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Bioengineering

Ricombinante collagene Peptide Microcarriers per l'espansione delle cellule e loro potenziale utilizzo come sistema di consegna di cella in un bioreattore modello

Published: February 7, 2018 doi: 10.3791/57363
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 3, 1,2
1Department Tissue Engineering and Regenerative Medicine, University Hospital Wuerzburg, 2Translational Center Regenerative Therapies (TLC-RT), Fraunhofer Institute for Silicate Research ISC, 3Fujifilm Manufacturing Europe B.V.

Summary

Vi proponiamo un protocollo di espansione delle cellule su microcarriers macroporosa e loro uso come sistema di consegna in un bioreattore di perfusione per inizializzare una matrice di tessuto decellularizzati. Abbiamo anche diverse tecniche per determinare la proliferazione delle cellule e l'attuabilità delle cellule coltivate su microcarriers. Inoltre, dimostriamo la funzionalità delle cellule dopo le culture di bioreattore.

Abstract

Ingegneria tissutale è un settore promettente, focalizzato sullo sviluppo di soluzioni per la crescente domanda su tessuti e organi in relazione alle finalità di trapianto. Il processo per generare tali tessuti è complesso e comprende un'appropriata combinazione di tipi cellulari specifici, impalcature e stimoli fisici o biochimici per guidare la crescita delle cellule e differenziazione. Microcarriers rappresentano uno strumento attraente per espandere le cellule in un microambiente tridimensionale (3D), poiché forniscono maggiore superficie--rapporti di volume e imitare più da vicino la situazione in vivo rispetto ai metodi tradizionali bidimensionali. Il sistema vascolare, approvvigionamento di ossigeno e sostanze nutritive alle cellule e per garantire la rimozione dei rifiuti, costituisce un elemento importante quando generazione progettato tessuti. Infatti, maggior parte dei costrutti non riuscire dopo essere impiantati a causa della mancanza di supporto vascolare. In questo studio, presentiamo un protocollo per l'espansione delle cellule endoteliali su microcarriers basati su collagene ricombinante in condizioni dinamiche in boccetta spinner e bioreattori e spieghiamo come determinare in questa vitalità cellulare impostazione e funzionalità. Inoltre, proponiamo un metodo per la consegna delle cellule per scopi di vascolarizzazione senza passaggi aggiuntivi distacco necessari. Inoltre, mettiamo a disposizione una strategia per valutare la vascolarizzazione delle cellule potenziale in un bioreattore di aspersione su una matrice biologica decellularizzato. Noi crediamo che l'uso dei metodi presentati potrebbe portare allo sviluppo di nuove terapie basate sulle cellule per una vasta gamma di applicazioni nella pratica clinica di ingegneria tissutale.

Introduction

Un problema generale in applicazioni di ingegneria del tessuto è di produrre una massa elevata delle cellule con il fenotipo di differenziazione corretta nella posizione di bisogno. L'applicazione di microcarriers per affrontare questo problema iniziato nel 1967 con sempre maggiore importanza fino ad oggi nei campi come ingegneria tissutale ortopedici per generazione su larga scala di pelle, ossa, cartilagine e tendini1. Essi consentono la movimentazione di culture aderente in modo simile a quello di sospensione culture2 espandendo cellule su substrati di Microscala tridimensionale (3D). Quindi le cellule esperienza un apporto nutritivo omogeneo e interazioni cellula-matrice che piombo per migliore manutenzione di in vivodifferenziazione4 3,, che è spesso persa nel tempo in 2D si avvicina a5. Un più alto rapporto superficie-volume - finalmente che conduce alla cella superiore rendimenti6,7, superiore di gas e nutrienti tassi di cambio rispetto a sistemi statici8, la possibilità di regolare e salvi la cultura fisica stimoli9e il potenziale per la scalabilità del processo espansione7 sono ulteriori vantaggi. Diverse funzionalità come diametro, densità, porosità, carica superficiale e adesione proprietà10,11 distinguere il commercialmente disponibili micro - e macro-elementi portanti differenti. Tuttavia, uno del vantaggio principale è la loro consegna potenziale come microtissues sito difetto o domanda.

Per le applicazioni della tecnologia microcarrier in ingegneria del tessuto osseo, abbiamo illustrato in un precedente rapporto12 la produzione di un nuovo microcarrier tipo costituita di un collagene ricombinante I peptidi (RCP, disponibile nel commercio come Cellnest). Questo nuovo microcarrier permette il secondo GMP le proporzioni di impalcatura e cella di produzione, come necessario per la consegna delle cellule in uno scenario clinico. In questo contesto, ottimizzazione della stabilità dell'impalcatura, tasso di degradazione e proprietà di superficie attraverso la corretta scelta di una strategia di reticolazione adatta permette di adattare la tecnica per l'applicazione selezionata, cell tipo di interesse o tessuto13di destinazione. In particolare, l'occupazione potenziale di questa microcarrier come un sistema di consegna delle cellule iniettabili per applicazione terapeutica14 li rende particolarmente interessanti in una regolazione clinica.

