Isolasjon og kultur av primære Epicardial celler avledet fra menneskelige voksne og fosterets hjerte prøver
Summary
Epicardium spiller en avgjørende rolle i utviklingen og reparasjon av hjertet celler og vekstfaktorer på hjerteinfarkt veggen. Her beskriver vi en metode å kultur menneskelige primære epicardial celler som muliggjør studiet og sammenligning av karakteristikkene utviklingsmessige og voksne.
Abstract
Epicardium, en epitelcellelaget som dekker myokard, har en viktig rolle under hjerte utvikling og reparasjon svar hjertet etter iskemiske skader. Når aktivert, gjennomgå epicardial celler en prosess kjent som epithelial mesenchymal overgang (EMT) å gi cellene regenerating myokard. Videre bidrar epicardium via utskillelsen av viktige paracrine faktorer. For fullt ut regenerativ potensialet i epicardium, kreves det en human celle modell. Her skissere vi en roman celle kultur modell å utlede primære epicardial avledet celler (EPDCs) fra menneskelige voksne og fosterets hjerte vev. For å isolere EPDCs, er epicardium dissekert fra utsiden av hjertet prøven og behandlet i en enkeltcelle suspensjon. Deretter er EPDCs belagt og kultivert i EPDC medium som inneholder den ALK 5-kinase inhibitor SB431542 å opprettholde deres epithelial fenotypen. EMT er indusert ved stimulering med TGFβ. Denne metoden muliggjør, for første gang, studiet av menneskelig epicardial EMT i en kontrollert setting, og Letter å få mer innsikt i secretome av EPDCs som kan hjelpe hjertet gjenfødelse. Videre tillater denne uniform direkte sammenligning av menneskelig voksne og fosterets epicardial atferd.
Introduction
Epicardium, en enkeltcelle epiteliale lag at konvolutter hjertet, er av avgjørende betydning for hjerte utvikling og reparasjon (omtalt i Smits et al. 1). developmentally, epicardium oppstår fra proepicardial orgel, en liten struktur ligger ved foten av utvikle hjerte. Rundt utviklingsmessige dag E9.5 i mus og 4 uker etter unnfangelsen i menneskelig begynner celler å migrere fra denne blomkål strukturen og dekke utvikle myokard2. Når en enkelt epitelcellelaget er dannet, gjennomgår en del av de epicardial cellene epithelial mesenchymal overgang (EMT). Under EMT, cellene mister deres epithelial egenskaper, for eksempel celle-celle adhesjon, og få en mesenchymal fenotypen som gir dem kapasitet til å overføre til utvikle myokard. Dannet epicardial avledet celler (EPDCs) kan skille ut flere cardiac celletyper inkludert fibroblaster, glatt muskelceller, og potensielt cardiomyocytes og endotelceller3, selv om differensiering av sistnevnte to celle bestander fortsatt debatt (omtalt i Smits et al. 4). dessuten epicardium gir lærerikt paracrine signaler til myokard å regulere sin vekst og endometrial blodkar5,6,7,8. Flere studier har vist at svekket epicardial formasjon fører til utviklingsmessige feil i Hjertemuskel9,10, blodkar11og ledning systemet12, understreker vesentlige bidrag av epicardium til dannelse av hjertet.
Selv i voksen hjertet av epicardium finnes som en sovende lag, blir det reaktivert ved iskemi13. Epicardial reaktivering etter skade viser flere av prosessene beskrevet for hjerte utvikling, inkludert spredning og EMT14, om enn mindre effektivt. Interessant, selv om den eksakte mekanismen ikke er fullt ut forstått, epicardial bidrag til å reparere kan forbedres ved behandling med f.eksThymosin β415 eller endret VEGF-A mRNA16, som resulterer i ameliorated hjerte funksjonen etter hjerteinfarkt. Epicardium er derfor betraktes en interessant celle kilde å forbedre endogene reparasjon av skadet hjertet.
Mekanismer av cardiac utvikling er ofte recapitulated under skade, men i en mindre effektiv måte. Søk epicardial aktivator er det viktig at vi kan finne og sammenligne hele kapasiteten på fosterets og voksen epicardium. Videre fra en terapeutisk synspunkt er det viktig at i tillegg til dyreforsøk, vi utvide kunnskap om responsen av den menneskelige epicardium. Her beskriver vi en metode å isolere og kultur menneskelige voksne og fosterets epicardial avledet celler (EPDCs) i en epithelial-cellen som morfologi og å indusere EMT. Med denne modellen, har vi som mål å utforske og sammenligne voksne og fosterets epicardial celle atferd.
