Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Rekombinant kolajen peptid Microcarriers hücre genişletme ve hücre teslim sistemi bir biyoreaktör olarak potansiyel kullanım için ben Model

Published: February 7, 2018 doi: 10.3791/57363
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 3, 1,2
1Department Tissue Engineering and Regenerative Medicine, University Hospital Wuerzburg, 2Translational Center Regenerative Therapies (TLC-RT), Fraunhofer Institute for Silicate Research ISC, 3Fujifilm Manufacturing Europe B.V.

Summary

Biz macroporous microcarriers bir hücre genişletme protokolü ve kullanımları decellularized doku matris temel için bir perfüzyon biyoreaktör teslim sistemi olarak öneriyoruz. Biz de hücre çoğalması ve canlılığı üzerinde microcarriers kültürlü hücre belirlemek için farklı teknikler içerir. Ayrıca, biyoreaktör kültürler sonra hücreleri işlevselliğini göstermektedir.

Abstract

Doku Mühendisliği için artan talep üzerine doku ve organ nakli amacıyla ilgili çözümler geliştirilmesi üzerinde duruldu gelecek vaat eden bir alandır. Böyle dokular oluşturmak için işlemi karmaşıktır ve belirli hücre tipleri, iskele ve hücre büyüme ve farklılaşma rehberlik için fiziksel ve biyokimyasal uyaranlara uygun bir kombinasyonunu içerir. Microcarriers beri onlar daha yüksek yüzey-hacim oranları sağlamak ve daha yakından geleneksel iki boyutlu yöntemlerine göre vivo içinde durum taklit bir üç boyutlu (3D) microenvironment hücrelerde genişletmek için çekici bir araç temsil eder. Ne zaman üreten dokuları mühendislik damar sistemi, oksijen ve besin hücrelere temini ve atık kaldırma, sağlanması önemli bir yapı taşı kabul ettiğiniz anlamına gelir. Aslında, çoğu yapıları sonra implante vasküler desteği eksik nedeniyle başarısız. Bu çalışmada, ve biz rekombinant kollajen tabanlı microcarriers spinner şişesi ve Biyoreaktörler dinamik koşullar altında bir protokol endotel hücre genişletme için mevcut bu ayarı hücre canlılığı ve işlevselliği seçileceğinin nasıl belirlendiği açıklanmaktadır. Buna ek olarak, gerekli ek dekolmanı adımları olmadan vaskülarizasyon amacıyla hücre teslimat için bir yöntem öneriyorum. Ayrıca, hücre vaskülarizasyon perfüzyon biyoreaktör decellularized biyolojik matris üzerinde potansiyel değerlendirmek için bir stratejisi sağlayabilir. Biz sunulan yöntemleri için doku mühendisliği uygulamaları klinik pratikte çok sayıda yeni hücre tabanlı terapiler gelişmesine neden olabilir inanıyoruz.

Introduction

Doku Mühendisliği uygulamalarında bir genel sorun bulunduğu konumda doğru farklılaşma fenotip ile yüksek hücre kütlesi verim için ihtiyaç vardır. Bu sorunu gidermek için microcarriers uygulanması ile deri, kemik, kıkırdak ve tendon1büyük ölçekli üretimi için ortopedik doku Mühendisliği gibi alanlara bugüne önemi artan 1967 yılında başladı. Yapisan kültürler işlenmesi şekillerde süspansiyon kültürler2 benzer hücreler microscale üç boyutlu (3D) yüzeyler üzerinde genişleterek sağlarlar. Böylece hücreleri homojen bir besin kaynağı ve hücre-matris etkileşimleri kurşun kez 2D zamanla kaybolur vivo içinde3,4 farklılaşma daha iyi bakım için5yaklaşımlar deneyim. Bir daha yüksek yüzey hacim oranı - sonunda lider daha yüksek verimleri6,7hücre, daha yüksek gaz ve besin döviz kurlarını statik sistemleri8, düzenleyen ve kültür için fiziksel konu imkanı karşılaştırarak daha fazla bir çekim gücü9ve genişleme süreci7 / yükseltme için potansiyel avantajları vardır. Çapı, yoğunluk, gözeneklilik, yüzey ücret ve yapışma özelliklerini10,11 gibi bazı özellikler farklı piyasada bulunan mikro - ve makro-taşıyıcıları ayırt. Ancak, ana avantaj onların teslim microtissues potansiyel sitesi kusur veya isteğe bağlı biridir.

Microcarrier teknoloji kemik doku mühendisliği uygulamaları için üretimi bir önceki rapor12 ' resimli yeni bir microcarrier türü oluşturmuştur rekombinant kollajen ben peptid (RCP, Cellnest piyasada bulunan). Bu yeni microcarrier GMP iskele ve hücre üretimi, ölçekleme kadar uyumlu cep teslim klinik senaryosunda için gerektiği gibi sağlar. Bu bağlamda, iskele istikrar, bozulma hızı ve yüzey özellikleri uygun crosslinking strateji uygun seçim yoluyla ayarlama, faiz türü hücre veya doku13hedef seçilen uygulama için teknik uyum sağlar. Özellikle, bu microcarrier olası istihdam enjekte edilebilir hücre teslim sistemi tedavi uygulama14 olarak onları özellikle ilginç bir klinik ortamda yapar.

Bu yazıda, bu nedenle kodlamayla için prosedür yalıtım ve genişlemesi insan kemik iliği elde edilen Mezenkimal stromal hücreler (hBMSCs) ve insan dermal mikrovasküler endotel hücreleri (HDMECs) kolajen-ben-merkezli rekombinant üzerinde göstermek peptid tabanlı microcarriers ve onların Hazırlık'dır bir klinik ortamda. Ayrıca, ek protokoller hücre canlılığı implantasyon üzerine bakımı için yararlı açıklar.