In questa carta, abbiamo quindi illustrare la procedura di coltura per l'isolamento e l'espansione delle derivate da midollo osseo cellule mesenchimali umane stromali (hBMSCs) e cellule endoteliali microvascolari cutanee umane (HDMECs) il collagene-io-base ricombinante microcarriers peptidici e la loro preparazione per la consegna in una regolazione clinica. Inoltre, descriviamo protocolli aggiuntivi utili per il mantenimento della vitalità cellulare al momento dell'impianto.

La vitalità cellulare dopo l'impianto è infatti fortemente dipendente vascolarizzazione15,16,17, che assicura uno scambio di ossigeno e nutrienti e facilita la rimozione dei rifiuti. Bioreattori costituiscono un approccio per superare le sfide di vascolarizzazione in ingegneria tissutale e mantenere la vitalità cellulare, tramite aspersione del terreno di coltura fornendo quindi ossigeno e sostanze nutritive18. Qui, vi illustriamo un metodo in vitro per valutare la capacità di migrazione delle cellule endoteliali microvascolari da microcarriers la RCP per una biomatrice e la loro capacità di contribuire alla vascolarizzazione de novo e l'angiogenesi. Questo biomatrice è un segmento decellularizzato del digiuno porcina definito BioVaSc (Scaffold biologici vascolarizzato), ricca di collagene ed elastina e con conservato le strutture vascolari, che comprende un'arteria d'alimentazione e una vena drenante19 che è stato applicato per l'impianto problemi20.

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Protocol

hBMSCs sono stati isolati dalla testa del femore di pazienti di osteoartrite che subiscono la chirurgia di sostituzione della testina del femore. La procedura è stata eseguita sotto l'approvazione del comitato etico locale dell'Università di Wuerzburg e consenso informato dei pazienti. Cellule endoteliali microvascolari primarie sono state isolate da biopsie di prepuzio dei donatori giovanile. Loro in qualità di rappresentante legale fornito pieno consenso informato per iscritto. Lo studio è stato approvato dal comitato etico locale dell'Università di Wuerzburg (votazione 182/10).

1. isolamento di hBMSCs e HDMECs

  1. Derivate da midollo osseo cellule mesenchimali umane stromali (hBMSCs)
    1. Rimuovere osso spugnoso dalla testa del femore utilizzando un cucchiaio sterile.
      Nota: L'osso spugnoso appare come una sostanza sciolto e granulare all'interno dell'osso corticale, che è duro e rigido. Può essere necessario novo parti dell'osso spugnoso da osso corticale usando un bisturi.
    2. Inserire l'osso spugnoso rimosso in due provette da 50 mL. Il volume dell'osso spugnoso può variare da 5 a 10 mL secondo la dimensione della testa del femore rimossa durante la chirurgia di sostituzione dell'anca.
    3. Lavare con DMEM-F12 (miscela 1:1 di medium DMEM e prosciutto F12), riempire il tubo con circa 30 mL di terreno.
    4. Agitare manualmente, il tubo in modo longitudinale, per 5 s per lasciare che le cellule adipose dall'osso spugnoso. Centrifugare a 300 x g e 22 ° C per 5 min.
    5. Aspirare con una pipetta di plastica graduata, lo strato delle cellule di grasso e circa 20 mL di surnatante rimanente. Lasciate abbastanza medio per coprire l'osso spugnoso.
    6. Riempire le provette con 10 ml di DMEM-F12 e agitare vigorosamente longitudinalmente, per 10-15 s, di lasciare le cellule fuori.
    7. Consente di trasferire un nuovo tubo 50 mL 10-15 mL di sospensione cellulare con una pipetta di plastica graduata dai tubi.
    8. Ripetere 2 - 3 volte dal passo 1.1.6 pool insieme la sospensione cellulare ottenuta fino a quando l'osso spugnoso raccolto nel tubo 50 mL è bianco.
    9. Trasferire la sospensione cellulare con una pipetta di plastica graduata in due nuove provette, evitando aspirando il pellet di collagene depositato sul fondo delle provette 50ml.
    10. Centrifugare la sospensione cellulare a 300 x g e 22 ° C per 5 min. eliminare il supernatante aspirando con una pipetta di plastica graduata.
    11. Aggiungere 40 mL di DMEM-F12 10% FCS 1% Pen/Strep 50 µ g/mL dell'ascorbato-2-fosfato in un terzo tubo. Trasferire 5 mL di questo mezzo ogni provetta contenente il pellet cellulare. Risospendere il pellet cellulare di sfarfallamento vigorosamente il fondo della provetta e trasferire le sospensioni delle cellule nella provetta contenente solo mezzo.
    12. OPTIONAL: Diluire 100 µ l della sospensione di cellule per il conteggio delle cellule, diluizione 1: 100 prima con PBS e poi 01:10 in blu di trypan, aggiungendo 15 µ l della diluizione prima a 15 µ l di DPBS e 30 µ l Trypan blu per ottenere un DPBS: rapporto tripan blu 1:1. Contare le celle con una camera a Neubauer standard.
    13. Come descritto in 1.1.11 del seme le cellule a 109 celle/175 cm2 T-boccetta in 25 mL di terreno. In alternativa, è possibile dividere la sospensione di cellule intere in matracci di cultura di cellule di2 cm 175 fino a dieci senza contare. In questa fase, non sono distinguibili dagli eritrociti, che li superano notevolmente hBMSCs. hBMSCs apparirà come colonie sparse (1-2/boccetta) nel corso dei primi 7 giorni.
    14. Sostituire il terreno dopo 4 giorni dalla semina per consentire l'interazione delle cellule del sangue con il hBMSCs. Dopo il primo scambio medio, cambiare il mezzo ogni 2-3 giorni. Eseguire il cambio medio di rimuovere completamente il terreno di coltura con una pipetta di plastica graduato, lavare due volte con DPBS (da aggiungere 10 mL di DPBS per le celle aderenti e rimuovere completamente DPBS con una pipetta di plastica graduata) e quindi aggiungere 20 mL di terreno di nuovo, come descritto in 1.1.11.
  2. Cellule endoteliali microvascolari cutanee umane (HDMECs)
    1. Trattare le biopsie della pelle e isolare il HDMECs secondo protocolli precedentemente pubblicati21. Brevemente, dopo la separazione del derma dall'epidermide, incubare il derma in tripsina per 40 min a 37 ° C e 5% CO2. Dopo il tempo di incubazione, trasferire il derma una piastra Petri contenente terreno di coltura e graffiare ogni pezzo con l'uso di un bisturi. Trasferire la sospensione cellulare ottenuta a un tubo di plastica da 50 mL e centrifugare per 5 minuti a 300 x g e 22 ° C. Contare la sospensione cellulare utilizzando una camera di Neubauer e seme ad una densità di 1.2 x 104 cellule/cm2. Modificare il mezzo completamente ogni altro giorno.

