Summary

הבידוד והתרבות של תאי Epicardial הראשית נגזר מן הלב האנושי למבוגרים ו עוברית דגימות

Published: April 24, 2018
doi:

Summary

Epicardium ממלאת תפקיד מכריע ההתפתחות והתיקון של הלב על ידי מתן תאים גורמי גדילה לדופן שריר הלב. כאן, אנו מתארים שיטה לתאי epicardial ראשי האדם תרבות המאפשרת את המחקר והשוואה בין המאפיינים שלהם למבוגרים ובעיות התפתחותיות.

Abstract

Epicardium, שכבת תאים אפיתל כיסוי שריר הלב, יש תפקיד חיוני במהלך התפתחות הלב, כמו גם התגובה תיקון הלב לאחר פציעה איסכמי. כאשר מופעלת, תאים epicardial עוברים תהליך המכונה אפיתל המעבר mesenchymal (החובשים) כדי לספק לתאי שריר הלב ההתחדשות. יתר על כן, epicardium תורמת באמצעות הפרשת גורמים חיוניים paracrine. כדי להעריך את פוטנציאל הרגנרציה של epicardium, דרושה דוגמנית התא האנושי. כאן אנחנו חלוקה לרמות מודל תרבות תא הרומן לנבוע ראשי תאים נגזר epicardial (EPDCs) ברקמת הלב האנושי למבוגרים ו עוברית. כדי לבודד EPDCs, epicardium גזור מבחוץ של הדגימה הלב, מעובד להשעיה תא בודד. בשלב הבא, EPDCs מצופה, תרבותי EPDC בינוני המכיל את המדכא 5-קינאז ALK SB431542 לשמור על פנוטיפ אפיתל שלהם. החובשים הנגרמת על ידי גירוי עם TGFβ. שיטה זו מאפשרת, לראשונה, חקר התהליך של החובשים epicardial אנושית בסביבה מבוקרת, ומקל צובר יותר על בסיס secretome של EPDCs עשוי לסייע הלב התחדשות. יתר על כן, גישה אחידה זו מאפשרת השוואה ישירה ההתנהגות האנושית למבוגרים ו עוברית epicardial.

Introduction

Epicardium, שכבת האפיתל תא בודד מעטפות הלב, הוא בעל חשיבות פיתוח הלב ותיקון (נבדקה בסמיתס. ואח 1). נכה, epicardium נובע העוגב proepicardial, מבנה קטן הממוקם בבסיס הלב המתפתח. סביב יום התפתחותית E9.5 העכבר ולאחר 4 שבועות תפיסה פוסט-אנוש, התאים להתחיל להעביר מתוך מבנה כרובית ולכסות את שריר הלב המתפתח2. ברגע נוצרת שכבה תא אפיתל בודד, חלק מהתאים epicardial עובר אפיתל המעבר mesenchymal (החובשים). במהלך אמבולנס, תאים לאבד את מאפייני האפיתל שלהם, כגון תאים תאים הדבקויות, ולקבל הפנוטיפ mesenchymal אשר נותן להם את היכולת להעביר לתוך שריר הלב המתפתח. התאים נגזר epicardial בנוי (EPDCs) יכולים להתמיין מספר סוגי תאים הלב כולל fibroblasts, תאי שריר חלק, ואת פוטנציאל cardiomyocytes תאי אנדותל3, למרות בידול של האחרונים שני תא האוכלוסיות נותר כפוף הדיון (נבדקה בסמיתס. et al. 4). יתרה מכך, epicardium מספק אותות paracrine מאלף אל שריר הלב כדי לווסת את הצמיחה ואת vascularization5,6,7,8. מחקרים רבים הוכיחו כי היווצרות epicardial לקוי מוביל ליקויים התפתחותיים-שריר הלב9,10, להערכת11, הולכה מערכת12, תוך שימת דגש ארומטיים התרומה של epicardium את היווצרות של הלב.

למרות בלב למבוגרים epicardium קיים כשכבה רדום, זה הופך להפעיל על איסכמיה13. Epicardial הפעלה מחדש לאחר פציעה recapitulates מספר התהליכים המתוארים לפיתוח לב, כולל הפצת החובשים14, אם כי פחות ביעילות. מעניין, למרות המנגנון המדויק אינה מובנת במלואה, התרומה epicardial לתקן ניתן לשפר על ידי טיפול עם, למשל, β4? ואת מוכנה15 או שונו VEGF-A mRNA16, וכתוצאה מכך יושבחו דום לב פונקציה לאחר אוטם שריר הלב. Epicardium ולכן היא נחשבת מקור תא מעניינים לשיפור ותיקון אנדוגני של הלב הפצוע.

