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Developmental Biology

人間の成人および胎児心標本由来分離とプライマリの心外膜細胞の培養

doi: 10.3791/57370 Published: April 24, 2018

Summary

心外膜細胞と心筋壁に成長因子を提供することによって開発し、中心部の修復に重要な役割を果たしています。ここでは、研究と彼らの発達と大人の特性の比較を可能にする培養ひと心外膜細胞に手法について述べる。

Abstract

心外膜, 心筋を覆う上皮細胞層は、虚血性損傷後、心臓の開発中に、心の修復反応での重要な役割にいます。アクティブになったとき、心外膜細胞は再生心筋細胞を提供するでは上皮間葉転換 (EMT) 知られているプロセスを経る。さらに、必須のパラクライン因子の分泌を介して、心外膜が貢献しています。心外膜の再生の可能性を完全に鑑賞するには、ひと細胞モデルが必要です。ここでは、人間の成人および胎児の心臓組織から一次派生心外膜細胞 (EPDCs) を導出する新規細胞培養モデルを概説します。EPDCs を分離するには、心外膜が心臓標本の外から解剖、単一細胞懸濁液に処理します。次に、EPDCs はメッキ、ALK 5-キナーゼ阻害剤の上皮性の表現型を維持するために SB431542 を含む追求培地で培養しました。EMT は TGFβ 刺激によって誘導されます。このメソッドは、制御された設定で人間の心外膜 EMT の過程の研究を有効にした最初の時間のため、心臓再生を助けることができる EPDCs の secretome でより多くの洞察を得ることが容易になります。さらに、この統一的なアプローチは、人間の成人および胎児心外膜挙動の直接比較のためことができます。

Introduction

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心外膜、封筒、心は、極めて重要な心臓の開発と修理 (スミッツの見直しのための単一細胞上皮層1). 発達、心外膜に起因 proepicardial 器官の開発の中心部の底部にある小さな構造。マウス、および 4 週間後の概念で、人間の発達の日 E9.5、周辺細胞はこのカリフラワー構造からの移行し、開発心筋2をカバーを開始します。単一の上皮細胞層が形成され、一度心外膜細胞の一部は上皮間葉転換 (EMT) に行われます。EMT、中に細胞は細胞接着斑などの上皮性特性を失うし、それらの発展途上の心筋に移行する能力を与える間葉系の表現型を得る。後者の 2 つのセルが形成された心外膜派生セル (EPDCs) が線維芽細胞、平滑筋細胞、および可能性のある心筋細胞、内皮細胞3を含むいくつかの心筋細胞タイプに区別できます。集団のまま (スミッツの見直し議論の対象と4). さらに、心外膜、その成長と血管新生5,6,78を規制する心筋に有益なパラクリン シグナル。複数の研究は、障害の心外膜形成が心筋9,10, 血管11及び伝導システム12、強調、エッセンシャルで発育障害につながることを実証しています。心の形成に心外膜の貢献。

大人の心、心外膜は休眠層として存在が、それは虚血13の時に再開になります。心外膜再ポスト傷害のいくつかを繰り返すプロセス説明にもかかわらず増殖と EMT14などを含む心臓の開発の小さい効率的に。興味深いことに、正確なメカニズムは十分に理解されていないが修復への貢献を心外膜変更 VEGF-A mRNA16心の改善の結果、例えば、サイモシン β415と治療によって改善できるまたは心筋梗塞後の機能。心外膜は、傷ついた心臓の内因性修復を高めるために興味深い細胞ソースとみなされます。

心臓発生のメカニズムは頻繁に締めくくっているけが、中にあまり効率的な方法ではあるが。心外膜の活性化を求めて、それは決定し、胎児および大人の心外膜の全容量を比較できますは重要です。また、治療の観点から、動物実験だけでなく人間の心外膜の応答に関する知識を拡張、重要です。ここでは、分離し、細胞の培養ひと成人および胎児心外膜派生 (EPDCs) 上皮細胞の形態で、EMT を誘導する手法について述べる。このモデルでは、探索し、成人および胎児の心外膜細胞の挙動を比較を目指します。