2. set-up e la sterilizzazione di boccette di spinner, RCP microcarriers e bioreattore

  1. Boccette di Spinner e RCP microcarriers
    1. Un giorno prima degli esperimenti, set-up lo spinner boccette e prepararli per la sterilizzazione in autoclave.
      Nota: Lasciare i tappi delle beute spinner sciolto e, quando possibile, sterilizzarli in posizione verticale.
      1. Avvolgere le beute spinner con foglio di alluminio attorno i tappi laterali separatamente al fine di evitare la contaminazione durante la rimozione del wrapping. Avvolgere le beute con 1-2 strati di carta stagnola per sterilizzazione in autoclave al fine di minimizzare i rischi di contaminazione dopo la sterilizzazione.
    2. Pesare la quantità necessaria di RCP macroporosa microcarriers in 20 mL di DPBS.
      Nota: 30 mg è necessaria per fiaschetta spinner. Far loro tenere a bagno per almeno 1 h prima di sterilizzazione in autoclave (121 ° C per 15 min).
  2. Bioreattore a perfusione
    1. Utilizza il sistema di bioreattore descritto per produrre tessuto vascolarizzato equivalenti20. Questo bioreattore è costituito da un recipiente, in cui è collocato il biomatrice, un serbatoio medio e una bottiglia di pressione.
      1. Collegare il vaso con il serbatoio medio e la bottiglia di pressione attraverso tubicini di silicone (Vedi Figura 3). Lasciare i tappi sciolto e metterlo in un sacchetto di plastica di autoclave, chiudere bene e questo posto in un sacchetto di plastica autoclave secondo. Sterilizzare in autoclave.

3. la cultura di hBMSCs e HDMECs su microcarriers macroporosa RCP

Nota: I HDMECs utilizzati per inizializzare il microcarriers RCP sono stati etichettati con RFP attraverso la trasduzione lentivirale. Questo protocollo è stato modificato dopo un protocollo precedentemente pubblicato5.