מנגנוני התפתחות הלב הם לעתים קרובות recapitulated במהלך פציעה, אם כי באופן פחות יעיל. בחיפוש אחר מפעילים epicardial, זה בעל חשיבות עליונה. כי אנחנו יכולים לקבוע ולהשוות לקיבולת המלאה של epicardium העובר ואת למבוגרים. יתר על כן, מנקודת מבט טיפולית, זה חשוב, בנוסף לניסויים בבעלי חיים, אנו להרחיב ידע לגבי התגובה של epicardium האנושית. כאן, אנו מתארים שיטה לבודד, תרבות למבוגרים ו עוברית epicardial נגזר תאים אנושיים (EPDCs) במורפולוגיה אפיתל תאים דמויי, כדי לעודד את החובשים. במודל זה, אנו שואפים לחקור ולהשוות בהתנהגות התא epicardial למבוגרים ו עוברית.

היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא השימוש של חומר epicardial האנושי, אשר לא נחקרה ביסודיות. חשוב, פרוטוקול תרבות המתואר, בידוד ותא מספק שיטה אחידה אחת להפיק שני EPDCs חלוק עוברית, למבוגרים, המאפשרים השוואה ישירה בין מקורות שני תאים אלה. בנוסף, מאז epicardium הוא מבודד בהתבסס על המיקום שלו, זה מובטחת כי התאים נמצאים למעשה נגזרת epicardially17.

בעוד האדם שיטות בידוד EPDC הוקמו בעבר, אלה בעיקר להסתמך על פרוטוקולים תוצר איפה פיסות רקמת לב או epicardial הם מצופה על18,19מאכל התרבות התא. גישה זו בוחר ובכך במיוחד עבור תאים זה חלקית לאבד פנוטיפ אפיתל שלהם על מנת להעביר, ו זה נוטים יותר עוברים החובשים ספונטנית. בפרוטוקול הנוכחי, epicardium שהוא מעובד תחילה פתרון תא בודד אשר מאפשר את EPDCs מבודד לשמור על מצב אפיתל שלהם. שיטה זו מספקת ולכן מודל מוצק במבחנה ללמוד החובשים epicardial.

Protocol

כל ניסויים עם דגימות רקמה אנושית אושרו על ידי ועדת האתיקה של המרכז הרפואי של אוניברסיטת ליידן, תואמת הצהרת הלסינקי. כל השלבים מתבצעות עם ציוד סטרילי בתוך זרם תרבות תא ארון. 1. תכשירים הכן EPDC בינוני על ידי ערבוב של Dulbecco של הנשר ששונה בינונית (DMEM נמוך-גלוקוז), בינוני 199 (M1…

Representative Results

כאן, אנחנו חלוקה לרמות פרוטוקול פשוטה כדי לבודד EPDCs מן האדם למבוגרים ו עוברית ברקמת הלב (איור 1). פרוטוקול זה מנצל מיקום נגיש epicardium בצד החיצוני של הלב (איור 1 א’). כתמים auricle הלב לאחר ניתוח מדגים כי WT1 + epicardium מוסר בעוד מטריצה חוץ-תאית subepicardial הבס?…

Discussion

כאן נתאר של פרוטוקול מפורט כדי לבודד והתרבות תאים epicardial הראשית נגזר לבבות אדם מבוגר ו עוברית. אפיון מקיף של תאים אלה כבר שפורסמו בעבר17. אנחנו הראו כי שני סוגי תאים יכול להישמר כתאי אפיתל ריצוף דמוי כאשר תרבותי עם החומר המדכא קינאז ALK5 SB431542. החובשים הוא חלק בלתי נפרד של הפעלת epicard…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

מחקר זה נתמך על ידי הולנד הארגון עבור מדעי למחקר (בתחרות) (VENI 016.146.079), LUMC מחקר לאגודה גם AMS, וגם Stichting Bontius LUMC (MJG).

Materials

Dulbecco’s modified Eagle’s medium + GlutaMAX Gibco 21885-025
Medium 199  Gibco 31150-022
Fetal Bovine Serum  Gibco 10270-106
Trypsin 0.25% Invitrogen 25200-056
Penicillin G sodium salt Roth HP48
Streptomycin sulphate Roth HP66
Trypsin 1:250 from bovine pancreas Serva 37289
EDTA Sigma E4884
Gelatin from porcine skin Sigma-Aldrich G1890
Culture plates 6 well Greiner bio-one 657160
Culture plates 12 well Corning 3512
Culture plates 24 well Greiner bio-one 662160
SB 431542 Tocris 1614
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Merck 102931
100-1000µL Filtered Pipet Tips Corning 4809
10-ml pipet Greiner bio-one 607180
5-ml pipet Greiner bio-one 606180
Cell culture dish 100/20 mm Greiner bio-one 664160
PBS Gibco 10010056 Or home-made and sterilized
Eppendorf tubes 1.5 mL Eppendorf 0030120086
15-ml centrifuge tubes Greiner bio-one 188271
50-ml centrifuge tubes Greiner bio-one 227261
10 mL Syringe Becton Dickinson 305959
Needles 19 Gauge Becton Dickinson 301700
Needles 21 Gauge Becton Dickinson 304432
EASYstrainer Cell Sieves, 100 µm Greiner bio-one 542000
TGFβ3  R&D systems 243-B3
Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle Sigma A2547 
Anti-Mouse Alexa Fluor 555 Invitrogen A31570
Alexa Fluor 488 Phalloidin Invitrogen A12379
Equipment
Name Company Catalog Number Comments
Pipet P1,000 Gilson F123602
Pipet controller Integra 155 015
Stereomicroscope Leica M80
Inverted Light Microscope Olympus CK2
Centrifuge Eppendorf 5702
Waterbath GFL 1083

