Summary
여기, 우리는 공간 계량 폐 결핵 육아 내 마약 배포판에 레이저 캡처 서 LC/MS 분석과 함께 사용 하 여 프로토콜을 설명 합니다. 접근은 광범위 한 적응성 높은 공간 세부 사항에서 조직 내의 약물 농도 측정 하는 있다.
Abstract
결핵은 여전히 병 적 상태와 사망률 전세계의 주요 원인. 기존 약물 regimens 개선 및 새로운 치료제의 개발 시급히 필요 됩니다. 도달 하 고 저조한 나가도록 괴 지역 (caseum) 폐 육아의 박테리아 살 균 약 복용된 결핵 약의 능력은 성공적인 치료 적 개입에 대 한 중요 합니다. 효과적인 치료 regimens 따라서 유리한 caseum 침투 특성을 가진 약물을 포함 해야 합니다. 생물 조직에 마약 수준 측정을 위한 현재 LC/MS 방법 제한 된 해상도 기능, 그 안에 발견 같은 작은 조직 구획 내에서 절대 약물 농도 정확 하 게 결정 하 고 어려운 괴 사 성 육아입니다. 여기 우리는 LC/MS 정량화와 병 적 별개 조직 영역의 레이저 캡처 기정 (LCM)를 결합 하는 프로토콜을 제시. 이 기술은 육아 caseum, 세포 병 변 및 uninvolved 폐 조직 내 약물의 절대 정량화 하며, 따라서, 정확 하 게 살 균 농도 달성 되 고 있는지 여부를 결정 합니다. 결핵 연구, 뿐만 아니라 기술 병 조직에 약물의 공간 해결 정량화에 대 한 많은 잠재적인 응용 프로그램을 하고있다.
Introduction
공간을 해결 하 고 마약 수준 계량 능력 결핵 약물 농도1살 균에서 폐 병 변 내의 박테리아 모집단에 도달 여부를 결정 하기 위한 중요 한 요구 사항입니다. 특별 한 중요성의 일반적으로 이십시오의 가장 높은 수를 포함 하 고 마약 vascularization의 부재 때문에 액세스할 수 있습니다 (caseum 라고) 하는 병 변의 괴 핵심으로 약물 침투를 결정 이다.
삭제 폐 병 변의 균질 화를 포함 하는 병 변 침투를 평가 하기 위해 전통적인 방법 뒤에 용 매 추출 및 액체 착 색 인쇄기 질량 분석 (LC/MS) 분석, 매우 민감하고의 마약에 대 한 선택적 관심입니다. 그러나,이 메서드는 원래 무 균된 조직의 크기를 제한 하는 불 쌍 한 공간 정보를 제공 합니다. 질량 분석 기반 이미징 등 방법을 매트릭스 보조 레이저 탈 착 이온화 (MALDI)2,3, desorption 분무 이온화 (DESI)4 또는 표면 추출 액체 강화 된5, 6 높은 공간 해결 이미징 기능을 제공 하지만 직접 정량화는 매우 도전적인 또는 이기종 이온 억제 효과 및 다양 한 셀에서 분석의 다른 추출 효율 불가능 한 수 또는 조직의 종류7. 또한, 가장 직접적인 조직 MS 이미징 접근은 본질적으로 생 종 이온화와 조직에서 약물의 낮은 용 매 추출 효율에 대 한 경쟁의 컬럼에 분리의 부족 때문에 LC/MS 보다 덜 민감한.
레이저 캡처 기정 (LCM) LC/MS 분석을 함께 정기적으로 격리 및 proteomic 연구8,9 에 대 한 뚜렷한 조직 지역 특성화에 적용 되었으며 최근 약물 정량화에 대 한 활용에 복용 동물 조직10. 여기 선물이 적용 LCM (LCM-LC/MS) LC/MS 분석을 결합해 독특한 육아 구획 내에서 안티-결핵 약물을 계량 하는 최적화 된 프로토콜. 레이저 캡처 서 과정에서 UV 레이저는 현미경 목표는 사용자에 의해 정의 된 경로 따라 원하는 조직 영역을 분리 하 고 조직 섹션에를 통해 집중 된다. 중력 지원 lcm (이 연구에 사용 하는 기법), 조직 섹션 얇은 고분자 막 슬라이드 (PET 또는 펜)에 탑재 되 고 조직 슬라이드 아래 sited 컬렉션 튜브 캡에 캡처됩니다. 마약 삭제 조직에서 추출 되 고 표준 LC/MS 접근을 사용 하 여 계량. 수집 하는 데 필요한 조직의 양은 궁극적으로 조직에 존재 하는 약물의 예상된 농도 및 LC/MS 방법의 감도에서 결정 됩니다. 대부분의 약물 치료 수준에서 약을 복용 하 고 조직의 일상적인 트리플 4 극 자 질량 분석기, 3 백만 µ m2 (3 m m2)를 사용 하 여 분석의 분석에 대 한 표면적은 충분 합니다.