Hücre canlılığı implantasyonu sonrası aslında oksijen ve besin alışverişini sağlar ve atık kaldırma kolaylaştıran vaskülarizasyon15,16,17, kuvvetle bağlıdır. Biyoreaktörler doku Mühendisliği yapılan vaskülarizasyon zorlukların üstesinden ve perfüzyon kültür böylece oksijen ve besin18sağlayan orta aracılığıyla hücre canlılığı korumak için bir yaklaşım teşkil. Burada, biz RCP microcarriers mikrovasküler endotel hücrelerden bir biomatrix ve yeteneklerini de novo vaskülarizasyon ve anjiogenezi katkıda bulunmak için geçiş yeteneği değerlendirmek için bir vitro yöntemi göstermektedir. Domuz değişir decellularized bir parçasını BioVaSc (biyolojik skarların iskele) kolajen ve elastin açısından zengin olarak adlandırdığı ve besleme arter içeren vasküler yapılar ve olmuştur boşaltma bir damar19 ile korunmuştur bu biomatrix olduğunu implantasyon sorunları20için uygulanan.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

hBMSCs femur başı protezi ameliyatı geçiren osteoartrit hastalarının uyluk başından izole edildi. Yordamı Wuerzburg Üniversitesi yerel Etik Komitesi ve aydınlatılmış onam hasta onay altında gerçekleştirildi. Birincil mikrovasküler endotel hücreleri Juvenil bağış sünnet derisi biyopsi izole edildi. Onların yasal representative(s) tam aydınlatılmış onam yazılı olarak sağlanan. Çalışma Wuerzburg Üniversitesi (oy 182/10) yerel Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır.

1. yalıtım hBMSCs ve HDMECs

  1. İnsan kemik iliği elde edilen Mezenkimal stromal hücreler (hBMSCs)
    1. Süngerimsi Kemik uyluk başından steril bir kaşık kullanarak kaldırın.
      Not: Süngerimsi Kemik sert ve katı kortikal kemik içinde gevşek ve taneli bir madde olarak görünür. Bir neşter kullanarak kortikal kemikten sıfırdan Süngerimsi Kemik parçaları için gerekebilir.
    2. Kaldırılan Süngerimsi Kemik içinde iki 50 mL tüp takın. Süngerimsi Kemik hacmi 5 ila 10 mL kaldırılan femur başının boyut göre kalça protezi ameliyatı sırasında değişebilir.
    3. Yıkama ile DMEM-F12 (DMEM ve Ham F12 orta 1:1 karışımı), yaklaşık 30 mL orta ile tüp doldurma.
    4. Tüp el ile 5 için boyuna bir şekilde sallamak Süngerimsi Kemik yağ hücreleri izin için s. Santrifüj 300 x g ve 22 ° C 5 min için.
    5. Mezun olunan bir plastik pipet, yağ hücre katmanı ve kalan süpernatant yaklaşık 20 mL ile Aspire edin. Süngerimsi Kemik karşılamak için yeterli orta izin.
    6. DMEM-F12 ile 10 ml tüpler doldurulması ve boyuna el, 10-15 s, hücreleri çıkmama izin için tarafından şiddetle çalkalanır.
    7. Hücre süspansiyon dereceli plastik pipet ile 10-15 mL tüpler yeni bir 50 mL tüp aktarın.
    8. 2 - 3 kez 50 mL tüp içinde toplanan Süngerimsi Kemik beyaz olana birlikte elde edilen hücre süspansiyon Havuzu 1.1.6 adımları yineleyin.
    9. Mezun olunan bir plastik pipet ile hücre süspansiyon 50 mL tüpler dibinde biriken kollajen Pelet aspirating kaçınarak, iki yeni tüp aktarın.
    10. 5 dakika süreyle santrifüj 300 x g ve 22 ° C hücre süspansiyon süpernatant atmak bir mezun plastik pipet ile aspirating tarafından.
    11. DMEM-F12% 10 FCS % 1 kalem/Strep 50 µg/mL askorbat-2-fosfat 40 mL üçüncü bir tüp içinde ekleyin. Bu orta 5 mL hücre Pelet içeren her tüpün aktarın. Hücre topakları tüpler alt şiddetle titreşen tarafından yeniden askıya alma ve hücre süspansiyonlar tek orta içeren tüp aktarın.
    12. İsteğe bağlı: hücre süspansiyon Hücre sayımı için 100 µL sulandırmak, PBS ve sonra 1:10 trypan mavi, ilk 1: 100 DPBS 15 µL ve 30 µL ilk seyreltme 15 µL ekleyerek sulandrarak Trypan mavi bir DPBS elde etmek için: Trypan mavi oranı 1:1. Standart Neubauer odası içeren hücreleri saymak.
    13. 109 hücre/175 cm2 T-Flask'de orta 25 mL hücreleri 1.1.11 içinde açıklandığı gibi tohum. Alternatif olarak, en çok on 175 cm2 hücre kültür şişeler bütün hücre süspansiyon sayma olmadan bölün. Bu aşamada, hBMSCs büyük ölçüde onları sayıca üstün eritrositler fark edilebilir değildir. hBMSCs seyrek koloniler görünecektir (1-2/şişesi) ilk 7 gün boyunca.
    14. Orta hBMSCs kan hücrelerinin etkileşime izin vermek için tohum dan 4 gün sonra değiştirin. İlk orta değişiminden sonra orta 2-3 günde değiştirin. Tamamen kültür orta dereceli plastik pipet ile (tarafından DPBS 10 mL yapisan hücrelere ekleme ve tamamen DPBS bir mezun plastik pipet ile kaldırma) ile DPBS iki kez yıkama kaldırıp sonra 20 mL ekleyerek medyası takası yapmak 1.1.11 açıklandığı gibi taze orta.
  2. İnsan dermal mikrovasküler endotel hücreleri (HDMECs)
    1. Cilt biyopsileri tedavi ve HDMECs göre daha önce yayımlanmış protokolleri21yalıtır. Kısaca, DermIS epidermis den ayrılıktan sonra 40 dk. 37 ° C ve % 5 CO2için tripsin dermiste kuluçkaya. Kuluçka süresi sonra dermis kültür ortamı içeren bir Petri kabına aktarmak ve her parça bir neşter kullanımı ile sıfırdan. 50 mL plastik tüp ve santrifüj vasıl 300 g ile 22 ° c x 5 min için elde edilen hücre süspansiyon transfer 1.2 x 104 hücreleri/cm2yoğunluğu, bir Neubauer odası ve tohum kullanarak hücre süspansiyon saymak. Orta tamamen her gün değiştirin.