  1. Lasciate che la RCP macroporosa microcarriers depositano alla parte inferiore e lavare con 10 mL di terreno di coltura. Ripetere 3 volte.
  2. Lavare boccette di spinner con 10 mL di terreno di coltura.
  3. Aggiungere 30 mg di RCP macroporosa microcarriers per fiaschetta spinner in 8 mL di terreno di coltura. Equilibrare le beute spinner contenente la RCP microcarriers a 37 ° C e 5% di CO2 per 30 min, prima della semina delle cellule.
    Nota: Questo si basa sul peso secco approssimativo di RCP microcarriers prima della sterilizzazione.
  4. Per fiaschetta spinner in 2 mL di terreno di coltura del seme 5x105 hBMSCs o HDMECs (passaggio 3).
  5. Posizionare le beute spinner sulla piastra di agitatore e inizio mescolando a 90 rpm per 5 min e resto per 55 min a 37 ° C e 5% CO2, per un totale di 1 h di incubazione statico/dinamico. Ripetere 4 volte.
  6. Aggiungere 10 mL di terreno di coltura cellulare per fiaschetta spinner e quindi avviare continua agitazione a 95 giri/min. Incubare a 37 ° C e 5% CO2.
  7. Con l'uso di una micropipetta prelevare campioni a giorni 1, 4 e 7:333 µ l di DNA contenuto (~ 0,5 mg), 1000 µ l per analisi SEM (~ 1,5 mg) e 333 µ l per la macchiatura live/dead (~ 0,5 mg).
    Nota: Questo si basa sul peso secco approssimativo di RCP microcarriers prima della sterilizzazione.
  8. Cambiare 10 mL di terreno di coltura ogni altro giorno. Per questo, attendere che la RCP microcarriers depositano alla parte inferiore e molto attentamente aspirare 10 mL dalla beuta spinner, con l'uso di una pipetta da 10 mL e quindi aggiungere 10 mL di terreno di coltura fresco.
  9. Mantenere le culture sulla piastra agitatore a 95 rpm, a 37 ° C e 5% di CO2 per 7 giorni.

4. contenuto di DNA, analisi SEM, vivere morto macchiatura e dosaggio di germogliatura

  1. Contenuto di DNA
    1. Con l'uso di una micropipetta, raccogliere circa 0,5 mg di microcarriers da ogni boccetta di spinner (contenuta nel 333 µ l di sospensione) e il trasferimento a un tubo di plastica di 2 ml.
      Nota: Questo si basa sul peso secco approssimativo di RCP microcarriers prima della sterilizzazione.
    2. Lavare una volta con 1 mL di DPBS, quindi aspirare il surnatante.
    3. Togliere il restante DPBS in un liofilizzatori e peso il liofilizzato microcarriers per normalizzazione successiva.
    4. Congelare i campioni a-80 ° C per almeno 6 ore.
    5. Incubare i campioni a 60 ° C durante la notte con papaina di 300 µ l 5 U/mL.
    6. Stabilire le curve di titolazione appropriata seguendo le istruzioni del produttore del dosaggio quantificazione (ad es., analisi di dsDNA PicoGreen) kit ed eseguire la misurazione del segnale fluorescente a 520 nm con un rilevatore di luminescenza.
  2. Analisi di microscopia elettronica (SEM) a scansione
    1. Raccogliere ca. 1 mg di microcarriers da ciascuna beuta spinner e trasferire a un tubo di plastica di 2 mL.
    2. Lavare microcarriers una volta con 1 mL di DPBS.
    3. Rimuovere DPBS e incubare in 1 mL di etanolo al 70% per 1 h.
    4. Rimuovere il surnatante e incubare in 1 mL di etanolo di 80% per 1 h.
    5. Rimuovere il surnatante e incubare in 1 mL di etanolo al 90% per 1 h.
    6. Rimuovere il surnatante e incubare in 1 mL di etanolo al 100% per 1 h.
    7. Rimuovere il surnatante e incubare in 1 mL di esametildisilazano per 10 min.
    8. Aprire il tappo e lasciare che il pernottamento asciutto campioni sotto una cappa chimica.
    9. Difficoltà campioni su adeguato supporto e procedere all'analisi SEM secondo i protocolli stabiliti.
  3. DAPI e Live/Dead macchiatura
    1. Al giorno 2, 4 e 7 dopo semina sul microcarriers cellulare raccogliere 0,5 mg di microcarriers da ciascuna beuta spinner e trasferire a un tubo di plastica di 2 mL. Lavare una volta con 1 mL di DPBS.
    2. DAPI
      1. Difficoltà campioni per 10 min in abbastanza paraformaldeide al 4% per la loro copertura.
      2. Lavare una volta con 1 mL di DPBS.
      3. Incubare a temperatura ambiente con la soluzione colorante per 45 minuti su un agitatore a dondolo.
      4. Rilevare il segnale fluorescente DAPI il microscopio a fluorescenza con un filtro di emissione 420 nm e acquisire immagini.
    3. Live/Dead macchiatura
      1. Incubare i campioni in 500 µ l di soluzione colorante Live/Dead. Conservare i campioni a 37 ° C per 20 min, al riparo dalla luce.
      2. Lavare una volta con 1 mL di DPBS.
      3. Rilevare il segnale di fluorescenza delle cellule viventi con un filtro di emissione 490 nm e di cellule morte con un filtro di emissione 545 nm su un microscopio a fluorescenza. Acquisire immagini.
    4. Test di germinazione per HDMECs
      1. Mix 330 µ l di soluzione di collagene R 0.4%, 170 µ l di acido acetico 0.1% e 50 µ l di medium M199 in un tubo di plastica da 15 mL. Tenere il ghiaccio.
      2. Prendere ~0.375 mg di microcarriers (250 µ l) con l'uso di una micropipetta. Trasferire in una provetta di plastica da 1,5 mL, attendere per la RCP microcarriers depositano alla parte inferiore e rimuovere completamente il mezzo.
        Nota: Questo si basa sul peso secco approssimativo di RCP microcarriers prima della sterilizzazione.
      3. Aggiungere il volume di NaOH 0,2 N necessario per neutralizzare la miscela di collagene e miscelare immediatamente con la RCP microcarriers.
        Nota: Determinare la quantità necessaria di NaOH 0,2 N in anticipo aggiungendo alla miscela fino al cambiamento del pH (girare dal colore giallo al rosa) e poi mettendo la miscela nell'incubatrice per 1 min, dopo di che deve essere formato un gel.
      4. La miscela di microcarriers collagene gel-RCP in un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti della piastra. Incubare a 37 ° C e 5% CO2 per 30 min.
      5. Aggiungere 200 µ l del fattore di crescita endoteliale vascolare (ad es., terreno di coltura VascuLife VEGF-Mv). Incubare a 37 ° C e 5% CO2 per 24 h.
      6. Osservare sotto un microscopio di contrasto di fase inverso, utilizzando un oggetto di ingrandimento, di 10x e acquisire immagini.