이 프로토콜 공간 프로 파일링의 강력한 조합을 설명 하 고 전체 정량화 LCM-LC/MS, 결핵 육아의 모든 구획 내에서 절대 약물 농도 제공 제공. 기술은 또한 중요 한 약물 발견과 개발 정보를 제공 하 많은 다른 병에 걸리는 조직에 약물 농도 결정에 적용할 수 있습니다.
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Protocol
모든 동물 연구 관리 및 승인 기관 동물 관리에서 국립 보건원의 실험 동물의 사용 및 사용 위원회의 NIAID (NIH), 베 데스 다, 메릴랜드에 대 한 가이드에 따라 수행 했다
1. 동물 실험 및 조직 컬렉션
이 섹션은 프로토콜의 동물 절차 및 Biosafety 수준 3 (BSL3) 조건 하에서 샘플 컬렉션을 설명합니다. 토끼에서 프로토콜 되었습니다 결핵균 에 어로 졸 감염 절차 및 약물 관리의 상세한 프로토콜 기술 이전11,12.
- 뉴질랜드 백색 토끼 (남녀 4-5 개월에) M. 결핵 HN878 감염 앞11에서 설명한 코 전용에 어로 졸 시스템을 사용 하 여.
- 기본 루트를 통해 선택한 마약 (여기에 제시 된 예에서 Ethambutol)를 관리 하 고 2, 6, 및 24 시간 관리 다음에 동물을 안락사. 첫째, 5 mg/kg에서 35 mg/kg 및 Xylazine에서 케 타 민의 근육 주사로 토끼를 anesthetize. 10 분 기다립니다 고 적절 한 anesthetization 꼬리를 꼬 집 고 부드럽게 눈을 감동 합니다. 아무 반응 인 경우에 1 mL/4.5 k g 2 mL의 멸 균 식 염 수에 pentobarbital 및 phenytoin ( 재료의 표참조)의 정 맥 행정에 의해 안락사.
참고: 이러한 timepoints 최적의 Ethambutol pharmacokinetic 프로 파일 커버 하 고 다른 연구 약물에 대 한 조정/최적화 필요할 수 있습니다. - 가슴 구멍에서 폐를 제거, resect uninvolved 폐 조직 (앞에서 설명한3) 주변에 포함 된 큰 괴 사 성 육아 종을 포함 하는 폐 생 검 겸 자가 위, 또는 메스 사용. 괴 사 성 육아 종을 표시에 베이 지 컬러와 일반적으로 약간 주변 레드/핑크 색 폐에서 내 다. 쉽게 cryosectioning 촉진 하 biopsies 2 x 1.5 x 1.5 c m 보다 큰 인지 확인 합니다.
- 집게를 사용 하 여 용지함의 기지와 직접 접촉에서 사전 분류 cryomold 트레이 원하는 절단 표면에 생을 놓습니다. 동결, 후이 평평한 표면에서 cryosections 삭감 될 것 이다 제공할 것입니다.
- 액체 질소 증기에 생을 고정 합니다. 액체 질소와 2 인치는 깊이를 스티로폼 컨테이너와 금속 와이어 튜브 랙 배치. 랙 평평한 표면 조직 트레이 배치 됩니다 제공 하는 액체 질소의 표면 위에 내 다 한다. 스티로폼 용기에 다시 뚜껑을 배치 하 고 10 분 완전히 동결에 대 한 조직을 두십시오.
- 조직 트레이 제거, 신속 하 게 알루미늄 필름에 포장 및 개별적으로 레이블이 resealable 비닐 봉투 및 도장 장소. -80 ° C 냉동 고 스토리지에 대 한 전송.
참고: 단계 1.1-1.6 BSL3 조건 (모든 동물 작품을 포함 한 감염된 장기 및 조직의 처리)에서 수행 됩니다. 감마 비추는 BSL3 제약 이외의 처리를 3 Megarads에서 폐 생 검. 레이저 캡처 기정 unsterilized 조직에 시설 안전 프로토콜 승인 하는 경우에 BLS3 내에서 수행할 수 있습니다. 그러나,이 프로토콜의 나머지 다운스트림 처리를 BSL-2 시설에 설명합니다.
2. 조직 단면
- 원하는 절삭 온도 cryostat를 설정 합니다. cryostat에 감마 방사선 폐 생 검-80 ° C 저장에서 전송 하 고 equilibrate 조직 온도를 30 분 동안 둡니다. 참고:-22 ° C-20은 결핵 병 변 biopsies에 적합 합니다.