References

  1. Smits, A. M., Dronkers, E., Goumans, M. J. The epicardium as a source of multipotent adult cardiac progenitor cells: Their origin, role and fate. Pharmacological research. 127, 129-140 (2017).
  2. Risebro, C. A., Vieira, J. M., Klotz, L., Riley, P. R. Characterisation of the human embryonic and foetal epicardium during heart development. Development. 142 (21), 3630-3636 (2015).
  3. Zhou, B., Ma, Q., et al. Epicardial progenitors contribute to the cardiomyocyte lineage in the developing heart. Nature. 454 (7200), 109-113 (2008).
  4. Smits, A., Riley, P. Epicardium-Derived Heart Repair. Journal of Developmental Biology. 2 (2), 84-100 (2014).
  5. Chen, T. H. P., Chang, T. C., et al. Epicardial Induction of Fetal Cardiomyocyte Proliferation via a Retinoic Acid-Inducible Trophic Factor. Developmental Biology. 250 (1), 198-207 (2002).
  6. Pennisi, D. J., Ballard, V. L. T., Mikawa, T. Epicardium is required for the full rate of myocyte proliferation and levels of expression of myocyte mitogenic factors FGF2 and its receptor, FGFR-1, but not for transmural myocardial patterning in the embryonic chick heart. Developmental Dynamics. 228 (2), 161-172 (2003).
  7. Lavine, K. J., Yu, K., et al. Endocardial and epicardial derived FGF signals regulate myocardial proliferation and differentiation in vivo. Developmental Cell. 8 (1), 85-95 (2005).
  8. Stuckmann, I., Evans, S., Lassar, A. B. Erythropoietin and retinoic acid, secreted from the epicardium, are required for cardiac myocyte proliferation. Developmental biology. 255 (2), 334-349 (2003).
  9. Männer, J., Schlueter, J., Brand, T. Experimental analyses of the function of the proepicardium using a new microsurgical procedure to induce loss-of-proepicardial-function in chick embryos. Developmental Dynamics. 233 (4), 1454-1463 (2005).
  10. Weeke-Klimp, A., Bax, N. A. M., et al. Epicardium-derived cells enhance proliferation, cellular maturation and alignment of cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 49 (4), 606-616 (2010).
  11. Eralp, I., Lie-Venema, H., et al. Coronary Artery and Orifice Development Is Associated With Proper Timing of Epicardial Outgrowth and Correlated Fas Ligand Associated Apoptosis Patterns. Circulation Research. 96 (5), (2005).
  12. Kelder, T. P., Duim, S. N., et al. The epicardium as modulator of the cardiac autonomic response during early development. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 89, 251-259 (2015).
  13. van Wijk, B., Gunst, Q. D., Moorman, A. F. M., van den Hoff, M. J. B. Cardiac regeneration from activated epicardium. PloS one. 7 (9), e44692 (2012).
  14. Zhou, B., Honor, L. B., et al. Adult mouse epicardium modulates myocardial injury by secreting paracrine factors. The Journal of clinical investigation. 121 (5), 1894-1904 (2011).
  15. Smart, N., Bollini, S., et al. De novo cardiomyocytes from within the activated adult heart after injury. Nature. 474 (7353), 640-644 (2011).
  16. Zangi, L., Lui, K. O., et al. Modified mRNA directs the fate of heart progenitor cells and induces vascular regeneration after myocardial infarction. Nature Biotechnology. 31 (10), 898-907 (2013).
  17. Moerkamp, A. T., Lodder, K., et al. Human fetal and adult epicardial-derived cells: a novel model to study their activation. Stem Cell Research & Therapy. 7 (1), 1-12 (2016).
  18. Clunie-O’Connor, C., Smits, A. M., et al. The Derivation of Primary Human Epicardium-Derived Cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 35, 2C.5.1-2C.5.12 (2015).
  19. Van Tuyn, J., Atsma, D. E., et al. Epicardial Cells of Human Adults Can Undergo an Epithelial-to- Mesenchymal Transition and Obtain Characteristics of Smooth Muscle Cells In Vitro. Stem Cells. 25 (2), 271-278 (2007).
  20. Bax, N. A. M., van Oorschot, A. A. M., et al. In vitro epithelial-to-mesenchymal transformation in human adult epicardial cells is regulated by TGFβ-signaling and WT1. Basic research in cardiology. 106 (5), 829-847 (2011).
  21. Chechi, K., Richard, D. Thermogenic potential and physiological relevance of human epicardial adipose tissue. International Journal of Obesity Supplements. 5 (Suppl 1), S28-S34 (2015).

Play Video

Cite This Article
Dronkers, E., Moerkamp, A. T., van Herwaarden, T., Goumans, M., Smits, A. M. The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens. J. Vis. Exp. (134), e57370, doi:10.3791/57370 (2018).

View Video