5. biomatrice seeding e inizio del bioreattore sistema per HDMECs

  1. Un giorno prima di iniziare le culture di bioreattore, tagliare aperto BioVaSc (il biomatrice) longitudinalmente sul lato antimesenteric e risolvere il problema in una cornice in policarbonato precedentemente disinfettato (Vedi Figura 3A, B).
    Nota: Il BioVaSc è una biomatrice ottenuti da un segmento di decellularizzazione digiunale porcina, preparato come precedentemente pubblicato21.
    Nota: come il telaio in policarbonato non può essere sterilizzato con il calore, disinfettarlo di incubazione di 20 min in bagno ad ultrasuoni (40KHz) seguita da incubazione 3 volte in etanolo al 70% per 25 min. Poi, lavare il telaio 3 volte con DPBS sterile.
    1. Posizionare il sistema biomatrice-frame in un 100mm di Petri e riempirlo con il fattore di crescita endoteliale vascolare + 1% penicillina streptomicina (Pen/Strep).
    2. Equilibrare il biomatrice incubando una notte a 37 ° C e 5% CO2.
  2. Dopo lo scollegamento e il conteggio delle cellule, iniettare 10 x 107 HDMECs a 1000 µ l di terreno di coltura attraverso il sistema vascolare conservato della stessa, con l'uso di una siringa da 2 mL.
    Nota: Iniettare ~ 700 µ l attraverso l'ingresso arterioso e ~ 300 µ l attraverso lo sbocco della vena.
  3. Incubare a 37 ° C e 5% CO2 per 3 h, per consentire il collegamento delle cellule.
  4. Riempire l'impianto di bioreattore con 350 mL del fattore di crescita endoteliale vascolare + 1% Pen/Strep e incubare a 37 ° C e 5% CO2.
  5. Posizionare il telaio all'interno del recipiente del bioreattore. Collegare i pedicles arteriosi e venosi alla nave.
  6. Avviare l'aspersione collegando il sistema di bioreattore per una pompa peristaltica. Impostare la pressione a 10 ± 1 mmHg e ampiezza.
  7. Aumentare la pressione graduale ogni ora fino a raggiungere 100 mmHg di pressione, ampiezza ± 20.
  8. Mantenere il sistema di bioreattore per 7 giorni in queste Condizioni a 37 ° C e 5% CO2.

6. aggiunta di RFP-HDMECs per il biomatrice

  1. Mix 330 µ l di soluzione di collagene R 0,4%, 170 µ l di acido acetico 0.1% e 50 µ l di medium M199 in un tubo Falcon da 15 mL. Tenere il ghiaccio.
  2. Prendere la RCP microcarriers dai palloni spinner. Rimuovere completamente il terreno di coltura.
  3. Aggiungere il volume di NaOH 0,2 N necessario per neutralizzare la miscela di collagene e miscelare immediatamente con la RCP microcarriers.
  4. Aggiungere la miscela di collagene gel-RCP microcarriers sul lume del biomatrice. Consentire la gelificazione per 30 min.
  5. In parallelo, cambiare il mezzo del bioreattore rimuovendo completamente il mezzo e quindi aggiungere 350 mL di fresco, pre riscaldato, fattore di crescita endoteliale vascolare + 1% Pen/Strep.
  6. Collegare il bioreattore per la pompa peristaltica e impostare la pressione a 100 ± 20 mm Hg e ampiezza.
  7. Modificare il mezzo ogni 7 giorni.
  8. Tenere il bioreattore in cultura per 21 giorni.

