T171.4 | Denatured |
| Fetal calf serum (FCS) | Bio&SELL | FCS.ADD.0500 | not heat-inactivated |
| Fluorescence microscope BZ-9000 | Keyence | ||
| Haematoxylin | Morphisto | 10231.01000 | |
| Hexamethyldisilazane | Sigma-Aldrich | 440191 | Reagent grade, ≥99% |
| Incubator for bioreactor | Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Wuerzburg, Germany | ||
| Live/Dead Cell Double Staining Kit | Fluka | 04511KT-F | |
| Magnetic stirrer plate | 2Mag | 80002 | |
| Medium 199 | Sigma-Aldrich | M0650 | 10X |
| Microplate reader Tecan Infinite M200 |
Tecan | ||
| Needle 21G 16mm | VWR | 613-5389 | |
| Papain from papaya latex | Sigma-Aldrich | P4762 | lyophilized powder, ≥ 10 units/mg protein |
| Paraffin | Carl Roth GmbH | 6642.6 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Peristaltic pump | Ismatec | ||
| Quanti-iT PicoGreen dsDNA assay kit | Thermo Fischer Scientific | P7589 | |
| Histofix 4% | Carl Roth GmbH | P087 | |
| Scanning Electron Microscope Supra 25 | Carl Zeiss AG | ||
| Sodium hydroxide solution 1.0 N | Sigma-Aldrich | S2770 | |
| Spinner flasks (25 mL) | Wheaton | 356879 | |
| Syringe 1 mL | VWR | 720-2561 | |
| Tissue culture flasks (25 cm2, 75 cm2, 150 cm2) | TPP Techno Plastik Products AG | ||
| Trypan blue 0.4% | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| VascuLife VEGF-Mv | Lifeline cell technology | LL-0005 |
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