2. Kurulum ve sterilizasyon spinner şişeler, RCP microcarriers ve biyoreaktör

  1. Spinner şişeler ve RCP microcarriers
    1. Bir gün önce deneyler, set-up döner düðmeyi şişeler ve onları otoklav tarafından sterilizasyon için hazırlamak.
      Not: spinner Şişe kapakları gevşek bırakın ve mümkün olduğunda, onları dik bir pozisyonda sterilize.
      1. Spinner şişeler yan kapaklar çevresinde alüminyum folyo ile ayrı ayrı unwrapping sırasında kirlenmesini önlemek için sarın. Sterilizasyon sonra kirlenme riskleri en aza indirmek için şişeler 1-2 katmanları ısıyla için alüminyum folyo ile sarın.
    2. RCP macroporous microcarriers gerekli miktarda DPBS 20 mL tartın.
      Not: 30 mg spinner şişesi gereklidir. Onlara daha önce ısı sterilizasyon basınçlı kap (15dk için 121 ° C) tarafından en az 1 h için hidrat.
  2. Perfüzyon biyoreaktör
    1. Bozukluklarına doku eşdeğerleri20üretmek için tanımlanan biyoreaktör sistemini kullanın. Bu biyoreaktör biomatrix yerleştirildiği bir gemi orta boy bir rezervuar ve basınç şişe oluşur.
      1. Geminin orta rezervuar ve basınç şişe (bkz. şekil 3 c) silikon tüpler aracılığıyla bağlantı kurun. Kapaklar gevşek bırakın ve bir basınçlı kap plastik torbaya koyun, Evet kapatın ve bu bir ikinci basınçlı kap plastik torbaya koyun. Otoklav tarafından sterilize.

3. hBMSCs ve HDMECs RCP macroporous microcarriers Tarih kültür

Not: RCP microcarriers tohum için kullanılan HDMECs tarafından lentiviral iletim RFP ile Etiketlenmiş. Bu iletişim kuralı daha önce yayımlanmış protokolü5sonra güncellenmiştir.

  1. Microcarriers altına yerleşmek ve kültür orta 10 mL ile yıkayın RCP macroporous izin ver. 3 kez tekrarlayın.
  2. Spinner şişeler kültür ortamının 10 mL ile yıkayın.
  3. 30 mg başına spinner flask RCP macroporous microcarriers kültür Orta 8 mL ekleyin. Hücreleri tohum daha önce 37 ° C ve % 5 CO2 30 dk, RCP microcarriers içeren spinner şişeler equilibrate.
    Not: Bu kuru ağırlığının yaklaşık RCP microcarriers sterilizasyon önce temel alır.
  4. Tohum 5 x 105 hBMSCs veya HDMECs 2 mL kültür ortamının spinner şişeye (Bölüm 3).
  5. Spinner şişeler karıştırıcı plaka ve 5 min için 90 devir/dakika ve 37 ° C ve % 5 CO2, 1 h statik/dinamik kuluçka olmak üzere toplam 55 dk. boyunca karıştırma başlangıç üzerine koyun. 4 kere tekrar edin.
  6. Hücre kültür orta spinner şişe başına 10 mL ekleyin ve karıştırarak 95 devir / dakikada sürekli başlatın. 37 ° C ve % 5 CO2kuluçkaya.
  7. Bir micropipette kullanımı ile örnekleri gün 1, 4 ve 7:333 µL DNA örneği almak için içeriği almak (~ 0.5 mg), 1000 µL SEM analiz için (~ 1,5 mg) ve canlı/ölü boyama için 333 µL (~ 0.5 mg).
    Not: Bu kuru ağırlığının yaklaşık RCP microcarriers sterilizasyon önce temel alır.
  8. 10 mL kültür ortamının her gün değiştirin. Bunun için beklemek RCP microcarriers altına yerleşmek ve çok dikkatli bir şekilde 10 mL spinner şişeye 10 mL pipet kullanımı ile gelen Aspire edin ve 10 mL taze kültür ortamının ekleyin.
  9. Kültürler 95 rpm'de 37 ° C ve % 5 CO2 7 gün için ayarlamak karıştırıcı plaka üzerinde tutun.