7. analisi e letture delle culture di bioreattore

  1. Preparazione dei campioni
    1. Staccare il biomatrice bioreattore e rimuoverlo dal telaio in policarbonato.
    2. Tagliare il pezzo ottenuto in 6 sezioni: 2 MTT, 2 per paraffina incorporamento di colorazione e 2 per analisi SEM.
  2. Inclusione in paraffina
    1. Inserire le sezioni in una capsula di Petri e lavare con abbastanza DPBS per la loro copertura. Scartare il DPBS.
    2. Difficoltà durante la notte le sezioni in paraformaldeide al 4%.
    3. Preparare le cassette per inclusione in paraffina ed eseguire secondo protocolli standard.
    4. Preparare le sezioni in blocchi di paraffina e tagliare campioni di 3 µm per la macchiatura di H & E, con l'uso di un microtomo.
  3. H & E colorazione
    1. Macchia reidratati sezioni secondo protocolli standard32.
  4. Analisi di microscopia elettronica (SEM) a scansione
    1. Inserire le sezioni in una capsula di Petri e lavare con abbastanza DPBS per la loro copertura. Scartare il DPBS.
    2. Fissare le sezioni con glutaraldeide al 4,75% durante la notte.
    3. Eseguire catena di disidratazione con aumento delle concentrazioni di etanolo 50% - 100%.
    4. Coprire le sezioni con esametildisilazano (HMDS) per 10 min. scartare il HMDS usate e aggiungere HMDS fresco.
    5. Consentire le sezioni per asciugare durante la notte sotto cappa e quindi preparare i campioni per l'imaging.
  5. 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromuro (MTT)
    1. Agitare il reagente di MTT con fattore di crescita endoteliale vascolare, in una concentrazione di 1 mg/mL.
    2. Incubare le sezioni nella soluzione MTT per 90 min a 37 ° C e 5% CO2.
    3. Osservare le strutture vascolari delle cellule seminate microcarriers macroscopicamente o sotto un microscopio a campo chiaro, per rilevare cellule metabolicamente attive. Acquisire immagini.

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Representative Results

Come mostrato in Figura 1A, abbiamo ottenuto elevato numero di cellule vitali su microcarriers la RCP dopo 7 giorni di cultura, determinato dalla macchiatura live/dead. Tali risultati sono stati confermati da analisi di SEM, in cui sono stati osservati microcarriers completamente colonizzata intorno i pori, parzialmente surclassando li (Figura 1B). D'altra parte, gli esperimenti in cui le cellule non sono state seminate in modo uniforme ha provocato parecchi microcarriers vuota. Esperimenti falliti sono caratterizzati da un numero anormalmente elevato di cellule morte che non dovrebbe essere oltre 10% dell'importo totale delle cellule (Figura 1). Inoltre, contenuto quantificazione del DNA di HDMECs ha mostrato un aumento di dsDNA nel tempo (Figura 1).

Inoltre, RFP-HDMECs sono stati in grado di mantenere la loro funzionalità dopo cultura su microcarriers RCP, come illustrato nella Figura 2, dove le cellule adottato un fenotipo germogliatura quando coltivate in un gel di collagene.

Inoltre, abbiamo usato RFP-HDMECs-colonizzato RCP microcarriers per reseeding lumen della biomatrice BioVaSc. Per questo, abbiamo impiegato un sistema di bioreattore per aspersione fisiologica del tessuto vascolarizzato equivalenti22 (Figura 3) in cui abbiamo tagliato aperto il biomatrice e lo mise in una cornice di policarbonato, così che il lume è stato esposto in un (anche set-up Figura 3B).

Dopo 21 giorni di culture di bioreattore, cellule metabolicamente attive erano presenti sia sul sistema vascolare conservato del biomatrice così come su microcarriers la RCP (Figura 4A e Figura 3B). Esperimenti falliti o una scelta sbagliata delle fette durante il sezionamento dei campioni istologici può portare all'assenza di colonizzare le cellule endoteliali nel lume dei vasi del biomatrice o sul microcarriers. Questi risultati potrebbero essere confermati da analisi SEM delle sezioni biomatrice, dove potrebbe essere osservato che alcune zone della RCP microcarriers erano ancora coperti dalle cellule e che la RCP microcarriers erano nella prossimità vicina alla biomatrice (Figura 4 e 4D).

