Epicardium spiller en afgørende rolle i udviklingen og reparation af hjertet ved at give celler og vækstfaktorer Myokardie væg. Her, beskriver vi en metode til at kultur menneskelige primære epikardielle celler, der giver mulighed for undersøgelse og sammenligning af deres udviklingsmæssige og voksen egenskaber.
Epicardium, en epitelcelle lag dækker myokardiet, har en væsentlig rolle under hjerte udvikling, samt reparation svar af hjertet efter iskæmisk skade. Når aktiveret, gennemgå epikardielle celler en proces kendt som epitelial mesenchymale overgangen (EMT) at levere celler til regenererende myokardiet. Desuden bidrager epicardium via sekretion af væsentlige paracrine faktorer. For fuldt ud at værdsætte epicardium regenerativ potentiale, er en menneskelig celle model påkrævet. Her skitsere vi en roman celle kultur model for at udlede primære epikardielle afledte celler (EPDCs) fra menneskelige voksen og fostrets hjerte væv. For at isolere EPDCs, er epicardium dissekeret fra ydersiden af hjertet modellen og forarbejdet til en enkelt cellesuspension. Næste, EPDCs er belagte og kulturperler i EPDC medium indeholdende ALK 5-kinase inhibitor SB431542 at opretholde deres epitelial fænotype. EMT er foranlediget ved stimulation med TGFβ. Denne metode giver mulighed for undersøgelse af processen med menneskelige epikardielle EMT i kontrollerede omgivelser, for første gang, og gør det lettere at få mere indsigt i secretome af EPDCs, der kan støtte hjerte regenerering. Desuden, denne ensartede fremgangsmåde giver mulighed for direkte sammenligning af menneskelig voksne og føtale epikardielle adfærd.
Epicardium, en enkelt celle epitel lag at konvolutter hjertet, er af vital betydning for udvikling af hjerte og reparation (gennemgik i Smits et al. 1). udviklingshæmmede, epicardium udspringer af proepicardial orglet, en lille struktur placeret i bunden af den udvikle hjerte. Omkring udviklingsmæssige dag E9.5 i mus, og 4 uger efter undfangelse i menneskelige begynde cellerne at migrere fra denne blomkål struktur og dække den udvikle myokardiet2. Når en enkelt epitelcelle lag er dannet, gennemgår en del af de epikardielle celler epitelial mesenchymale overgangen (EMT). Under EMT, celler mister deres epitelial egenskaber, såsom celle-celle sammenvoksninger, og opnå en mesenchymale fænotype, som giver dem evnen til at overflytte til udviklingslandene myokardiet. De dannede epikardielle afledte celler (EPDCs) kan udvikle sig til flere hjerte celletyper, herunder fibroblaster, glatte muskelceller, og potentielt cardiomyocytes og endotelceller3, selv om differentiering af sidstnævnte to celle befolkningsgrupper er stadig genstand for debat (gennemgik i Smits et al. 4). Derudover epicardium giver lærerigt paracrine signaler at myokardiet at regulere dens vækst og vascularization5,6,7,8. Flere undersøgelser har vist, at nedsat epikardielle dannelse fører til udviklingsmæssige mangler i hjertemuskulaturen9,10, vaskulatur11og varmeledning system12, understreger væsentlige bidrag af epicardium til dannelsen af hjertet.
Selv om voksen midt i epicardium er til stede som en sovende lag, bliver det genaktiveret ved iskæmi13. Epikardielle reaktivering efter skade sammenfatter flere af processerne beskrevet for kardiale udvikling, herunder spredning og EMT14, omend mindre effektivt. Interessant, selv om de nøjagtige mekanisme ikke er fuldt forstået, de epikardielle bidrag til at reparere kan forbedres ved behandling med fxThymosin β415 eller ændret VEGF-A mRNA16, hvilket resulterer i afhjælpes hjerte funktionen efter myokardieinfarkt. Epicardium er derfor en interessant celle kilden øge endogen reparation af de sårede hjerte.