4. DNA içeriği, SEM analizi, canlı ölü boyama ve tahlil çimlenme

  1. DNA içeriği
    1. Bir micropipette kullanımı ile microcarriers yaklaşık 0.5 mg 2 ml plastik tüp her spinner şişesi (süspansiyon 333 µL içinde yer alan) ve transfer toplamak.
      Not: Bu kuru ağırlığının yaklaşık RCP microcarriers sterilizasyon önce temel alır.
    2. Bir kez DPBS 1 mL ile yıkayın, sonra süpernatant Aspire edin.
    3. DPBS bir lyophilizer içinde kalan kaldırmak ve daha sonra normalleştirme için lyophilized microcarriers ağırlık.
    4. Örnekleri için en az 6 h-80 ° C'de dondurmak.
    5. Örnekleri gecede 300 µL papain 5 ile 60 ° C'de kuluçkaya U/mL.
    6. (Örneğin, PicoGreen dsDNA tahlil) Nefelometri testin manufacturer´s talimatları uygun titrasyon eğrileri kiti ve ölçüm 520, floresan sinyal gerçekleştirmek kurmak bir ışıldama detektörlü nm.
  2. Tarama elektron mikroskobu (SEM) analiz
    1. CA. microcarriers 1 mg 2 mL plastik tüp her spinner şişesi ve transfer toplamak.
    2. Microcarriers kez DPBS 1 mL ile yıkayın.
    3. DPBS çıkarın ve 1 ml % 70 etanol 1 h için kuluçkaya.
    4. Süpernatant çıkarın ve 1 ml % 80 etanol 1 h için kuluçkaya.
    5. Süpernatant çıkarın ve 1 ml % 90 etanol 1 h için kuluçkaya.
    6. Süpernatant çıkarın ve 1 ml % 100 etanol 1 h için kuluçkaya.
    7. 1 ml hexamethyldisilazane 10 dk için kuluçkaya ve süpernatant çıkarın.
    8. Kapağı aç ve örnekleri kuru gecede bir kimyasal başlık altında izin ver.
    9. Düzeltme örneklere uygun destek ve SEM analizine göre kurulan iletişim kuralları için devam edin.
  3. DAPI ve canlı/ölü boyama
    1. 2, 4 ve 7 gün sonra microcarriers üzerinde tohum hücre microcarriers 0,5 mg 2 mL plastik tüp her spinner şişesi ve transfer toplamak. Bir kez DPBS 1 mL ile yıkayın.
    2. DAPI
      1. Örnekleri 10 min için onları karşılamak için yeterli %4 paraformaldehyde saptamak.
      2. Bir kez DPBS 1 mL ile yıkayın.
      3. Sallanan bir shaker üzerinde 45 dk için boyama çözüm ile oda sıcaklığında kuluçkaya.
      4. 420 nm emisyon filtre ile floresan mikroskop DAPI floresan sinyali algılamak ve görüntüleri.
    3. Canlı/ölü boyama
      1. Canlı/ölü boya çözeltinin 500 µL örneklerinde kuluçkaya. 20 dk, ışıktan korunan için 37 ° C'de örnekleri tutmak.
      2. Bir kez DPBS 1 mL ile yıkayın.
      3. Floresans sinyal 490 nm emisyon filtre ile canlı hücreler ve ölü hücreleri floresan mikroskop 545 nm emisyon filtre ile tespit. Görüntüleri elde etmek.
    4. Tahlil için HDMECs çimlenme
      1. Mix 330 µL kollajen R çözüm %0,4, 170 µL % 0,1 Asetik asit ve orta M199 15 mL plastik tüp içinde 50 µL. Buz üstünde tutun.
      2. Microcarriers (250 µL) ~0.375 mg bir micropipette kullanımı ile alın. 1.5 mL plastik tüp transferi, RCP microcarriers altına yerleşmek ve orta tamamen kaldırmak bekle.
        Not: Bu kuru ağırlığının yaklaşık RCP microcarriers sterilizasyon önce temel alır.
      3. Kollajen karışımı etkisiz hale getirmek ve hemen RCP microcarriers ile karıştırmak için gereken birim 0,2 N NaOH ekleyin.
        Not: 0,2 N NaOH gerekli miktarı önceden bu karışıma pH değişikliği kadar ekleyerek belirlemek (sarı renk açmak pembe) ve sonra 1 dakika sonra bir jel gerekir kuruldu, kuluçka karışımı yerleştirerek.
      4. Kollajen jel-RCP microcarriers karışım bir iyi bir 24-şey plaka plaka. 37 ° C ve % 5 CO2 30 dk için kuluçkaya.
      5. Vasküler endotelyal büyüme faktörü (örneğin, VascuLife VEGF-Mv kültür orta) 200 µL ekleyin. 37 ° C ve 24 saat için % 5 CO2 kuluçkaya.
      6. Bir 10 X büyütme nesne, kullanarak inversed faz kontrast mikroskop altında gözlemlemek ve görüntüleri.

5. Biomatrix tohum ve biyoreaktör sistem başlangıcı HDMECs için

  1. Biyoreaktör kültürler, başlamadan önce bir gün açık BioVaSc (biomatrix) kesme boyuna antimesenteric tarafında ve daha önce dezenfekte polikarbonat çerçevede tamir (bkz. şekil 3A, B).
    Not: BioVaSc Yayınlanan21olarak önceden hazırlanmış bir decellularized domuz jejunal segment elde edilen bir biomatrix var.
    Polikarbonat çerçeve ısı ile sterilize gibi Not: 20 min kuluçka sonic Bath (40 kHz) 3 kez kuluçka etanol %70 25 dk ardından tarafından dezenfekte. Sonra 3 kez ile DPBS çerçeve steril yıkayın.
    1. Biomatrix-frame sistem bir 100 mm Petri kabına koyun ve vasküler endotelyal büyüme faktörü + % 1 ile doldurun penisilin streptomisin (kalem/Strep).
    2. Biomatrix gecede 37 ° C ve % 5 CO2kuluçka tarafından equilibrate.
  2. Ayırma ve hücre sayım sonra 10 x 107 HDMECs ' 1000 µL kültür orta biomatrix korunmuş damarlara aracılığıyla 2 mL şırınga kullanımı ile enjekte et.
    Not: ~ 700 µL arteriyel koya aracılığıyla ve ~ 300 µL ven çıkış yoluyla enjekte.
  3. 37 ° C ve %5 CO2 3 h için hücre ek izin vermek için kuluçkaya.
  4. Biyoreaktör sistem vasküler endotelyal büyüme faktörü + %1 350 mL ile doldurulması kalem/Strep ve 37 ° C ve % 5 CO2kuluçkaya.
  5. Çerçeve biyoreaktör damar yerleştirin. Arteryel ve venöz vertebral gemi bağlayın.
  6. Perfüzyon Peristaltik pompa için biyoreaktör sistem bağlayarak başlayın. Basıncı 10 mmHg ve genlik ±1 ayarlayın.
  7. Kademeli basınç her saat baskı, genlik 20 100 mmHg ulaşan kadar artırın.
  8. 37 ° C ve % 5 CO2' de bu koşullar altında 7 gün için almak belgili tanımlık biyoreaktör sistem.