Infine, macchiatura di H & E ha confermato la presenza di HDMECs sulla stessa, in particolare le strutture vascolari (Figura 5A). Quando osservate al microscopio a fluorescenza, le cellule colonizzando le strutture vascolari del biomatrice ha portato ad per essere RFP-HDMECs (figura 5B), che indica la migrazione delle cellule da microcarriers la RCP per la stessa. Alcuni RFP-HDMECs inoltre sono stati osservati sul microcarriers RCP (Figura 5 e 5D). Negli esperimenti in cui cellule ha fatto non è sopravvissuto dovuto alterato coltura condizioni (ad es. tempi di cultura più brevi), potrebbe non essere rilevati all'interno della struttura vascolare con nessuna delle tecniche precedentemente segnalate (Figura 5E e 5F ).

Figure 1
Figura 1: cultura di HDMECs e hBMSCs su RCP microcarriers. (A, C) live/dead colorazione dopo 7 giorni di culture dinamiche. (B) analisi SEM di HDMECs coltivati su microcarriers RCP dopo 7 giorni di culture dinamiche. (D) DNA contenuto determinato dal kit di test di PicoGreen. I dati espressi come media ± deviazione standard (n = 3). Scala bar: 200 µm per la A, 88 µm per B e 100 µm per C. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: analisi di germogliatura. Germogli di RFP-HDMECs possono essere osservati in campo chiaro (A) e fluorescenza microscopia (B), emergenti dalla microcarrier RCP colonizzate dopo 24 h di cultura in un gel di collagene. (C) immagine di sovrapposizione. Scala bar: 100 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: set-up biomatrice e bioreattore. (A) preparazione della biomatrice e montaggio sul telaio in policarbonato (B). Set-up di bioreattore (C) . La nave è collegata al bacino medio e la bottiglia di pressione attraverso tubicini di silicone, e l'intero sistema è collegato ad una pompa peristaltica. La pressione viene misurata tramite un sensore di pressione. AI: ingresso arterioso; VO: uscita venosa. Questa figura è stata modificata da Groeber et al. 22 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: lettura di bioreattore. Analisi di MTT effettuato su una sezione biomatrice dopo 21 giorni di cultura, in cui cellule metabolicamente attive sono state osservate nel vasculature conservato biomatrice (A) , così come il microcarriers RCP (B). (C, D) Immagini di SEM di RCP microcarriers su una sezione biomatrice. Scala bar: 0,28 cm per A, 0,45 cm per B, 47 µm per C e 225 µm per D. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: immagini di macchiatura & fluorescenza H & E. (A, C, E) H & E colorazione. (B, D, F) Dopo 21 giorni di cultura, RFP-HDMECs sono stati osservati all'interno del vasculature biomatrice (frecce), così come la RCP microcarriers (teste di freccia). Scala bar: 50 µm per A-D e 30 µm per E e F. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Uno degli obiettivi principale di microcarrier è l'espansione di cellule pur mantenendo la loro differenziazione al fine di fornire le cellule al posto del bisogno. Il metodo rappresentato introdurre RCP microcarriers dove le cellule erano in grado di allegare, proliferare e colonizzare il microcarriers con densità elevata delle cellule. Ciò è stata osservata da live/dead colorazione, in cui oltre il 90% delle cellule vitali sono stati rilevati mentre solo poche cellule morte sono state ottenute dopo 7 giorni di culture dinamiche. Allo stesso modo, le immagini di SEM ha confermato che le cellule coperto l'intera superficie della microcarriers dopo 7 giorni di culture.

Per garantire la sopravvivenza delle cellule in modelli 3D, è importante mantenere il rifornimento di ossigeno e sostanze nutritive alle cellule e permette la rimozione di sostanze di scarto. Vasi sanguigni sono le strutture responsabili di questo processo di scambio, in cui le cellule endoteliali giocano un ruolo chiave dal momento che sono le cellule che rivestono la parte interna dei vasi sanguigni23. Essi hanno la capacità di proliferare, migrare, aderire, germoglio e formare la nave-come le strutture24. Queste proprietà sono state effettuate dopo cultura di RFP-HDMECs su microcarriers la RCP, poiché è stato osservato che le cellule erano in grado di adottare il fenotipo germogliatura (Vedi Figura 2). Qui potremmo dimostrare che questi colonizzate microcarriers RCP sono stati efficacemente consegnando cellule endoteliali primarie per reseeding il lume dell'ex navi della biomatrice BioVaSc. Ciò suggerisce il nostro sistema per essere adatti a migliorare la vascolarizzazione degli innesti di tessuti ingegnerizzati per applicazioni cliniche. Derivati di questa matrice sono stati utilizzati con successo nella vascolarizzazione approcci25, come pure del tumore in vitro test sytems21,26,27,28 e per la produzione di equivalenti di pelle come alternative alla sperimentazione animale29. Qui è usato in modo aperto, appiattito set-up e collocato in un bioreattore di aspersione come applicato per la generazione di tessuto equivalenti22.

