Isolering och kultur av primära epikardiell celler från mänskliga vuxen och fostrets hjärta exemplar
Summary
Epicardium spelar en avgörande roll i utvecklingen och reparation av hjärtat genom att tillhandahålla celler och tillväxtfaktorer i hjärtinfarkt väggen. Här, beskriver vi en metod för att odla mänskliga primära epikardiell celler som möjliggör studie och jämförelse av deras utvecklings- och vuxen egenskaper.
Abstract
Epicardium, en epitelial cell lager som täcker myokardiet, har en viktig roll under hjärt utveckling, samt i reparation svaret av hjärtat efter ischemisk skada. När aktiverad, genomgå epikardiell celler en process som kallas epitelial mesenkymala övergång (EMT) att tillhandahålla celler att regenerera myokardiet. Dessutom bidrar epicardium via utsöndring av väsentliga parakrin faktorer. För att fullt uppskatta epicardium regenerativ potential, krävs en mänsklig cell modell. Här beskriver vi en roman cell kultur modell för att härleda primära epikardiell härledda celler (EPDCs) från mänskliga vuxen och fostrets hjärtvävnad. För att isolera EPDCs, är epicardium dissekeras från utsidan av hjärtat preparatet och bearbetas till en enda cellsuspension. EPDCs är nästa, Pläter och odlade i EPDC medium som innehåller det ALK 5-tyrosinkinashämmare SB431542 att upprätthålla deras epitelial fenotyp. EMT induceras genom stimulering med TGFβ. Denna metod möjliggör, för första gången, studiet av processen för mänskliga epikardiell EMT i en kontrollerad miljö, och underlättar att få mer insikt i secretome av EPDCs som kan hjälpa hjärtat regenerering. Dessutom tillåter denna enhetliga strategi för direkt jämförelse av vuxen och fostrets epikardiell människauppförande.
Introduction
Epicardium, en encellig epiteliala lagret att kuvert hjärta, är av avgörande betydelse för hjärt utveckling och reparation (recenserade i Smits o.a. 1). utvecklingsmässigt, epicardium uppstår från det proepicardial orgeln, en liten struktur som ligger vid basen av det framkallande hjärtat. Runt utvecklande dag E9.5 mus, och 4 veckor efter befruktningen i mänskliga börjar celler migrera från denna blomkål struktur och täcka den framkallande myokardiet2. När ett enda epitelial cell-lager bildas, genomgår en del av epikardiell cellerna epitelial mesenkymala övergång (EMT). Under EMT, celler förlorar sin epitelial egenskaper, såsom cell cell sammanväxningar, och få en mesenkymala fenotyp som ger dem möjlighet att migrera till utveckla myokardiet. De bildade epikardiell härledda cellerna (EPDCs) kan differentieras till flera hjärt celltyper inklusive fibroblaster, glatta muskelceller, och potentiellt hjärtmuskelceller och endotelceller3, även om differentiering av de senare två cell populationer är fortfarande föremål för debatt (recenserade i Smits o.a. 4). epicardium ger dessutom lärorikt parakrin signaler till hjärtmuskeln att reglera dess tillväxt och vaskularisering5,6,7,8. Flera studier har visat att nedsatt epikardiell bildandet leder till defekter i hjärtmuskeln9,10, vaskulatur11och överledning system12, betonar grundläggande bidrag till epicardium till bildandet av hjärtat.
Även i vuxen hjärtat epicardium är närvarande som ett vilande lager, blir det reaktiveras vid ischemi13. Epikardiell reaktivering efter skada recapitulates flera av processerna som beskrivs för hjärt utveckling, inklusive spridning och EMT14, om än mindre effektivt. Intressant, även om den exakta mekanismen inte är helt klarlagt, epikardiell bidrag att reparera kan förbättras genom behandling med, t.ex., Thymosin β415 eller ändras VEGF-A mRNA16, vilket resulterar i förbättras hjärt funktion efter hjärtinfarkt. Epicardium anses därför en intressant cell källa att öka endogena reparation av skadade hjärtat.
Mekanismer för hjärt utveckling är ofta återgetts under skada, men i ett mindre effektivt sätt. På jakt efter epikardiell aktivatorer är det avgörande att vi kan avgöra och jämföra den fetala och vuxen epicardium hela kapacitet. Dessutom från en terapeutisk synvinkel är det viktigt att, förutom djurförsök, vi utvidga kunskap om den mänskliga epicardium svar. Här, beskriver vi en metod att isolera och kultur mänskliga vuxen och fostrets epikardiell härledda celler (EPDCs) i en epitelial cell-morfologi och inducera EMT. Med denna modell vill vi utforska och jämför vuxen och fostrets epikardiell cell beteende.
Den största fördelen med detta protokoll är användningen av mänskliga epikardiell material, som inte har undersökts grundligt. Allt erbjuder beskrivs isolering och cell kultur protokollet en enda enhetlig metod för att härleda både fetal och vuxen cobble EPDCs, möjliggör en direkt jämförelse mellan dessa två cell källor. Dessutom, eftersom epicardium är isolerade baserat på dess plats, är det säkerställt att cellerna är faktiskt epicardially härledda17.
Medan mänskliga EPDC isoleringsmetoder har fastställts tidigare, åberopa dessa mestadels utväxt protokoll där bitar av hjärt- eller epikardiell vävnad är pläterade på en cell kultur skålen18,19. Denna metod väljer därmed specifikt för celler som delvis förlora sin epitelial fenotyp för att migrera, och som är mer benägna att genomgå spontan EMT. I det nuvarande protokollet bearbetas epicardium först till en enda cell lösning som tillåter de isolerade EPDCs att upprätthålla deras epitelial tillstånd. Denna metod ger därför en solid in vitro- modell för att studera epikardiell EMT.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här beskriver vi ett detaljerat protokoll att isolera och kultur primära epikardiell celler härrör från mänskliga vuxen och fostrets hjärtan. Omfattande karakterisering av dessa celler har funnits tidigare publicerade17. Vi har visat att båda celltyper kan upprätthållas som kullersten-liknande epitelceller när odlade med den ALK5 tyrosinkinashämmare SB431542. EMT är en integrerad del av epikardiell aktivering i vivo under både utveckling och efter skada svar. EMT kan studera…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning stöds av den nederländska organisationen för vetenskaplig forskning (NWO) (VENI 016.146.079) och en LUMC forskning gemenskap både till AMS och LUMC Bontius Stichting (MJG).
Materials
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium + GlutaMAX | Gibco | 21885-025 | |
| Medium 199 | Gibco | 31150-022 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| Trypsin 0.25% | Invitrogen | 25200-056 | |
| Penicillin G sodium salt | Roth | HP48 | |
| Streptomycin sulphate | Roth | HP66 | |
| Trypsin 1:250 from bovine pancreas | Serva | 37289 | |
| EDTA | Sigma | E4884 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Culture plates 6 well | Greiner bio-one | 657160 | |
| Culture plates 12 well | Corning | 3512 | |
| Culture plates 24 well | Greiner bio-one | 662160 | |
| SB 431542 | Tocris | 1614 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Merck | 102931 | |
| 100-1000µL Filtered Pipet Tips | Corning | 4809 | |
| 10-ml pipet | Greiner bio-one | 607180 | |
| 5-ml pipet | Greiner bio-one | 606180 | |
| Cell culture dish 100/20 mm | Greiner bio-one | 664160 | |
| PBS | Gibco | 10010056 | Or home-made and sterilized |
| Eppendorf tubes 1.5 mL | Eppendorf | 0030120086 | |
| 15-ml centrifuge tubes | Greiner bio-one | 188271 | |
| 50-ml centrifuge tubes | Greiner bio-one | 227261 | |
| 10 mL Syringe | Becton Dickinson | 305959 | |
| Needles 19 Gauge | Becton Dickinson | 301700 | |
| Needles 21 Gauge | Becton Dickinson | 304432 | |
| EASYstrainer Cell Sieves, 100 µm | Greiner bio-one | 542000 | |
| TGFβ3 | R&D systems | 243-B3 | |
| Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle | Sigma | A2547 | |
| Anti-Mouse Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A31570 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen | A12379 | |
| Equipment | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pipet P1,000 | Gilson | F123602 | |
| Pipet controller | Integra | 155 015 | |
| Stereomicroscope | Leica | M80 | |
| Inverted Light Microscope | Olympus | CK2 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 | |
| Waterbath | GFL | 1083 |
References
- Smits, A. M., Dronkers, E., Goumans, M. J. The epicardium as a source of multipotent adult cardiac progenitor cells: Their origin, role and fate. Pharmacological research. 127, 129-140 (2017).
- Risebro, C. A., Vieira, J. M., Klotz, L., Riley, P. R. Characterisation of the human embryonic and foetal epicardium during heart development. Development. 142 (21), 3630-3636 (2015).
- Zhou, B., Ma, Q., et al. Epicardial progenitors contribute to the cardiomyocyte lineage in the developing heart. Nature. 454 (7200), 109-113 (2008).
- Smits, A., Riley, P. Epicardium-Derived Heart Repair. Journal of Developmental Biology. 2 (2), 84-100 (2014).
- Chen, T. H. P., Chang, T. C., et al. Epicardial Induction of Fetal Cardiomyocyte Proliferation via a Retinoic Acid-Inducible Trophic Factor. Developmental Biology. 250 (1), 198-207 (2002).
- Pennisi, D. J., Ballard, V. L. T., Mikawa, T. Epicardium is required for the full rate of myocyte proliferation and levels of expression of myocyte mitogenic factors FGF2 and its receptor, FGFR-1, but not for transmural myocardial patterning in the embryonic chick heart. Developmental Dynamics. 228 (2), 161-172 (2003).
- Lavine, K. J., Yu, K., et al. Endocardial and epicardial derived FGF signals regulate myocardial proliferation and differentiation in vivo. Developmental Cell. 8 (1), 85-95 (2005).
- Stuckmann, I., Evans, S., Lassar, A. B. Erythropoietin and retinoic acid, secreted from the epicardium, are required for cardiac myocyte proliferation. Developmental biology. 255 (2), 334-349 (2003).
- Männer, J., Schlueter, J., Brand, T. Experimental analyses of the function of the proepicardium using a new microsurgical procedure to induce loss-of-proepicardial-function in chick embryos. Developmental Dynamics. 233 (4), 1454-1463 (2005).
- Weeke-Klimp, A., Bax, N. A. M., et al. Epicardium-derived cells enhance proliferation, cellular maturation and alignment of cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 49 (4), 606-616 (2010).
- Eralp, I., Lie-Venema, H., et al. Coronary Artery and Orifice Development Is Associated With Proper Timing of Epicardial Outgrowth and Correlated Fas Ligand Associated Apoptosis Patterns. Circulation Research. 96 (5), (2005).
- Kelder, T. P., Duim, S. N., et al. The epicardium as modulator of the cardiac autonomic response during early development. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 89, 251-259 (2015).
- van Wijk, B., Gunst, Q. D., Moorman, A. F. M., van den Hoff, M. J. B. Cardiac regeneration from activated epicardium. PloS one. 7 (9), e44692 (2012).
- Zhou, B., Honor, L. B., et al. Adult mouse epicardium modulates myocardial injury by secreting paracrine factors. The Journal of clinical investigation. 121 (5), 1894-1904 (2011).
- Smart, N., Bollini, S., et al. De novo cardiomyocytes from within the activated adult heart after injury. Nature. 474 (7353), 640-644 (2011).
- Zangi, L., Lui, K. O., et al. Modified mRNA directs the fate of heart progenitor cells and induces vascular regeneration after myocardial infarction. Nature Biotechnology. 31 (10), 898-907 (2013).
- Moerkamp, A. T., Lodder, K., et al. Human fetal and adult epicardial-derived cells: a novel model to study their activation. Stem Cell Research & Therapy. 7 (1), 1-12 (2016).
- Clunie-O’Connor, C., Smits, A. M., et al. The Derivation of Primary Human Epicardium-Derived Cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 35, 2C.5.1-2C.5.12 (2015).
- Van Tuyn, J., Atsma, D. E., et al. Epicardial Cells of Human Adults Can Undergo an Epithelial-to- Mesenchymal Transition and Obtain Characteristics of Smooth Muscle Cells In Vitro. Stem Cells. 25 (2), 271-278 (2007).
- Bax, N. A. M., van Oorschot, A. A. M., et al. In vitro epithelial-to-mesenchymal transformation in human adult epicardial cells is regulated by TGFβ-signaling and WT1. Basic research in cardiology. 106 (5), 829-847 (2011).
- Chechi, K., Richard, D. Thermogenic potential and physiological relevance of human epicardial adipose tissue. International Journal of Obesity Supplements. 5 (Suppl 1), S28-S34 (2015).