6. ek RFP-HDMECs biomatrix için

  1. 330 µL % 0,4 kollajen R çözüm, 170 µL % 0,1 Asetik asit ve orta M199 15 ml Falcon tüp 50 µL karıştırın. Buz üstünde tutun.
  2. RCP microcarriers spinner şişeler alın. Kültür orta tamamen kaldırın.
  3. Kollajen karışımı etkisiz hale getirmek ve hemen RCP microcarriers ile karıştırmak için gereken birim 0,2 N NaOH ekleyin.
  4. Kollajen jel-RCP microcarriers karışımı biomatrix Lümen ekleyin. Jelleşme 30 dk için izin.
  5. Paralel, orta tamamen kaldırarak biyoreaktör orta değiştirin ve sonra 350 mL taze, öncesi ısındı, vasküler endotelyal büyüme faktörü + %1 ekleyin kalem/Strep.
  6. Biyoreaktör Peristaltik pompa bağlamak ve 100 mmHg ve genlik 20 basınçta kurun.
  7. Orta her 7 günde değiştirin.
  8. Biyoreaktör kültüründe 21 gün boyunca tutun.

7. analiz ve biyoreaktör kültürlerin okuma

  1. Örnekleri hazırlanması
    1. Biyoreaktör biomatrix kesin ve Polikarbonat çerçevesinden kaldırın.
    2. 6 bölüme alınan parça kesme: 2 için MTT, parafin katıştırma/boyama için 2 ve 2 SEM analiz için.
  2. Parafin katıştırma
    1. Bölümleri bir Petri kabına yerleştirin ve onları karşılamak için yeterli DPBS ile yıkayın. DPBS atın.
    2. %4 paraformaldehyde bölümlerde gecede düzeltmek.
    3. Parafin gömmek için kasetleri hazırlamak ve standart protokolleri göre gerçekleştirin.
    4. Parafin blok bölümlerde hazırlamak ve H & E boyama, bir microtome ile kullanmak için 3 µm örnekleri kesti.
  3. H & E boyama
    1. Standart protokolleri32göre rehydrated bölümler leke.
  4. Tarama elektron mikroskobu (SEM) analiz
    1. Bölümleri bir Petri kabına yerleştirin ve onları karşılamak için yeterli DPBS ile yıkayın. DPBS atın.
    2. Bölümleri gecede %4,75 oxazolidin ile düzeltmek.
    3. Artan konsantrasyonları etanol % 50-%100 ile su kaybı zinciri gerçekleştirin.
    4. Hexamethyldisilazane (HMDS) bölümlerle 10 dk. atma kullanılan HMDS için kapak ve taze HMDS ekleyin.
    5. Duman başlık altında kuru gecede bölümlerine izin ve sonra örnekleri görüntüleme için hazırlamak.
  5. 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromür (MTT)
    1. MTT reaktif vasküler endotelyal büyüme faktörü, konsantrasyonu 1 mg/mL içinde karıştırın.
    2. 90 dk 37 ° C ve % 5 CO2için MTT çözüm bölümlerde kuluçkaya.
    3. Vasküler yapılar ve hücre tohumlari microcarriers macroscopically veya metabolik olarak aktif hücre algılamak için bir alan parlak mikroskop altında gözlemlemek. Görüntüleri elde etmek.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Şekil 1Aile gösterildiği gibi kültür, canlı/ölü boyama tarafından belirlenen 7 gün sonra hücrelerin RCP microcarriers üzerinde yüksek sayıda elde. Bu sonuçlar SEM analizi, tamamen kolonize microcarriers kısmen onları (şekil 1B) overgrowing gözenekleri gözlendi tarafından teyit edildi. Öte yandan, deneyler hangi hücreleri değil eşit numaralı seribaşı birkaç boş microcarriers sonuçlandı. Başarısız deneyler üzerinde toplam hücresini tutarı (şekil 1 c) yüzde 10'u olmamalıdır ölü hücreleri anormal derecede yüksek bir sayı tarafından karakterize edilmektedir. Ayrıca, HDMECs DNA içerik miktar dsDNA (şekil 1 d) zamanla artış gösterdi.

Ayrıca, RFP-HDMECs Şekil 2. nerede ne zaman bir kollajen jel kültürlü filizlenen bir fenotip hücreleri kabul, gösterildiği gibi kültür RCP microcarriers, sonra işlevselliğini korumak başardık.

Ayrıca, RFP HDMECs kolonize RCP microcarriers biomatrix BioVaSc Lümen yeniden sağlamak için kullanılır. Lümen maruz kalmış bir bile set-up (böylece bunun için bir biyoreaktör sistemi içinde kesme-biomatrix açık ve Polikarbonat çerçevede, yerleştirilen bozukluklarına doku eşdeğerleri22 (şekil 3 c) fizyolojik perfüzyon için istihdam Şekil 3B).

Biyoreaktör kültürlerin 21 gün sonra metabolik olarak aktif hücre hem biomatrix korunmuş damarlara yanı sıra RCP microcarriers mevcuttu (şekil 4A ve şekil 3B). Başarısız deneyler veya dilimleri histolojik örnekleri kesit sırasında yanlış bir seçim Lümen damarlarının biomatrix ya da microcarriers endotel hücrelerinde kolonileşmesi olmadığında yol açabilir. Bu sonuçlar SEM analizi nerede o gözlenen RCP microcarriers bazı alanlarda hala hücreleri tarafından kaplıydı ve RCP microcarriers biomatrix yakın olduğunu biomatrix bölümleri tarafından onaylanması (şekil 4 c ve 4 D).