このプロトコルの主な利点は、徹底的に検討されていない人間の心外膜材料の使用です。重要なは、説明の分離および細胞培養のプロトコルは、これらの 2 つのセルのソース間の直接比較を有効にする両方の胎児および大人の石畳 EPDCs を取得する単一の統一された方法を提供します。さらに、心外膜は分離の場所に基づいて、セルが実際に epicardially 派生17であることが保証されます。

人間の追求の分離メソッドが以前に確立されると、大抵伸長プロトコル細胞培養皿18,19に心臓や心外膜組織の部分をメッキパーツに依存してこれら。このアプローチは、部分的に彼らの上皮性の表現型を失うことが、移行するために、自発的な EMT を受けることになりやすい細胞用により選択します。現在のプロトコルの心外膜は最初の上皮の状態を維持するために分離の EPDCs を可能にする単一細胞液に処理されます。このメソッドは、したがって心外膜 EMT を勉強する固体の in vitroモデルを提供します。

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Protocol

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人間の組織標本で実験にはライデン大学医療センター倫理委員会で承認され、ヘルシンキ宣言に準拠しています。細胞文化フロー キャビネットの滅菌装置のすべての手順が実行されます。

1. 準備

  1. ダルベッコ変法イーグル培地 (DMEM 低グルコース) と中 199 (M199) を 1:1 の比率で混合することによって追求メディアを準備します。10% 熱不活化ウシ胎児血清 (FBS、56 ° C で 25 分の不活化熱) を追加 100 U/mL ペニシリンとストレプトマイシン 100 mg/mL を補足します。あらかじめ暖かい EPDC 37 ° C の水浴中。
  2. あらかじめトリプシンを暖かい 0.25%/EDTA (1:1) 37 ° C の水浴中。
  3. ゼラチンで井戸をコートします。各ウェルに 0.1% ゼラチン/PBS を追加し、37 ° C で少なくとも 15 分版を孵化させなさい必要な細胞培養プレートのためのガイドラインを表 1にまとめます。細胞をメッキする前にすべての流体を慎重に取り外します。
  4. ストック溶液 10 mM SB431542 (SB) DMSO (注意) を希釈を準備します。50 μ L の因数は、円錐の底のポリプロピレン製遠心チューブ、エッペン チューブのような-20 ° C で保存SB 因数を一度だけ解凍できることに注意してください。

2. 検索や成人および胎児心臓標本の記憶

  1. 15 mL と 50 mL のチューブで手術中に除去に直接人間の大人心耳を保存 10 %fbs、100 U/mL ペニシリンおよび 4 ° C で 100 mg/mL ストレプトマイシンを含む高グルコース DMEMサンプル サイズで 3-5 cm は、一般的に、最大保存することができます郭清後 48 h。
  2. 分離後 24 h 最大 4 ° C で EPDC 媒体で人工妊娠中絶材料から得られた胎児の心を格納します。このプロトコルの 12-22 週間の間の妊娠期間でサンプルを使用します。心外膜の隔離のため、心臓全体を使用できることを注意してください。