- 핀셋을 사용 하는 척을 조직의 기본 준수를 최적의 절삭 온도 접착제 (OCT)의 작은 금액을 사용 하 여 cryostat 척을 생 수정. 평평한 표면 (그는 cryomold의 접촉)는 절단을 위한 노출된 표면 조직을 방향을 정하십시오. 이 후속 질량 분석 분석을 방해할 수 있습니다 대로 OCT 조직 표면 오염 하지 않습니다 확인 합니다.
- 25 µ m 두께에 3 개의 직물 단면도 잘라내어 애완 동물 멤브레인 슬라이드에 탑재. 부드럽게 조직 섹션을 막 터치 하 고 제거 합니다. 너무 많은 압력을 적용 하는 경우 얇은 막 찢 어 수 있습니다.
- 장착이 되 고 조직 단면도의 청구와 가난한 접착 애완 동물 멤브레인에 발생 이전 슬라이드의 과도 한 처리를 하지 마십시오. 막 슬라이드 thaw 장착 및 성공적인 접착 막에 조직의 활성화를 위해 상 온에서 보관 됩니다 확인 하십시오.
- cryostat에서 슬라이드를 제거 하 고 3 분 동안 건조를 허용 합니다. LCM-LC/MS/MS 즉시 수행 되지 것입니다, 경우는 작은 밀폐 밀폐 가능한 봉투에 전송-80 ° C 저장까지 해 부에 필요한 슬라이드 봉인.
- 10-12 µ m와 thaw-마운트 되며 고 오신 (H & E) 얼룩 및 참조에 대 한 표준 유리 슬라이드에 인접 한 부분을 잘라. 추가 섹션 (결핵균 (MTB)를 시각화에 대 한 Ziehl-Niellsen) 같은 다른 원하는 histochemistry 얼룩에 대 한이 시간에서 잘릴 수 있다.
3입니다. 서
- -80 ° C 저장에서 슬라이드를 포함 하는 봉인된 봉투를 제거 하 고 5 분 동안 실내 온도 도달할 수 있도록.
참고: 차가운 슬라이드 즉시 실험실 분위기에 노출은, 조직을 응축, 코팅 될 것입니다 그리고 약물의 공간 무결성이 손상 될 수 있습니다. - 현미경 및 레이저 (레이저 필요 합니다 5-10 분 워밍업 절단 수 시작 하기 전에). 플랫 캡 0.20 mL PCR 튜브 홀더 로드.
- 가방에서 슬라이드를 제거 하 고 평판 스캐너를 사용 하 여 애완 동물 슬라이드에 조직 단면도의 광학 이미지.
- 슬라이드 슬라이드 홀더 (조직 면이 아래로)에 놓고 현미경 소프트웨어를 사용 하 여 관심사의 특정 육아 지역에 별도 컬렉션 튜브를 할당 합니다. 일반적으로, 이러한 'uninvolved 폐,' '세포 육아 종,' 되며 'caseum' (괴 사 성 센터), 하지만 수 있습니다 육아/생의 특정 병에 따라 다릅니다.
- 현미경 목표 X 5를 사용 하 여 조직에 초점. 이 확대는 두 세포 괴 사 성 육아 분야를 포함 하는 조직에 대 한 좋은 개요를 제공 해야 합니다. 소프트웨어에서 조직 아래 위치로 이동 하려면 'caseum'를 지정 하는 튜브를 선택 합니다.
- 해 부에 원하는 매개 변수를 입력 합니다. 25 µ m 두께 폐 섹션에 대 한 일반적인 설정은 레이저 전원 30, 15, 속도 및 조리개 35 (임의의 단위) 합니다. 그러나, 이러한 사용 하는 현미경 및 레이저의 나이 인해 전력 감소 잠재력에 따라 달라 집니다.
- ' 자유 그리기 ' 도구를 선택 하 고, 마우스 또는 터치 스크린 펜을 사용 하 여, 원하는 지역의 해 부에 대 한 개요. 지역의 표면 영역에에서 표시 됩니다. 500000 µ m2 (0.5 m m2) 쉽게 해 부를 촉진 하기 위해 선택된 영역을 유지. 해 부를 반복 하 여 튜브 모자에 총에서 3 백만 µ m2 (3 m m2)가 수집.
- 경우에, 해 부 지역 (예를 들면 때문에 정적 매력) 주변 막에 붙어 남아 고 컬렉션 모자에 빠지지 수 있습니다. 선택 하 고 소프트웨어 내에서 수동으로 제거 하 여 총 누적 노출 영역에서이 영역을 제거 합니다.
- '세포 병 변'에 대 한 모자를 선택 하 고 3 백만 µ m2 단계 3.7에서에서 설명한 동일한 프로세스를 사용 하 여 조직의 수집.