Bioreattori sono stati utilizzati in ingegneria tissutale per produrre gli equivalenti di tessuto che potrebbero contribuire a facilitare la domanda di organi, riducendo i rischi associati come rifiuto e morbosità30. Tuttavia, produrre costrutti simili a tessuto è un processo molto complesso che implica l'uso di tipi delle cellule tessuto-specifica, un'impalcatura adatta e appropriati fattori di crescita che consentono la corretta differenziazione e assemblaggio nei tessuti 3D. Uno svantaggio importante di costrutti ingegnerizzati è la mancanza di un'adeguata rete vascolare che supporta la sopravvivenza di cellule sia in vitro che in vivo17. Qui combiniamo il microcarriers RCP-colonizzato con una matrice decellularizzata in un modello di bioreattore, fornendo il tipo di cella necessario, un'impalcatura che permette l'adesione delle cellule e la formazione del vaso e un terreno di coltura specifico che fornisce i fattori essenziali per le cellule di proliferare e mantengono le loro proprietà funzionali. Un risultato significativo di questo modello è la possibilità dell'HDMECs di migrare dalla RCP microcarriers al patibolo senza ulteriore distacco o la digestione come necessario in altri approcci31. In seguito, hanno colonizzato in particolare le strutture vascolari della matrice, dimostrando il concetto che macroporosa microcarriers utilizzabile come sistema di consegna delle cellule per scopi di medicina rigenerativa.

Complessivamente, questo protocollo rappresenta una strategia promettente in medicina rigenerativa per l'ottenimento di un'espansione di cellule ingrandita e potrebbe servire come consegna di cella per siti di impianto, dove si potrebbe migliorare il supporto di vascolarizzazione per innesti di tessuti ingegnerizzati.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

La ricerca che porta a questi risultati ha ricevuto finanziamenti dall'Unione europea settimo quadro programma FP7/2007-2013 sotto accordo di finanziamento n ° 607051 (BIO-ispirare). Ringraziamo Carolien van Spreuwel-Goossens da Fujifilm Manufacturing Europe B.V., per l'assistenza tecnica durante la produzione di RCP e Werner Stracke dall'Istituto Fraunhofer per silicato ricerca ISC, per assistenza con l'analisi di SEM.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide (MTT) Serva Electrophoresis GmbH 20395.01
4’,6-Diamidino-2-phenylindoldihydrochloride (DAPI) Sigma-Aldrich D9542
Acetic acid 100% Sigma-Aldrich 533,001
Analytical balance Kern EG 2200-2NM Kern & Sohn GmbH
Ascorbate-2-phosphate Sigma-Aldrich A8960
Bioreactor Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Wuerzburg, Germany
Bright field microscope Axiovert 40C Carl Zeiss AG
Cellnest Fujifilm
Centrifuge tubes (15 mL, 50 mL) Greiner Bio-One
Collagen R solution 0,4% Serva Electrophoresis GmbH 47254.01
DMEM-F12 Gibco 11320-033
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich D8537 Modified, without calcium chloride and magnesium chloride
Eosin 1% Morphisto 10177.01000
Ethanol 96% Carl Roth GmbH T171.4 Denatured
Fetal calf serum (FCS) Bio&SELL FCS.ADD.0500 not heat-inactivated
Fluorescence microscope BZ-9000 Keyence
Haematoxylin Morphisto 10231.01000
Hexamethyldisilazane Sigma-Aldrich 440191 Reagent grade, ≥99%
Incubator for bioreactor Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Wuerzburg, Germany
Live/Dead Cell Double Staining Kit Fluka 04511KT-F
Magnetic stirrer plate 2Mag 80002
Medium 199 Sigma-Aldrich M0650 10X
Microplate reader
Tecan Infinite M200		 Tecan
Needle 21G 16mm VWR 613-5389
Papain from papaya latex Sigma-Aldrich P4762 lyophilized powder, ≥ 10 units/mg protein
Paraffin Carl Roth GmbH 6642.6
Penicillin/Streptomycin Sigma-Aldrich P4333
Peristaltic pump Ismatec
Quanti-iT PicoGreen dsDNA assay kit Thermo Fischer Scientific P7589
Histofix 4% Carl Roth GmbH P087
Scanning Electron Microscope Supra 25 Carl Zeiss AG
Sodium hydroxide solution 1.0 N Sigma-Aldrich S2770
Spinner flasks (25 mL) Wheaton 356879
Syringe 1 mL VWR 720-2561
Tissue culture flasks (25 cm2, 75 cm2, 150 cm2) TPP Techno Plastik Products AG
Trypan blue 0.4% Sigma-Aldrich T8154
VascuLife VEGF-Mv Lifeline cell technology LL-0005

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References

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