3. 心外膜層の分離

  1. 流キャビネット、PBS の 100 mm 細胞培養皿を準備し、蓋に PBS の独立した液滴 (〜 200 μ L) を配置します。5 mL に予め温めておいた追求中 15 mL チューブを入力します。
  2. 場所細胞培養皿にティッシュ PBS でいっぱい。組織はプロシージャの間によく湿らされたことを確認します。
  3. 顕微鏡を使用して、多くの削除できるだけ組織サンプルから心外膜層鉗子を使用して剥がして。
    注: 非常に薄い透明なレイヤー (図 1 a) 心臓の外側に密着、心外膜を認識できます。これは分離が阻害されますから心外膜脂肪組織と血管の混入を避けてください。
  4. 蓋の上の PBS の液滴の心外膜組織の断片を収集します。
  5. メス (図 1 b) を使用してまたは小さな鉗子の先端が鋭いを使用して小さな断片 (0.5 mm3) に心外膜組織を切断します。作品が、P1 を渡すことに注意してください 000 ピペット先端部 (ステップ 3.6)。
  6. 心外膜組織にトリプシンの 1 つの mL を追加し、作品と P1, 000 ピペット先端部とトリプシンを収集します。1.5 mL の円錐形遠心管 (図 1) に組織を転送します。
  7. 〜 60 rpm で揺れながら 10 分の 37 ° C の水浴のチューブを孵化させなさい。
  8. 風呂の水からチューブを外し、70% エタノールで管の外側を清掃します。
  9. (図 1) の管の底に沈むし、トリプシンを不活化する 5 mL EPDC 媒体を含んでいる 15 mL チューブに心外膜細胞を含む上清を慎重に転送する組織を許可します。
  10. 1 mL のトリプシン、円錐形遠心分離機管の残りのティッシュを補充して上下に軽くピペッティングで混ぜます。
  11. 3.7 に 3.10 の手順を 2 回繰り返します。最後のステップでトリプシン培養の 30 分の合計後上澄みと残りの心外膜組織に転送 EPDC 媒体を含んでいる管。
  12. 追求中のすべてのセルが収集されると、優しく通過懸濁液 10 mL シリンジ 19 ゲージの針で機械的に細胞 (図 1E) を分離する新しい 15 mL チューブに。
    注: を妨げ得ること針を防ぐために針をソリューションを通過する前に上下にピペッティングによる懸濁液を均一に確認します。
  13. さらに細胞を分離するには、21 g 針付き 3.12 手順を繰り返します。
  14. 50 mL チューブの上に 100 μ m セル ストレーナーを置き、10 mL のピペットを使用してすべての残りの塊 (図 1 f) を削除するストレーナーに心外膜細胞を含む培地を転送します。
  15. こし器に 5 mL EPDC 媒体をピペッティングして残留細胞を収集するストレーナーを洗浄します。
  16. 15 mL チューブに 50 mL の管から細胞懸濁液をピペットで移しなさい。以来、細胞はチューブの底に沈む、ピペッティングする前にソリューションを軽く振る。
    注: この手順は必要ではありません、小さい管は遠心分離後、ペレットの可視化を支援します。
  17. (図 1) 室温で 5 分間 200 × g で遠心分離機します。
  18. 上澄みを除去し、追求中 (表 1) の必要量で (図 1 H) 細胞ペレットを再懸濁します。
    注: 胎児 EPDCs EPDC 培 ALK5 キナーゼ阻害剤 (EPDC + SB) の 10 μ M を直接使用します。大人の細胞は、最初の通過中に SB なしメッキできます。
  19. ゼラチン コーティング培養皿 (図 1I) に細胞懸濁液をプレートします。井戸のサイズは、心外膜組織サンプル (表 1) のサイズによって決まります。低密度で EMT の発生を誘発することに注意してください。
  20. 37 ° c、5% CO2細胞培養プレートにアタッチするを許可するように、少なくとも 48 時間のためのインキュベーターにセルを配置します。

4. EPDCs の文化

  1. 少なくとも 3 日ごと EPDC + SB 媒体を補充します。
  2. 顕微鏡を使用して、少なくとも 3 日間、細胞を検査します。細胞培養プレートが細胞で完全に覆われているとき密度、すなわちに到達、表面比 1:2 のセルを通路します。Confluency に達する 〜 5-10 日を取ることができますに注意してください。
    1. 例えば、ガラス ピペット、ピペットまたは吸引システムを使用してメディアを吸い出しなさい。
    2. PBS をセルに追加することによって、細胞を丁寧に洗います。ゆっくり版は渦巻きし、PBS を吸引します。
    3. プレートにトリプシンを追加します。優しくトリプシン セルはすべてをカバーし、37 ° C で 1 分のプレートをインキュベートするプレートを回転します。
      注意: 可能な限り小さなトリプシンとして使用 (表示: 200 μ L/6 ウェル ウェル プレート)
    4. プレートの底から細胞を機械的に切断するプレートをタップします。顕微鏡を使用して、細胞が切断したかどうかを視覚的に確認します。ない場合は、余分な分インキュベート細胞培養プレート。
    5. セルに追求 + SB 中の必要量を追加、上下、ピペッティングで再懸濁し、細胞懸濁液を新しいゼラチン コーティング培養プレートに転送します。
      注: 一般的には、細胞に保存できます 8 の通路まで石畳形態。