Son olarak, H & E boyama HDMECs varlığı üzerinde özellikle de vasküler yapılar (şekil 5A) biomatrix doğruladı. Floresan mikroskop altında gözlenen zaman, biomatrix vasküler yapılarının kolonileşmesi hücreleri RFP-HDMECs (şekil 5B), RCP microcarriers hücrelerden biomatrix için geçiş gösteren olmak sonuçlandı. Bazı RFP HDMECs da RCP microcarriers (şekil 5C ve 5 D) tespit edildi. Hangi hücreleri nedeniyle değil hayatta koşulları (örneğin daha kısa kültür kere) kültür değişmiş mi deneylerde, onlar daha önce raporlanmış teknikleri (5Fşekil 5E ve hiçbiri ile vasküler yapı içinde tespit edilemedi ).

Figure 1
Şekil 1: HDMECs ve hBMSCs RCP microcarriers üzerinde kültür. (A, C) canlı/7 gün sonra dinamik kültürlerin boyama öldü. (B) SEM RCP microcarriers üzerinde 7 gün sonra dinamik kültürlerin kültürlü HDMECs analizi. (D) DNA içerik PicoGreen tahlil paketi tarafından belirlenir. Ortalama ± standart sapma ifade edilen veri (n = 3). Ölçek çubukları: a 200 µm, 88 µm için B ve c için 100 µm Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: filizlenen tahlil. RFP HDMECs lahanası parlak alan (A) ve floresan mikroskobu (B), kolonize RCP microcarrier bir kollajen jel kültür 24 saat sonra ortaya çıkan altında görülebilir. (C) Görüntü bindirmesi. Ölçek çubukları: 100 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: Biomatrix ve biyoreaktör set-up. (A) biomatrix ve (B)polikarbonat karesinde montaj hazırlanması. (C) biyoreaktör set-up. Geminin orta rezervuar ve basınç şişe silikon tüpler aracılığıyla bağlı olduğu ve tüm sistemi bir Peristaltik pompa bağlı. Basınç basınç sensörü ölçülür. AI: Arteryel giriş; VO: Venöz çıkış. Bu rakam Groeber ve ark. değiştirildi 22 Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: biyoreaktör çıktı. MTT tahlil bir biomatrix Bölüm 21 gün kültür metabolik olarak aktif hücre korunmuş Pres'teki biomatrix (A) yanı sıra RCP microcarriers (B)olarak tespit edildi, sonra gerçekleştirilen. (C, D) RCP microcarriers biomatrix bölümünde SEM görüntüleri. Ölçek çubukları: A, B, c 47 µm ve d için 225 µm 0,45 cm için 0,28 cm Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5: H & E boyama & Floresans görüntüler. (A, C, E) H & E boyama. (B, D, F) Kültür 21 gün sonra RFP HDMECs damarlara biomatrix (oklar) yanı sıra RCP microcarriers (ok uçları) içinde tespit edildi. Ölçek çubukları: E ve f için A-D ve 30 µm için 50 µm Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bir ana microcarrier hücreleri gerek yere yerine getirmeleri için onların farklılaşma korurken hücreleri genişlemesi hedefidir. Temsil yöntemi tanıtmak hücreleri eklemek, çoğalırlar ve microcarriers yüksek hücre yoğunluğu ile kolonize neredeydin RCP microcarriers. Bu Canlı/Boyama, sadece birkaç ölü hücreleri dinamik kültürler 7 gün sonra elde edilmiştir sırada hangi hücrelerin fazla % 90 algılandı ölü tarafından gözlenmiştir. Aynı şekilde, SEM görüntüleri hücreleri kültürleri 7 gün sonra microcarriers tüm yüzey kaplı doğruladı.

3D modelleri hücre hayatta kalmasını sağlamak için oksijen ve besin hücrelere teminini sağlamak ve atık maddelerin kaldırılması izin vermek önemlidir. Kan damarlarının kan damarları23iç kısmı astar hücreler olduğundan, endotel hücreleri önemli rol oynar bu Satım işleminin sorumlu yapılardır. Onlar prolifere, geçiş, uygun, Filiz ve gemi benzeri yapıları24formu yeteneğine sahip. Hücreleri çimlenme fenotip benimsemeye başardık gözlenmiştir beri bu özellikleri RFP-HDMECs kültür RCP microcarriers üzerinde sonra muhafaza (bkz. Şekil 2). Biz burada bu kolonize RCP microcarriers etkili bir şekilde yeniden BioVaSc biomatrix eski gemilerin Lümen temel için birincil endotel hücreleri teslim kanıtlayabilir. Bu klinik uygulamalar için tasarlanmış doku implantları vaskülarizasyon geliştirmek uygun olmak bizim sistem önerir. Bu matris türevleri başarıyla de vitro tümör olduğu gibi sistemleri21,26,27,28 sınayacağınızdan vaskülarizasyon yaklaşımlar25ve üretim için kullanılmıştır hayvan deney29alternatif olarak cilt karşılıkları. Burada kullanılan açık bir set-up basık ve doku eşdeğerleri22oluşturulmasında uygulanan bir perfüzyon biyoreaktör yerleştirilir.