Mekanismer af cardiac udvikling er ofte sammenfattet under skade, dog i en mindre effektiv måde. På jagt efter epikardielle aktivatorer er det altafgørende, at vi kan bestemme og sammenligne den fulde kapacitet af den føtale og voksne epicardium. Derudover fra et terapeutisk synspunkt er det vigtigt, at ud over dyreforsøg, vi udvide viden om reaktion af den menneskelige epicardium. Her, beskriver vi en metode til at isolere og kultur menneskelige voksen og fostrets epikardielle afledte celler (EPDCs) i en epitel-celle-lignende morfologi og fremkalde EMT. Med denne model, vi sigter mod at undersøge og sammenligne voksne og føtale epikardielle celle adfærd.
Den største fordel ved denne protokol er brug af menneskelige epikardielle materiale, som ikke er blevet grundigt undersøgt. Vigtigere, giver beskrevet isolation og celle kultur protokollen en enkelt ensartet metode til at udlede begge føtale og voksne cobble EPDCs, gør det muligt for en direkte sammenligning mellem disse to celle kilder. Derudover da epicardium er isoleret baseret på dens placering, er det sikret, at cellerne er faktisk epicardially afledte17.
Mens menneskelige EPDC isolation metoder har oprettet tidligere, regne disse for det meste udvækst protokoller hvor stykker af hjerte- eller epikardielle væv er belagt på en celle kultur parabol18,19. Denne tilgang markerer dermed specielt til celler der delvist mister deres epitelial fænotype for at migrere, og der er mere tilbøjelige til at gennemgå spontan EMT. I den nuværende protokol behandles epicardium først i en enkelt celle løsning, som giver mulighed for de isolerede EPDCs til at opretholde deres epitelial tilstand. Denne metode giver derfor et solidt in vitro- model for at studere epikardielle EMT.
Her beskriver vi en detaljeret protokol til at isolere og kultur primære epikardielle celler stammer fra menneskelige voksne og føtale hjerter. Omfattende karakterisering af disse celler har været tidligere udgivet17. Vi har vist, at begge celletyper kan opretholdes som brostensbelagte-lignende epitelceller når kulturperler med ALK5 kinase inhibitor SB431542. EMT er en integreret del af epikardielle aktivering i vivo under både udvikling og efter skade svar. EMT kan studeres ved hjæ…
The authors have nothing to disclose.
Denne forskning er støttet af den nederlandske organisation for videnskabelig forskning (NWO) (VENI 016.146.079) og en LUMC Research fellowship både til AMS og LUMC Bontius Stichting (MJG).
Dulbecco’s modified Eagle’s medium + GlutaMAX | Gibco | 21885-025 | |
Medium 199 | Gibco | 31150-022 | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
Trypsin 0.25% | Invitrogen | 25200-056 | |
Penicillin G sodium salt | Roth | HP48 | |
Streptomycin sulphate | Roth | HP66 | |
Trypsin 1:250 from bovine pancreas | Serva | 37289 | |
EDTA | Sigma | E4884 | |
Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
Culture plates 6 well | Greiner bio-one | 657160 | |
Culture plates 12 well | Corning | 3512 | |
Culture plates 24 well | Greiner bio-one | 662160 | |
SB 431542 | Tocris | 1614 | |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Merck | 102931 | |
100-1000µL Filtered Pipet Tips | Corning | 4809 | |
10-ml pipet | Greiner bio-one | 607180 | |
5-ml pipet | Greiner bio-one | 606180 | |
Cell culture dish 100/20 mm | Greiner bio-one | 664160 | |
PBS | Gibco | 10010056 | Or home-made and sterilized |
Eppendorf tubes 1.5 mL | Eppendorf | 0030120086 | |
15-ml centrifuge tubes | Greiner bio-one | 188271 | |
50-ml centrifuge tubes | Greiner bio-one | 227261 | |
10 mL Syringe | Becton Dickinson | 305959 | |
Needles 19 Gauge | Becton Dickinson | 301700 | |
Needles 21 Gauge | Becton Dickinson | 304432 | |
EASYstrainer Cell Sieves, 100 µm | Greiner bio-one | 542000 | |
TGFβ3 | R&D systems | 243-B3 | |
Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle | Sigma | A2547 | |
Anti-Mouse Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A31570 | |
Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen | A12379 | |
Equipment | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Pipet P1,000 | Gilson | F123602 | |
Pipet controller | Integra | 155 015 | |
Stereomicroscope | Leica | M80 | |
Inverted Light Microscope | Olympus | CK2 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5702 | |
Waterbath | GFL | 1083 |