5. EPDCs で EMT の誘導

  1. EMT を誘導して、トリプシンと転送新しいゼラチンにセル、4 で説明したように EPDC + SB 中に、表面比 1:2 の井戸をコーティングし、37 ° C、5% CO2で少なくとも 24 時間インキュベート細胞を分離します。
  2. チェック場合合流は 50-70% と EPDCs ある石畳の形態であるかどうかです。
    注: の Confluency EMT を受ける EPDCs の能力に影響します。
  3. 細胞から培地を吸引させ、慎重に PBS のセル (4.2.1 - の手順を参照してください 4.2.2)。
  4. 1 ng/ml TGFβ3 EPDC 培地で細胞を刺激し、37 ° C、5% CO2の 5 日間でインキュベーターで配置します。刺激の中に TGFβ3 を含む追求中が持たない補充するに注意してください。
  5. セルを毎日監視します。5 日後、EMT を受けた細胞は紡錘形の形態 (図 2 a) によって認識されます。
  6. 文化追求中に SB の TGFβ 添加せず 4 で説明されている方法に従って紡錘形 EPDCs。一般に、紡錘形 EPDCs 注は、20 の通路まで培養することができます。
  7. 免疫蛍光染色と EMT の発生を検証ファロイジン、間葉系のマーカー αSMA またはビメンチンに対する抗体を使用して F-アクチン繊維の応力 (図 2 b) の形成を検出するまたは EMT 関連遺伝子 (の qRT PCR を使用して例えば、WT1, ペリオスチン Col1A1、αSMA、N-カドヘリン、MMP3、カタツムリ、ナメクジ) (図 2および表 2)。

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Representative Results

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ここでは、我々 は人間成人および胎児心臓組織 (図 1) から EPDCs を分離するための単純なプロトコルを概説します。(図 1 a) 心臓の外側の心外膜の容易にアクセス可能な場所のこのプロトコルを活用します。心耳垂染色後郭清基になる下の細胞外マトリックスと心筋組織のままそのまま (図 1 j) WT1 + 心外膜が削除されることを示します。EPDCs エクスプレス心外膜マーカーなど、その他中心部居住者セル型、例えばPECAM1、ISL1、CD34 の TNNT2 の ALDH1A2、TBX18、KRT8、KRT19 欠如表現ことを示す前に、広範な評価を行われています。17

(図 1 K) 大人と胎児 (図 1 L) EPDCs 石畳形態 ALK5 キナーゼ阻害剤 SB431542 ショーの前で培養されます。しかし、ドナーとその培養条件によって胎児 EPDCs は SB の存在にもかかわらず EMT を受けることができます。石畳細胞 (図 1 Lの矢印を参照) の人口内の紡錘形細胞の可能性があります。胎児組織から石畳状の細胞の分離可能、常にではない、ほとんど紡錘形細胞の誘導があります注意してください。これらの細胞が速く成長するので彼らは急速に他のセルタイプがおいしげます。

紡錘形細胞 (図 2 a) に明確な形態の転移によって示されるように、TGFβ320に 5 日間の成人および胎児の細胞培養で EMT を誘起することができます。無処理 (「空」) で示されるように胎児 EPDCs アダルト EPDCs 刺激による TGFβ3 と EMT を受けるのみ、sb、除去時に自発的な EMT が行われます。EMT を検証するため、EPDCs は immunostained と α-平滑筋アクチン (αSMA)、間葉系のマーカー (図 2 b).さらに、EMT は心外膜マーカー WT1 の qRT PCR 示すダウンレギュレーションと間葉系マーカー POSTN、αSMA、コラーゲン 1A1、MMP3、および N-カドヘリン (図 2) のアップレギュレーションを使用して大人の EPDCs で確認されました。成人および胎児の心外膜 EMT に関する包括的な実験は、17の前に発行されます。

組織 井戸型 セル成長領域 (cm2) 媒体 (mL) のボリューム SB 添加
胎児 24 1.9 0.5 直接
大人の小さい (< 4 cm) 12 3.8 1 1st通過後
アダルト大 6 9.6 2 1st通過後
(> 4 cm)

表 1: 適切な細胞培養プレートの選択指針。必要なサイズは、心外膜細胞の量に依存します。これらのガイドラインは、適切な細胞培養プレートを選択する親指のルールとして使用できます。

遺伝子 シーケンス
WT1 を楽しみにして CAG CTT GAA TGC ATG ACC TG
WT1 の逆 TAT TCT GTA TTG GGC TCC GC
N-カドヘリン前方 CAG ACC GAC CCA AAC AGC AAC
N-カドヘリン逆 GCA GCA ACA GTA AGG ACA AAC ATC
POSTN 楽しみ GGA GGC AAA CAG CTC AGA GT
POSTN リバース GGC TGA GGA AGG TGC TAA AG
SMA フォワード CCG GGA GAA AAT GAC TCA AA
SMA リバース GAA GGA ATA GCC ACG CTC AG
MMP3 前方 TGG ATG CCG 猫 ATG AAG
MMP3 逆 CAG AAA TGG CTG 猫 CGA
COL1A1 前方 CCA GAA GAA CTG GTA 猫 CAG CA
COL1A1 逆 シージーシー猫法 CGA AAT GGG AAT
GAPDH 前方 AGC CAC ATC GCT CAG ACA C
GAPDH の逆 GCC CAA TAC GAC CAA ATC C
B2M 前方 ACA CTG AAT TCA CCC CCA CT
B2M 逆 GCT TAC ATG TCT CGA TCC CAC T

表 2: EPDCs で EMT の検証用のプライマー シーケンス。関連アダルト EPDCs 遺伝子のいくつかの EMT の発現を決定する qRT PCR に使用される前方および逆引きのプライマーのシーケンス。

Figure 1
図 1: 心外膜の分離由来培養細胞 (EPDCs) です。(A) 描かれた、薄い外膜層、削除は心外膜で人間の心から削除アダルト耳介。黒い矢印は、心外膜を指します。(B-私)EPDCs の分離メソッドのビジュアル表現。黒い矢印は、細胞ペレットを指します。(J) 心の耳介と心外膜の郭清なしの蛍光抗体染色。スケール バー: 50 μ m (K) 代表の写真 2 つ異なるアダルト EPDC 隔離 SB. (L) 2 つの異なる胎児 EPDC 隔離 SB. 黒矢印で培養の代表的な写真の培養を示す胎児のような間葉系細胞追求の文化。スケール バー: 200 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2: 成人および胎児心外膜由来細胞 (EPDCs) の EMT の検証します。成人および胎児 EPDCs sb、扱われていない (空の) 培養または 5 日間の TGFβ3 で刺激します。(A) 代表的な明るいフィールド画像。スケール バー: 200 μ m。 (B) 染色 DAPI と αSMA。スケール バー: 100 μ m。 (C) の mRNA のレベル EMT 関連遺伝子、qRT PCR を使用して大人の EPDCs で決定。測定値は、GAPDH と B2M 式に正規化されました。値の平均値 +2 SD として描かれている ^-ΔΔct (n = 2)。省略形: WT1:Wilms の腫瘍 1、MMP3: マトリックス マトリックスメタロプロテアーゼ 3, POSTN:Periostin, αSMA: α 平滑筋アクチン, Col1A1:Collagen 1A1。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

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Discussion

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ここで人間の成人および胎児心に由来する一次心外膜細胞を分離するための詳しいプロトコル文化について述べる。これらの細胞の広範な評価は、以前に公開された17をされています。我々 は両方のセルタイプを ALK5 キナーゼ阻害剤 SB431542 による培養上皮の石畳のような細胞として維持できることを示しています。EMT は開発およびポスト傷害応答中に体内の心外膜活性化の不可欠な部分です。TGFβ の追加でこのメソッドを使用して、EMT を研究できます。重要なは、SB が削除されると、大人の EPDCs だけ刺激17時に EMT を受ける中胎児 EPDCs が急速に自発的な EMT を受けるを以前見ました。胎児 EPDCs でこれらのプロセスを勉強して最適な損傷後大人の心外膜をアクティブにする方法を理解する上で役立つ可能性があります。

提案手法は、手術中に得られた患者の材料に依存します。したがって、1 つはいずれかにより患者の変動や手術室の材料を収集する速度である分離した、材料の状態でいくつかのバリエーションを期待することができます。この変化は、手順の違いを説明するかもしれない: 心外膜することができます解剖して心筋から 1) どのように簡単に、2) 3) の能力を防止または、EMT、4) 増殖速度を受ける板に隔離されたセルの付着。一般的に、迅速な分離細胞生存のためお勧めします。メインの臨界点心筋から心外膜を剥離します。心外膜は強く根本的な組織に付着した、トリプシンと心筋組織の治療 15 分前は心外膜をより簡単に削除できます。さらに、トリプシン処理の有効性は、トリプシン活性と組織の構成を含むいくつかの要因に依存します。したがって、低収量を観察すると、トリプシン培養時間が調整できます。さらに、細胞ペレットがスピン ダウン後表示されない場合、ソリューション可能性がありますがされて完全に解離しないフィルターを実行する前に。注射器をソリューションを通過または余分な物を使用して前に溶液の混合、小さい注射器はセルを分離するに役に立つかもしれません。EPDCs をシードにもサイズの上皮の状態を維持するために細胞を有効に注意深く考えなければなりません。表 1は、指示を与えるが、1 つはこのガイドラインから逸脱できるとき、たとえば、胎児心臓の小さな部分だけを使用することができますおよび小さい井戸にめっきはより便利。

胎児の細胞は SB17なし、EMT をすぐに受ける、以来、胎児 EPDCs は sb メッキ常にする必要があります。しかし、大人 EPDCs、上皮の形態を維持するために傾向がある、したがって SB なし細胞接着を促進するために、最初の道の最初の 48 時間の間にめっきすることが。最初の通過後自発の EMT を防ぐために sb 成人および胎児 EPDCs を継続的に培養しています。さらに、低細胞密度は、EMT の重要なトリガーです。EPDCs は、したがっては 50% の confluency 下培養決してする必要があります。その一方で、EMT が必要な場合は、EPDCs があまりにも密集シードされていないと 70% の confluency の下に滞在を確認してください。このプロトコルは、TGFβ3 を利用して、TGFβ1 と-2 刺激は EPDCs 同様 (未発表の観察) で EMT を誘導できます。

このプロトコルでセルは、遠心分離機を使用するときより低い細胞の生存が観察、回転せずに直接分割されます。したがって、トリプシンの低ボリュームを使用して血清含有培地が追加されたとき、非アクティブ化を確認する重要です。

6 〜 8 通路後上皮形態と EPDCs は成長が止まるかまたは EMT 自発的に受けることになります。したがって、実験に使用して 3 の通路と通路 6 EPDCs を考え出します。対照的に、間葉系の形態と EPDCs は脆弱さが少ないと 20 の通路まで培養することができます。実験では、ただし、我々 使ったことがない 10通過した後 EPDCs を主軸します。

心外膜が心臓の外側にある、基になる組織から分離する簡単ですのでセルの信頼性は明白、および重要な汚染の可能性は低い。脂肪組織や血管も免震の心外膜層に固執する、それらの細胞の大半、分離中にストレーナーを渡すことはありません、追求の細胞培養で生き残ることはできませんそれ以外の場合。さらに、前に述べたように、心外膜細胞動作.を調査するユニークなモデルを提供しますひと由来の材料を使用して例えば、心外膜脂肪組織は心外膜細胞モデル21の必要性を強調し、種の間で異なることが知られています。

心臓の心耳が病気の心、手術中に得られた、従って病気に使用される薬剤、年齢、およびドナーの性別の違いの実験の再現性に影響を及ぼすかもしれないことに注意してください。有効な結果を取得し、強固な結論を描画するを許可するいくつかの分離の実験を実行したがって必要があります。さらに、研究質問によって 1 つは、具体的に別様にされる非虚血性の弁膜症、虚血性疾患患者または患者から心外膜のみを使用できます。

心房心外膜は心室の心外膜2から明瞭な特性が、心外膜動作に有効なモデルを提供しますそれにより心房の心臓耳介由来の心外膜かどうか疑って、それは示唆されています。この文脈で、我々 は心房と心室胎児間違い派生 EPDCs (未発表データ) 見つかりませんでしたを指摘することが重要です。ただし、ひと成人心室の心外膜を使用するとすると、これを確認する最終的な細胞ソースとなります。しかし、EPDC 分離の成人脳室人間の大規模な標本を収集は患者にとって非常に侵略的、したがって現在されていない実行可能なこの病院。

SB が常に胎児の EPDCs を中心に、EMT を防止するのに十分ではないことがわかった。胎児 EPDCs を受ける EMT SB の存在下で、我々 は実験からそれらを除外します。結果として、SB への応答での上皮性の表現型を維持する能力の実験用セルが選択されます。私たちは胎児の細胞は、EMT の過程で特定のしきい値を超えてすでにすることができ、sb を抑制することはこれを停止することがないと仮定します。

この心外膜細胞モデルの開発と大人の心外膜を調べることができますので、複数のアプリケーションがあります。私たちの研究室では、心臓の損傷後の心外膜の再生応答改善に着目します。大人 EPDCs は、心外膜の ameliorated 再生応答に対する潜在的な治療薬を見つけることを目指して、EMT を誘導する化合物をテストする使用できます。パラクリン (re) へのシグナリングを理解する EPDCs によって分泌される要因を測定することが可能ですまた、心筋を生成します。さらに、胎児 EPDCs が大人の EPDCs と比較して自発的に EMT を受けることになりやすいことがわかった、以来私たちは胎児および大人の EPDCs の違いを調査します。増加胎児活性化の基になるメカニズムを決定すると、成人の心臓における心外膜活性化を改善するためにキューが提供できます。

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Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgments

この研究はオランダ組織科学的研究 (NWO) (イタリアヴェネツィア 016.146.079)、LUMC 研究フェローシップ AMS と LUMC Bontius スティヒティング (MJG) の両方でサポートされます。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium + GlutaMAX Gibco 21885-025
Medium 199  Gibco 31150-022
Fetal Bovine Serum  Gibco 10270-106
Trypsin 0.25% Invitrogen 25200-056
Penicillin G sodium salt Roth HP48
Streptomycin sulphate Roth HP66
Trypsin 1:250 from bovine pancreas Serva 37289
EDTA Sigma E4884
Gelatin from porcine skin Sigma-Aldrich G1890
Culture plates 6 well Greiner bio-one 657160
Culture plates 12 well Corning 3512
Culture plates 24 well Greiner bio-one 662160
SB 431542 Tocris 1614
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Merck 102931
100-1000µL Filtered Pipet Tips Corning 4809
10-ml pipet Greiner bio-one 607180
5-ml pipet Greiner bio-one 606180
Cell culture dish 100/20 mm Greiner bio-one 664160
PBS Gibco 10010056 Or home-made and sterilized
Eppendorf tubes 1.5 mL Eppendorf 0030120086
15-ml centrifuge tubes Greiner bio-one 188271
50-ml centrifuge tubes Greiner bio-one 227261
10 mL Syringe Becton Dickinson 305959
Needles 19 Gauge Becton Dickinson 301700
Needles 21 Gauge Becton Dickinson 304432
EASYstrainer Cell Sieves, 100 µm Greiner bio-one 542000
TGFβ3  R&D systems 243-B3
Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle Sigma A2547 
Anti-Mouse Alexa Fluor 555 Invitrogen A31570
Alexa Fluor 488 Phalloidin Invitrogen A12379
Equipment
Name Company Catalog Number Comments
Pipet P1,000 Gilson F123602
Pipet controller Integra 155 015
Stereomicroscope Leica M80
Inverted Light Microscope Olympus CK2
Centrifuge Eppendorf 5702
Waterbath GFL 1083

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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人間の成人および胎児心標本由来分離とプライマリの心外膜細胞の培養
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Dronkers, E., Moerkamp, A. T., van Herwaarden, T., Goumans, M. J., Smits, A. M. The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens. J. Vis. Exp. (134), e57370, doi:10.3791/57370 (2018).More

Dronkers, E., Moerkamp, A. T., van Herwaarden, T., Goumans, M. J., Smits, A. M. The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens. J. Vis. Exp. (134), e57370, doi:10.3791/57370 (2018).

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