Biyoreaktörler doku mühendisliğinde kolaylığı yardımcı olabilir doku eşdeğerleri ret ve morbidite30gibi ilişkili riskleri azaltarak talep organların üretmek için kullanılmaktadır. Ancak, doku benzeri yapılar üreten doku özel hücre tipleri, uygun bir iskele ve uygun farklılaşma ve 3D doku montaj izin uygun büyüme faktörlerinin kullanımı ile ilgili çok karmaşık bir süreçtir. Mühendislik yapıları, önemli bir dezavantajı hücreleri hayatta kalma destekleyen uygun bir damar ağı eksikliği olduğunu vitro ve in vivo17. Burada biz RCP kolonize microcarriers bir biyoreaktör modelinde decellularized bir matris ile gerekli, hücre tipi hücre adezyon ve damar oluşumu ve için temel etkenler sağlar özel bir kültür ortam sağlar bir iskele sağlayan birleştirmek çoğalırlar ve fonksiyonel özellikleri korumak için hücreleri. Bu modelin önemli bir sonuç herhangi bir ek dekolmanı veya diğer yaklaşımlar31yılında gerektiği gibi sindirim olmadan iskele RCP microcarriers geçirilecek HDMECs yeteneğidir. Daha sonra onlar özellikle vasküler yapılar kavramı microcarriers hücre iletim sistemi rejeneratif tıp amaçlar için kullanılabilir o macroporous kanıtlayan Matrix'in kolonize.

Tamamen, bu protokolü temsil eden bir ekranı kaplayan hücre genişletme elde etmek için rejeneratif tıp umut verici strateji ve hücre teslim nerede vaskülarizasyon destek mühendislik doku greft için artırabilirsiniz implantasyon sitelere olarak hizmet verebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Bu sonuçlar için önde gelen araştırma Avrupa Birliği yedinci çerçeve programı FP7/2007-2013 gelen hibe sözleşmesi n ° 607051 altında (BIO-ilham) fon aldı. Carolien van Spreuwel-Goossens Fujifilm üretim Avrupa B.V., üzerinden RCP imalat ve Werner Stracke Fraunhofer Enstitüsü sırasında SEM çözümleme konusunda yardım almak için teknik destek silikat araştırma ISC için için müteşekkiriz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide (MTT) Serva Electrophoresis GmbH 20395.01
4’,6-Diamidino-2-phenylindoldihydrochloride (DAPI) Sigma-Aldrich D9542
Acetic acid 100% Sigma-Aldrich 533,001
Analytical balance Kern EG 2200-2NM Kern & Sohn GmbH
Ascorbate-2-phosphate Sigma-Aldrich A8960
Bioreactor Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Wuerzburg, Germany
Bright field microscope Axiovert 40C Carl Zeiss AG
Cellnest Fujifilm
Centrifuge tubes (15 mL, 50 mL) Greiner Bio-One
Collagen R solution 0,4% Serva Electrophoresis GmbH 47254.01
DMEM-F12 Gibco 11320-033
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich D8537 Modified, without calcium chloride and magnesium chloride
Eosin 1% Morphisto 10177.01000
Ethanol 96% Carl Roth GmbH T171.4 Denatured
Fetal calf serum (FCS) Bio&SELL FCS.ADD.0500 not heat-inactivated
Fluorescence microscope BZ-9000 Keyence
Haematoxylin Morphisto 10231.01000
Hexamethyldisilazane Sigma-Aldrich 440191 Reagent grade, ≥99%
Incubator for bioreactor Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Wuerzburg, Germany
Live/Dead Cell Double Staining Kit Fluka 04511KT-F
Magnetic stirrer plate 2Mag 80002
Medium 199 Sigma-Aldrich M0650 10X
Microplate reader
Tecan Infinite M200		 Tecan
Needle 21G 16mm VWR 613-5389
Papain from papaya latex Sigma-Aldrich P4762 lyophilized powder, ≥ 10 units/mg protein
Paraffin Carl Roth GmbH 6642.6
Penicillin/Streptomycin Sigma-Aldrich P4333
Peristaltic pump Ismatec
Quanti-iT PicoGreen dsDNA assay kit Thermo Fischer Scientific P7589
Histofix 4% Carl Roth GmbH P087
Scanning Electron Microscope Supra 25 Carl Zeiss AG
Sodium hydroxide solution 1.0 N Sigma-Aldrich S2770
Spinner flasks (25 mL) Wheaton 356879
Syringe 1 mL VWR 720-2561
Tissue culture flasks (25 cm2, 75 cm2, 150 cm2) TPP Techno Plastik Products AG
Trypan blue 0.4% Sigma-Aldrich T8154
VascuLife VEGF-Mv Lifeline cell technology LL-0005