Den største fordelen med denne protokollen er bruk av menneskelige epicardial materiale, som ikke har blitt grundig undersøkt. Viktigere, gir beskrevet isolasjon og celle kultur protokollen en enkelt uniform metode til å utlede både fosterets og voksen brolegge EPDCs, aktivere en direkte sammenligning mellom disse to cellen kilder. I tillegg, siden epicardium er isolert basert på beliggenheten, er det sikret at cellene er faktisk epicardially avledede17.
Mens menneskelig EPDC isolasjon metoder har blitt opprettet tidligere, stole disse meste på utvekst protokoller der stykker av hjerte- eller epicardial vev er belagt på en celle kultur parabol18,19. Denne tilnærmingen velger dermed spesielt for celler som delvis mister deres epithelial fenotypen for å overføre, og det er flere liggende å gjennomgå spontan EMT. I gjeldende protokollen behandles først til epicardium i en enkelt celle løsning som kan de isolerte EPDCs å opprettholde sin epithelial tilstand. Denne metoden gir derfor en solid i vitro modell for å studere epicardial EMT.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her beskriver vi en detaljert protokollen å isolere og kultur primære epicardial celler avledet fra menneskelige voksne og fosterets hjerte. Omfattende karakteristikk av disse cellene har vært publisert tidligere17. Vi har vist at begge celletyper kan opprettholdes som brosteinsbelagte-lignende epitelceller når kultivert med den ALK5 kinase inhibitor SB431542. EMT er en integrert del av epicardial aktivisering i vivo under både utvikling og etter skade responsen. EMT kan studeres ved…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskningen er støttet av The Netherlands Organisation for vitenskapelig forskning (NWO) (VENI 016.146.079) og en LUMC forskningsstipend både AMS, og LUMC Bontius Stichting (MJG).
Materials
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium + GlutaMAX | Gibco | 21885-025 | |
| Medium 199 | Gibco | 31150-022 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| Trypsin 0.25% | Invitrogen | 25200-056 | |
| Penicillin G sodium salt | Roth | HP48 | |
| Streptomycin sulphate | Roth | HP66 | |
| Trypsin 1:250 from bovine pancreas | Serva | 37289 | |
| EDTA | Sigma | E4884 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Culture plates 6 well | Greiner bio-one | 657160 | |
| Culture plates 12 well | Corning | 3512 | |
| Culture plates 24 well | Greiner bio-one | 662160 | |
| SB 431542 | Tocris | 1614 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Merck | 102931 | |
| 100-1000µL Filtered Pipet Tips | Corning | 4809 | |
| 10-ml pipet | Greiner bio-one | 607180 | |
| 5-ml pipet | Greiner bio-one | 606180 | |
| Cell culture dish 100/20 mm | Greiner bio-one | 664160 | |
| PBS | Gibco | 10010056 | Or home-made and sterilized |
| Eppendorf tubes 1.5 mL | Eppendorf | 0030120086 | |
| 15-ml centrifuge tubes | Greiner bio-one | 188271 | |
| 50-ml centrifuge tubes | Greiner bio-one | 227261 | |
| 10 mL Syringe | Becton Dickinson | 305959 | |
| Needles 19 Gauge | Becton Dickinson | 301700 | |
| Needles 21 Gauge | Becton Dickinson | 304432 | |
| EASYstrainer Cell Sieves, 100 µm | Greiner bio-one | 542000 | |
| TGFβ3 | R&D systems | 243-B3 | |
| Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle | Sigma | A2547 | |
| Anti-Mouse Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A31570 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen | A12379 | |
| Equipment | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pipet P1,000 | Gilson | F123602 | |
| Pipet controller | Integra | 155 015 | |
| Stereomicroscope | Leica | M80 | |
| Inverted Light Microscope | Olympus | CK2 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 | |
| Waterbath | GFL | 1083 |
References
- Smits, A. M., Dronkers, E., Goumans, M. J. The epicardium as a source of multipotent adult cardiac progenitor cells: Their origin, role and fate. Pharmacological research. 127, 129-140 (2017).
- Risebro, C. A., Vieira, J. M., Klotz, L., Riley, P. R. Characterisation of the human embryonic and foetal epicardium during heart development. Development. 142 (21), 3630-3636 (2015).
- Zhou, B., Ma, Q., et al. Epicardial progenitors contribute to the cardiomyocyte lineage in the developing heart. Nature. 454 (7200), 109-113 (2008).
- Smits, A., Riley, P. Epicardium-Derived Heart Repair. Journal of Developmental Biology. 2 (2), 84-100 (2014).
- Chen, T. H. P., Chang, T. C., et al. Epicardial Induction of Fetal Cardiomyocyte Proliferation via a Retinoic Acid-Inducible Trophic Factor. Developmental Biology. 250 (1), 198-207 (2002).
- Pennisi, D. J., Ballard, V. L. T., Mikawa, T. Epicardium is required for the full rate of myocyte proliferation and levels of expression of myocyte mitogenic factors FGF2 and its receptor, FGFR-1, but not for transmural myocardial patterning in the embryonic chick heart. Developmental Dynamics. 228 (2), 161-172 (2003).
- Lavine, K. J., Yu, K., et al. Endocardial and epicardial derived FGF signals regulate myocardial proliferation and differentiation in vivo. Developmental Cell. 8 (1), 85-95 (2005).
- Stuckmann, I., Evans, S., Lassar, A. B. Erythropoietin and retinoic acid, secreted from the epicardium, are required for cardiac myocyte proliferation. Developmental biology. 255 (2), 334-349 (2003).
- Männer, J., Schlueter, J., Brand, T. Experimental analyses of the function of the proepicardium using a new microsurgical procedure to induce loss-of-proepicardial-function in chick embryos. Developmental Dynamics. 233 (4), 1454-1463 (2005).
- Weeke-Klimp, A., Bax, N. A. M., et al. Epicardium-derived cells enhance proliferation, cellular maturation and alignment of cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 49 (4), 606-616 (2010).
- Eralp, I., Lie-Venema, H., et al. Coronary Artery and Orifice Development Is Associated With Proper Timing of Epicardial Outgrowth and Correlated Fas Ligand Associated Apoptosis Patterns. Circulation Research. 96 (5), (2005).
- Kelder, T. P., Duim, S. N., et al. The epicardium as modulator of the cardiac autonomic response during early development. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 89, 251-259 (2015).
- van Wijk, B., Gunst, Q. D., Moorman, A. F. M., van den Hoff, M. J. B. Cardiac regeneration from activated epicardium. PloS one. 7 (9), e44692 (2012).
- Zhou, B., Honor, L. B., et al. Adult mouse epicardium modulates myocardial injury by secreting paracrine factors. The Journal of clinical investigation. 121 (5), 1894-1904 (2011).
- Smart, N., Bollini, S., et al. De novo cardiomyocytes from within the activated adult heart after injury. Nature. 474 (7353), 640-644 (2011).
- Zangi, L., Lui, K. O., et al. Modified mRNA directs the fate of heart progenitor cells and induces vascular regeneration after myocardial infarction. Nature Biotechnology. 31 (10), 898-907 (2013).
- Moerkamp, A. T., Lodder, K., et al. Human fetal and adult epicardial-derived cells: a novel model to study their activation. Stem Cell Research & Therapy. 7 (1), 1-12 (2016).
- Clunie-O’Connor, C., Smits, A. M., et al. The Derivation of Primary Human Epicardium-Derived Cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 35, 2C.5.1-2C.5.12 (2015).
- Van Tuyn, J., Atsma, D. E., et al. Epicardial Cells of Human Adults Can Undergo an Epithelial-to- Mesenchymal Transition and Obtain Characteristics of Smooth Muscle Cells In Vitro. Stem Cells. 25 (2), 271-278 (2007).
- Bax, N. A. M., van Oorschot, A. A. M., et al. In vitro epithelial-to-mesenchymal transformation in human adult epicardial cells is regulated by TGFβ-signaling and WT1. Basic research in cardiology. 106 (5), 829-847 (2011).
- Chechi, K., Richard, D. Thermogenic potential and physiological relevance of human epicardial adipose tissue. International Journal of Obesity Supplements. 5 (Suppl 1), S28-S34 (2015).