- 'Uninvolved 폐'에 대 한 모자를 선택 하 고 3 백만 µ m2 단계 3.7에서에서 설명한 동일한 프로세스를 사용 하 여 조직의 수집. 참고 uninvolved 폐 조직 bronchioles 및 치조 공간 포함. 주의 주의를 해 부에 대 한 정의 된 조직 영역에서 제외.
- 캡 홀더를 제거 하 고 신중 하 게 unclip, 인감 및 레이블 각 튜브. 항공 장애 등 공기 흐름 장애는 오프닝에서에서부터 주변에서 해 부 조직을 보호 합니다. 즉시, 해 부 조직 분석 또는-80 ° C에서 저장 하 고 처리 및 LCMS 분석 하기 전에 해 동.
4. 추출 및 LCMS 분석
- 1:1 이기/메탄올 Ethambutol d-10 내부 표준 포함의 추출 솔루션을 준비 합니다. 내부 표준, 사용 분석 약물의 안정적인 분류 형태 (중수소 라는 EMB이이 데모에서 사용)와 같은 동위 원소를 피하기 위해 충분 한 질량 변화와 크로스를 선택할 때 실정이 약물 및 표준 (일반적으로 최소 4 daltons) 사이 이야기 .
참고: homogenate 표준을 만들고 하는 매우 제한 된 제어 조직 때문에 어렵습니다 각 각각 조직 유형의 homogenate에서 표준 만들기. 아군된 homogenate 샘플에서 표준 만들기 하는 대신 표준 빈 조직과 함께 하 고 추출 화합물을 테스트를 추가 하 여 만들 수 있습니다. 연구 샘플 조직 단면도의 대상 볼륨을 일치 하는 homogenate에서 제어 조직의 볼륨 주어진된 농도에 있을 것 이라고 테스트 화합물의 금액와 직접 결합 된다. - 노출 영역 및 조직 단면도의 두께에 따라 대상된 조직 볼륨을 계산 하 고 표준 및 QC 샘플에 추가 되는 homogenate의 볼륨을 사용 하 여 homogenate에 대 한 필요한 희석 비율을 결정. 계산 25 µ m 두께와 homogenate의 2 µ L 볼륨 3 백만 µ m2 (3 m m2) 해 부 대상 지역에 대 한 아래 설명 됩니다.
- 제어 조직의 50 밀리 그램 무게 희석 PBS 버퍼를 추가 하 여 homogenate 재고를 준비 하는 조직 밀도 1g/mL의 가정 (26.67 homogenate 희석 요소를 사용 하 여 단계에서 계산한 4.2, 희석제는 1.283 mL). 구슬 구슬 균질 화기에 1750 rpm에서 5 분간 폐 조직 및 PBS 버퍼 구타에 의해 균질.
- 1:1 이기/물 솔루션 급상승 표준 곡선을 만드는 데에 1 mg/mL 마약 주식 농도 희석. 급상승 스파이크 볼륨 및 대상 조직 볼륨에 따라 표준 농도 결정 합니다. 그림된 예제를 100 ng/mL 10 µ L 스파이크 볼륨을 사용 하 여 표준입니다.
- Microdissected 조직-80 ° C 저장에서 포함 된 튜브를 제거 하 고 5 분 동안 실내 온도 도달할 수 있도록.
- Microdissected 조직을 포함 하는 튜브를 1:1 이기/물 솔루션의 10 µ L 및 PBS 버퍼의 2 µ L를 추가 합니다.
- 표준 곡선 및 품질 관리 관, 대 한 솔루션 제어 폐 homogenate의 2 µ L 요동의 10 µ L를 추가 합니다.
- 각 튜브를 추출 솔루션의 50 µ L를 추가 합니다.
- 소용돌이, 5 분 동안 각 관 5 분 동안 sonicate 고 영화와 조직의 각 튜브에 펠 릿을 형성 하기 위하여 5 분 동안 5000 RPM에서 원심.
- 96-잘 깊은 잘 격판덮개에 상쾌한의 50 µ L를 전송 및 각 잘에서 이온된 수의 추가 50 µ L로 희석.
- Ethambutol Ethambutol-d10 내부 표준 (앞에서 설명한 세부12)에 대 한 최적화 된 악기 매개 변수를 사용 하 여 LC/MS/MS 분석을 수행 합니다.
- 희석 비율을 사용 하 여 조직의 각 샘플에 대 한 해 부 정확한 금액에 대 한 수정.
5. 방법 유효성 검사
- 1 부 폐, 2 부분 PBS, 3-4 강철 구슬을 결합 하 여 제어 폐 조직에는 homogenate을 만듭니다. 비드 균질 화기를 사용 하 여 1750 rpm에서 5 분간 폐 조직 및 PBS 버퍼를 이길.
- 990 µ L homogenate를 만드는 1 분 10000 ng/mL (10mg/mL)와 소용돌이의 최종 농도에 1mg/mL Ethambutol DMSO 재고의 10 µ L을 추가 하 여는 homogenate 스파이크.
- cryomold에는 homogenate을 붓는 고 빠르게 5 분에 대 한 드라이 아이스에 냉동 하 여 냉동된 homogenate 블록을 만듭니다.
- 2.1-2.5 단계에 설명 된 대로 homogenate 블록에서 25 µ m 두꺼운 섹션을 준비 합니다.
- 3.2-3.10 단계에 지정 된 대상 조직 영역 해 부.
- Microdissected 조직을 포함 하는 관에 10 µ L 1:1 이기/물과 PBS 버퍼의 2 µ L를 추가 합니다.
- 각 튜브를 추출 솔루션의 50 µ L를 추가 합니다. 단계 4.9-4.12 표준 곡선을 만들고 조직 homogenate 블록에 약물 농도 결정 합니다.
- 아래 수식을 사용 하 여 추출 효율을 계산:
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Representative Results
LCM-LC/MS 접근에 대 한 개요는 그림 1에 표시 됩니다. 감마-방사선에 의해 조직 살 균, 후 (조직 단면 이후)에서 모든 후속 단계 BSL3 조건 이상으로 일어난다. 그림 2 조직 격리 LCM 전후 생 섹션 병 변이 보여준다. 결핵 병 변 괴과 세포 분야를 쉽게 식별 하 고 광학 이미지 (인접 조직 조직학 얼룩이 섹션을 참조 하십시오 요구) 없이 혼자의 검사에 의해 분리 될 수 있습니다. 해 부 과정 생성 주변 조직에 최소한의 소란와 함께 깨끗 한 컷 하 고 해 부 3 백만 µ m2 (3 m m2) 병 변에서 각 지역의 총에서 약 1 시간 걸립니다.
추출 효율과 LCM-LC/MS 방법의 안정성은 Ethambutol EMB 아군 폐 homogenate (표 1)를 사용 하 여 하는 것을 평가 했다. 약의 완전 한 추출은 관찰 하 고 약물 안정성 문제가 없는 해 부 및 추출 과정을 통해 발견 했다. LCM-LC/MS 추출 및 정량화 프로토콜 추가 같은 조직에 적용 하는 설립된 LC/MS 정량화 방법에 비교 하 여 검증 되었다. 괴 사 성 폐 결핵 병 변 및 표준 조직 균질에 의해 제공 하는 가난한 공간 특이성의 고유의 때문 우리 둘 다에 의해 분석 uninvolved 폐에 약물 농도 직접 비교 하 여 LCM-LC/MS 방법 확인 (때문에 그것의 상대적으로 높은 조직 동질성) 분석 기법. 표 2 는 생 검에 의해 평가 3 Ethambutol 복용 토끼에서 찍은에서 uninvolved 폐 약물 농도: 1) 25 µ m 두께 조직 섹션에 조직 및 표준 LC/MS, 그리고 uninvolved 폐의 2) LCM-LC/MS 분석에 의해 분석 지역 인접 25 µ m 두께 조직 섹션에서 가져온. 데이터는 두 가지 방법을 정량화 일관성 있는 데이터를 일상적인 공간 정량화에 대 한 적합성을 보여주는 생산을 보여줍니다.
우리는 LCM-LC/MS 공간 계량 폐 병 변 내의 많은 기존 및 새로운 안티-결핵 약물을 적용 했습니다. 그림 3A Ethambutol와 MTB에 감염 된 토끼 약 복용된 정상 상태에서 예제 데이터를 보여 줍니다. LCM-LC/MS caseum, 세포 병 변, uninvolved 폐 조직 영역 내에서 해결 하는 약물의 전체 정량화를 사용할 수 있습니다. EMB는 병 변으로 잘 침투 하 여 괴 사 성 caseum 내에서 살 균 농도 도달 관찰 되었다. EMB 분포는 인접 조직 섹션에서 취득의 해당 MALDI MS 이미지 그림 3B에 표시 됩니다. 질적 MALDI MS 이미지 세포 가장자리에 비해 괴 caseum에서 발견 하는 낮은 약물 농도와 양적 LCM-LC/MS 데이터와 잘 상관 한다. LCM-LC/MS 데이터 조직 homogenates 표준 LC/MS 분석에 직접적인 비교에 의해 확인 되었다.
그림 1 : LCM-LC/MS 과정의 도식. 토끼 폐 biopsies uninvolved 폐를 둘러싼 함께 괴 사 성 병 변을 포함 하는 수집 하 고 냉동. Cryosections는 얇은 애완 동물 세포 막에 자르고 uninvolved 폐 세포, 그리고 caseous 병 변의 영역 해 부와 짐머 외 에서 LC/양 적응에 의해 정량화에 대 한 분리 12 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 병 변 (A, B) 및 uninvolved 폐 (C, D) 그들은 (A, C) 전에 현미경을 사용 하 여 볼 때 (B, D) 후 서. Caseous 병 변 지역 어둡고 '깨진' 광학 이미지 스캔 (A, 녹색 개요)에 나타납니다. 세포 병 변은 컬러로 가볍고 더 단단한 구조 (A, 빨강 윤곽선)에. Uninvolved 폐 병 변 테두리에서 적어도 5mm 샘플링 해야 하 고 레드/핑크 색상 (C, 시안색 개요)에 나타납니다. 스케일 바 (검정, 파랑 및 자주색) = 400 µ m. 참고만 단색 영역이 uninvolved 폐의 치조 공간 및 bronchioles 조직 (같이 d에서) 수집의 총 면적에 포함 하지 않으려면 선택 해야 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 병 변 biopsies 두 토끼 7 일 동안 100 밀리 그램/kg EMB와 복용에서 찍은에서 예제 LCM-LC/MS 데이터 집합. (A) 모든 폐 및 병 변 구획으로 약물의 유리한 침투 관찰 되었다. LCM-LC/MS (빈 바) /MS에 의해 정량 약물 농도와 표준 LC/MS에 의해 무 균된 해 부 병 변에서 계량 강한 계약 했다 (고체 바, 평균 ± 표준 편차, n = 3-8). Extracellular 복제 이십시오 (MBC99)의 99%와 대 식 세포 (iMBC99)에 세포내 bacilli의 99%를 죽 일 하는 데 필요한 최소 농도 표시 됩니다. (B) 상단 패널: MALDI MS 이미지 EMB의 분포를 보여 주는 [M + H]+ 이온 (m/z 205.193)는 인접 한 조직 섹션. Note MALDI MS 이미지 caseum 기술의 탐지 (LOD)의 낮은 제한 되 고 현재 약물 농도 때문에 가난한 침투 EMB의 제안. 그러나, 공간 특이성 및 우수한 LOD의 LCM-LC/MS 약물은 caseum를 포함 하 여 모든 병 변 구획 내에서 살 균 농도 도달 보여줍니다. 하단 패널: 되며 & 오신 얼룩진 조직 섹션 MALDI MSI 사용 섹션에 직접 인접 한. Cellular (C) 및 괴 사 성 육아 (NG)는 조직에 존재 했다. Caseum 코어 화이트 요약. 짐머 외. 에서 적응 12 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 해 부 지역 (µ m2) | EMB 하자마자 (ng/g)를 측정 (n = 3) | EMB 복구 (%) (n = 3) |
| 3 백만 | 10633 (±404) | 106 (± 4) |
| 5 백만 | 10057 (±1132) | 101 (±11) |
| 10 백만 | 10563 (±1128) | 105 (±11) |
표 1: 폐에서 EMB를 측정 하는 LC LC/MS 방법의 추출 효율. EMB의 완전 한 복구는 모든 평가 조직 볼륨에 대 한 아군 EMB 폐 homogenate 해 부 조직에서 관찰 되었다.
| 토끼 ID | LC/MS EMB (ng/g) | LCM-LC/MS EMB (ng/g) | 차이 (%) |
| 899 | 2910 | 3320 | 14 |
| 904 | 2010 | 1870 | -7 |
| 911 | 2150 | 2370 | 9 |
표 2: LC/MS와 LCM-LC/양 3 약 복용된 토끼에서 uninvolved 폐 생 검 부 량 EMB의 비교 해당 약물 농도 방법 및 신호 저하 때문의 손실에 의해 검색 된 또는 추출 LCM-LC/MS 과정 관찰 되었다.
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Discussion
공간 해결 정량화 폐 결핵 병 변 내 약물의 약물 노출에 다른 병 변 구획 내에서 거주 하는 세균성 인구에 살 균 농도 도달 여부를 확인 하기 위해 필요 합니다. 여기에 설명 된 LCM-LC/MS 메서드는 총에서만 1-3 조직 단면도 사용 하 여 박테리아-부유한 caseum를 포함 하 여 모든 병 변 구획 내에서 안티-결핵 약물의 절대 정량화를 수 있습니다. 전통적인 조직 균질 및 LC/MS 방법 조직에 마약 정량화 종종 특정 병 변 구획을 해결 하려면 공간 특이성 부족 이며, 경우에 상당한 잠재력을 교차 오염 휴대 하 고 수동 추출 과정에서 괴 사 성 병 변 지역입니다.
LCM-LC/MS 접근 이미징 기술과 질량 분석을 기반으로 몇 가지 주요 장점이 있습니다. 이 중 기본 방법의 완전히 양적 기능과 해결 컬럼에 분리를 통해 내 생 종 방해 억제 약물 인 LC/MS 분석의 추가 감도 있습니다. 그러나, MALDI-MSI 자세한 마약 유통에 관한 공간 정보를 제공 합니다. MALDI-MSI와 LCM-LC/MS/MS 언된 조직 단면도 생성 하는 동일한 샘플 준비 단계 필요, 두 가지 기술은 동시에 약물의 매우 상세한 이미지와 함께 전체 정량화를 제공 하는 동일한 조직 생 검에 수행 될 수 있습니다. 배포입니다. 고감도 분석에 대 한 요구의 예는 그림 3에 표시 됩니다. 만 EMB 신호의 매우 낮은 수준의 약의 caseum 침투는 가난한 제안 MALDI MS 이미지 ( 그림 3B참조)의 중앙 괴 사 성 육아 종 지역에서 발견 했다. 그러나, LCM-LC/MS의 탐지의 우수한 제한으로 인해 약 명확 하 게 그 구획 내에서 살 균 농도 도달 시연 했다 그리고 현재 약물 농도 주로 MALDI (그림 3A)에 의해 감지 되지 않았습니다.
조직 얼룩 프로토콜 조직 영역 쉽게 식별 및 세포 인구 내에 있는 LCM proteomic 응용 프로그램 전에 일반적으로 사용 됩니다. 루틴 조직화 학적인 얼룩 같은 관련 된 단계를 세척 하는 많은 용 매 조직 섹션에서 약 delocalize 것으로 H & E 마약 정량화와 호환 되지 않습니다. 인접 한 컷된 섹션 H & E와 스테인드 고 서에 대 한 가이드로 사용 될 수 있습니다. 그러나, 이것 아니다 보통 필요한 병 변 구획 광학 현미경 표준 LCM 명시 (그림 2) 해결할 수 있습니다.
단면화 및 기정 단계의 최적화 성공 병 변 부 량 위해 결정적 이다. 방법의 개발, 우리는 두 개의 서로 다른 막 재료, 폴 리 에틸렌 테 레프 탈 산 (애완 동물) 및 폴 리 에틸렌 naphthalate (펜), 서의 조직 단면도 장착을 위한 기질으로 평가. 애완 동물 세포 막에 비해 증가 정적 충전에서 펜 막 고통 및 모든 해 부 조직 분야의 약 30% 해 부 조직 지역 및 막 사이 정전기 매력 때문에 분실 되었다. 이러한 이유로 애완 동물 막 미래 해 관찰 크게 감소 정적 매력 때문에 대 한 선정 됐다 (단 지역 애완 동물 세포 막에서 해 부의 5%는 LCM 과정에서 분실 되었다).
조직 섹션에서 약물의 안정성 LCM-LC/MS 연구를 설계할 때 중요 한 고려 사항입니다. 단면화 및 해 부 과정 조직 단면도의 적어도 1 시간 동안 실험실 온도 빛에 노출 됩니다. 고려해 야 할 다른 문제 없습니다 균질 단계 참여로 조직 섹션에서 약의 추출 효율을 포함 (추출만 소용돌이 혼합 및 쥡니다에 의해 수행 됩니다). 우리의 경험에서 추출 않습니다 용납 하지 높은 추출 용 매로 인해 조직의 균질의 부족에서 사용 하는 조직 비율 및 해 부 조직 단면도의 두께. 우리의 관측은 이전에 설명한 온라인 LCM-LC/MS 방법 프로 프라 놀 롤 microdissected 조직 단면도의 두뇌와 간, 조직에서 약물의 완전 한 추출 20 µ m 두께 40 µ m에서 관찰 되었다에 척도를 개발 계약 섹션10. 우리 약물 추출의 효율성을 검증 및 직접 (같은 토끼 폐 엽에서) 폐 조직 농도 비교 하 여 LCM 과정 약물 안정성 표준 조직에 의해 결정 하는 농도와 LCM-LC/MS에 의해 분석 균질 그리고 LC/MS (예를 표 1참조). 이 비교 두 방법론 사이 어떤 변화의 신호 발생 여부를 확인할 수 있습니다.
해 부 조직 영역의 밀도 조직 영역 또는 볼륨 기반 약물 수준을 측정 하는 경우에 중요 한 고려 사항 이기도 합니다. 이것은 폐와 병 변의 생 검, uninvolved 폐 조직 영역을가지고 있는 휴대 및 caseum 보다 전반적으로 낮은 밀도 (적은 조직 같은 상대 표면 면적) 여러 오픈 bronchioles의 존재 때문에 대 한 특별 한 관심의 고 치경 공백입니다. ( 그림 2에서 같이) 수집 된 조직의 누적 노출 영역 내에서 그들을 포함 하지 않으려면 열린 공간 주위 신중 하 게 그려서 밀도에서이 차이의 효과 완화할 수 있습니다.
추가 한계는 제시 LCM-LC/MS 방법만 단정 (와 모든 조직 균질, 용 매 추출 및 LC/MS 정량화 접근) 고립 된 조직 내에서 총 약물 농도 및 해결 되지 않습니다. 언바운드 분수에서의 단백질 바인딩 약물 농도 Microdialysis 언바운드 마약 조직 내에서 측정에 대 한 다른 접근 방법 이며 박테리아13의 extracellular 인구를 도달 하는 무료 약물 농도의 정확한 정량화를 수 있습니다. 그러나, 기술은 최고의 적용 됩니다 상호 보완적인 접근 방식으로 그것은 LCM-LC/MS의 공간 특이성 결여로 단정 성 마약 조직 세포 외 액, 세포내 콘텐츠가 아닌 레벨.
우리는 처음으로, LCM 및 LC/MS 공간 계량 결핵 감염의 사이트에 항생제를, 결합 했다. 방법론은 대단히 강력한 때문에 어떤 질병 상태에 사용 되는 어떤 작은 분자 약물에 적용할 수 있습니다. 실제로, 우리는 최근 복 부 칸디 다14마우스 모델에서 항진균 약물 후보 측정할는. 다른 유형의 종양 구획 (를 포함 하 여 괴 코어)으로 분할 하는 차동 마약 암, 치료 그리고 암 약물 발견15연구의 중요 한 영역에서 기본 관심사입니다. LCM-LC/MS는이 질문에 접근을 이상적으로 적합 합니다. 또한, LCM-LC/MS lipidomic 신진 대사, 계량 바이오 마커 발견을 위해 사용할 수 있습니다 및 proteomic 조직 영역 및 세포 인구에서 발생 하는 질병 병 인 하는 동안 변경.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리 폴 오 브라이언, 감사 미 나 Marizel와 동물 실험에 대 한 이자벨 프리먼, Jacquie 곤잘레스 NIH/NIAID에서 다니엘 이너 원고에 대 한 레이저 캡처 기정 Jansy Sarathy 이전 토끼 조직의 감마 방사선에 대 한 생각과 조언입니다. 이 작품은 법안에서 자금에 의해 지원 되었다 고 멜 린다 게이츠 재단 (OPP1174780)와 공유 하는 NIH 계측 1S10OD018072를 부여 합니다. 우리 감사 Eliseo A. Eugenin Leica LMD 6500 현미경에 대 한 액세스를 제공 하 고 전문 지식 및 조언을 공유. 구입, 그리고 지속적인 지원, LMD 6500는 국립 정신 건강 연구소 그랜트, MH096625, 신경 성 질환의 국가 학회 및 치기, NS105584, PHRI (E.A.E)에 자금와 GSK 기여 (E.A.E)에 의해 투자 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| New Zealand White rabbits | Covance | N/A | |
| HN878 Mycobacterium tuberculosis | BEI Resources | NR-13647 | |
| Ketathesia (Ketamine) 100 mg/mL C3N | Henry Schein Animal Health | 56344 | |
| Anased (Xylazine) 100 mg/mL | Henry Schein Animal Health | 33198 | |
| Euthasol (pentobarbital sodium and phenytoin sodium) Solution | Virbac | 710101 | |
| Acetonitrile (LC-MS grade) | Fisher | A955-212 | |
| Methanol (LC-MS grade) | Fisher | A456-212 | |
| Formic Acid (LC-MS grade) | Fisher | A117-50 | |
| Water (LC-MS grade) | Fisher | W6212 | |
| 0.2 mL flat-cap PCR tubes | Corning | 07-200-392 | |
| Steel frames, PET-membrane | Leica | 11505151 | |
| Premium Frosted Microscope Slides | Fisher | 12-544-2 | |
| 96 Deep well plate 2.0ML PP RB | Fisher | NC0363259 | |
| Zorbax SB-C8 column (4.6 by 50 mm; particle size, 3.5 μm) | Agilent | 820631-001D | |
| "Zipper” Seal Sample Bags | Fisher | 01-816-1B | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| CM1850 cryostat | Leica | Discontinued | Leica CM1860 is the current model |
| Laser Microdissection System 6500 | Leica | Discontinued | Leica LMD 6 is the current model |
| Agilent 1260 Infinity II HPLC | Agilent | ||
| API 4000 QTRAP Mass Spectrometer | Sciex |
References
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