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Li, B., et al. Past, present, and future of microcarrier-based tissue engineering. Journal of Orthopaedic. 3 (2), Translation 51-57 (2015).
  2. Rodrigues, M. E., Costa, A. R., Henriques, M., Azeredo, J., Oliveira, R. Evaluation of solid and porous microcarriers for cell growth and production of recombinant proteins. Methods Mol Biol. 1104, 137-147 (2014).
  3. Akhmanova, M., Osidak, E., Domogatsky, S., Rodin, S., Domogatskaya, A. Physical, Spatial, and Molecular Aspects of Extracellular Matrix of In Vivo Niches and Artificial Scaffolds Relevant to Stem Cells Research. Stem Cells Int. 2015, 167025 (2015).
  4. Sart, S., Tsai, A. C., Li, Y., Ma, T. Three-dimensional aggregates of mesenchymal stem cells: cellular mechanisms, biological properties, and applications. Tissue Eng Part B. Rev. 20, 365-380 (2014).
  5. Fitzgerald, K. A., Malhotra, M., Curtin, C. M., Brien, F. J. O., O'Driscoll, C. M. Life in 3D is never flat: 3D models to optimise drug delivery. Journal of Controlled Release. 215, 39-54 (2015).
  6. Tan, K. Y., Reuveny, S., Oh, S. K. W. Recent advances in serum-free microcarrier expansion of mesenchymal stromal cells: Parameters to be optimized. Biochemical and Biophysical Research Communications. 473, 769-773 (2016).
  7. de Soure, A. M., Fernandes-Platzgummer, A., da Silva, C. L., Cabral, J. M. Scalable microcarrier-based manufacturing of mesenchymal stem/stromal cells. J Biotechnol. 236, 88-109 (2016).
  8. Schop, D., et al. Expansion of human mesenchymal stromal cells on microcarriers: growth and metabolism. J Tissue Eng Regen. Med. 4, 131-140 (2010).
  9. Carmelo, J. G., Fernandes-Platzgummer, A., Diogo, M. M., da Silva, C. L., Cabral, J. M. A xeno-free microcarrier-based stirred culture system for the scalable expansion of human mesenchymal stem/stromal cells isolated from bone marrow and adipose tissue. Biotechnol J. 10, 1235-1247 (2015).
  10. Malda, J., Frondoza, C. G. Microcarriers in the engineering of cartilage and bone. Trends Biotechnol. 24, 299-304 (2006).
  11. Chen, A. K., Reuveny, S., Oh, S. K. Application of human mesenchymal and pluripotent stem cell microcarrier cultures in cellular therapy: achievements and future direction. Biotechnol Adv. 31, 1032-1046 (2013).
  12. Confalonieri, D., La Marca, M., van Dongen, E., Walles, H., Ehlicke, F. An Injectable Recombinant Collagen I Peptide-Based Macroporous Microcarrier Allows Superior Expansion of C2C12 and Human Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stromal Cells and Supports Deposition of Mineralized Matrix. Tissue Eng Part A. , (2017).
  13. Davidenko, N., et al. Control of crosslinking for tailoring collagen-based scaffolds stability and mechanics. Acta biomaterialia. 25, 131-142 (2015).
  14. Jin, G. Z., Park, J. H., Seo, S. J., Kim, H. W. Dynamic cell culture on porous biopolymer microcarriers in a spinner flask for bone tissue engineering: a feasibility study. Biotechnol Lett. 36, 1539-1548 (2014).
  15. Bae, H., et al. Building Vascular Networks. Science Translational Medicine. 4 (160), 160ps23 (2012).
  16. Cao, L., Wang, J., Hou, J., Xing, W., Liu, C. Vascularization and bone regeneration in a critical sized defect using 2-N, 6-O-sulfated chitosan nanoparticles incorporating BMP-2. Biomaterials. 35 (2), 684-698 (2014).
  17. Novosel, E., Kleinhans, C., Kluger, P. Vascularization is the key challenge in tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4-5), 300-311 (2011).
  18. Cartmell, S. H., Porter, B. D., García, A. J., Guldberg, R. E. Effects of medium perfusion on cell-seeded three-dimensional bone constructs in vitro. Tissue Engineering. 9 (6), 1197-1203 (2004).
  19. Schanz, J., Pusch, J., Hansmann, J., Walles, H. Vascularised human tissue models: a new approach for the refinement of biomedical research. Journal of biotechnology. 148 (1), 56-63 (2010).
  20. Steinke, M., Gross, R., Walles, H., Schütze, K., Walles, T. An engineered 3D human airway mucosa model based on a SIS scaffold. Biomaterials. 35 (26), 7355-7362 (2014).
  21. Moll, C., et al. Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System. J. Vis. Exp. (78), e50460 (2013).
  22. Groeber, F., Kahlig, A., Loff, S., Walles, H., Hansmann, J. A bioreactor system for interfacial culture and physiological perfusion of vascularized tissue equivalents. Biotechnology Journal. 8, 308-316 (2013).
  23. Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Walter, P. Blood vessels and endothelial cells. Molecular Biology of the Cells. , New York. (2002).
  24. Logsdon, E. A., Finley, S. D., Popel, A. S., Gabhann, F. M. A systems biology view of blood vessel growth and remodeling. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 18 (8), 1491-1508 (2014).
  25. Scheller, K., Dally, I., Hartmann, N., Münst, B., Braspenning, J., Walles, H. Upcyte® Microvascular endothelial cells repopulate decellularized scaffold. Tissue Engineering Part C: Methods. 19 (1), 57-67 (2012).
  26. Nietzer, S., et al. Mimicking Metastases Including Tumor Stroma: A New Technique to Generate a Three-Dimensional Colorectal Cancer Model Based on a Biological Decellularized Intestinal Scaffold. Tissue Engineering Part C: Methods. 22 (7), 621-635 (2016).
  27. Göttlich, C., et al. A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds. J. Vis. Exp. (110), e53885 (2016).
  28. Stratmann, A. T., et al. Establishment of a human 3D lung cancer model based on a biological tissue matrix combined with a Boolean in silico model. Molecular oncology. 8 (2), 351-365 (2014).
  29. Groeber, F., et al. A first vascularized skin equivalent for as an alternative to animal experimentation. Altex. 33 (4), 415-422 (2016).
  30. Plunkett, N., O'Brien, F. J. Bioreactors in tissue engineering. Technology and Health Care. 19 (1), 55-69 (2011).
  31. Nienow, A. W., Rafiq, Q. A., Coopman, K., Hewitt, C. J. A potentially scalable method for the harvesting of hMSCs from microcarriers. Biochemical Engineering Journal. 85, 79-88 (2014).
  32. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2008 (5), pdb-prot4986 (2008).

Tags

Biyomühendislik sayı 132 rekombinant kollajen ben peptid macroporous microcarriers Cellnest hücre genişletme değer değiştirici şişeler BioVaSc perfüzyon biyoreaktör çimlenme vaskülarizasyon
Rekombinant kolajen peptid Microcarriers hücre genişletme ve hücre teslim sistemi bir biyoreaktör olarak potansiyel kullanım için ben Model
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Suarez Muñoz, M., Confalonieri, … More

Suarez Muñoz, M., Confalonieri, D., Walles, H., van Dongen, E. M. W. M., Dandekar, G. Recombinant Collagen I Peptide Microcarriers for Cell Expansion and Their Potential Use As Cell Delivery System in a Bioreactor Model. J. Vis. Exp. (132), e57363, doi:10.3791/57363 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter