Summary
Her, beskriver vi en protokol, ved hjælp af laser fange microdissection kombineret med LC/MS analyse for at rumligt kvantificere drug distributioner inden for lungetuberkulose granulomer. Metoden har bred anvendelighed til at kvantificere drug koncentrationer i væv ved høj fysisk detalje.
Abstract
Tuberkulose er stadig en førende årsag til sygelighed og dødelighed på verdensplan. Forbedringer til eksisterende stof regimer og udviklingen af roman therapeutics er tvingende nødvendigt. Evne til doseret TB narkotika at nå og sterilisere bakterier inden for dårligt-vaskulariserede nekrotisk regioner (caseum) af pulmonal granulomer er afgørende for vellykket terapeutisk intervention. Effektiv terapeutisk regimer skal derfor indeholde stoffer med gunstige caseum indtrængning egenskaber. Nuværende LC/MS metoder til kvantificering af stoffet niveauer i biologisk væv har begrænset rumlige opløsning kapaciteter, hvilket gør det vanskeligt at præcist fastslå absolutte drug koncentrationer inden for lille væv rum som dem der findes i nekrotisk granulomer. Her præsenterer vi en protokol, der kombinerer laser fange microdissection (LCM) af patologisk forskellige væv regioner med LC/MS kvantificering. Denne teknik giver absolut kvantificering af stoffer inden for granuloma caseum, omgivende cellulære læsion og uengagerede lungevæv og derfor bestemmer præcist om bakteriedræbende koncentrationer er opfyldt. Ud over tuberkulose forskning har teknikken mange potentielle anvendelsesmuligheder for rumligt løst kvantificering af narkotika i syge væv.
Introduction
Evnen til at rumligt løse og kvantificere drug niveauer er et afgørende krav for at afgøre, om antituberkulosebehandling nå bakteriel delpopulationer inden for pulmonal læsioner på sterilisering koncentrationer1. Af særlig betydning bestemmelse af narkotika indtrængen i nekrotisk kernen af læsion (kaldet caseum), som typisk indeholder det højeste antal baciller og kan være dårligt tilgængelige til medicin på grund af manglende vascularization.
Traditionelle metoder til at vurdere læsion penetration, som involverer homogenisering af skåret pulmonal læsioner efterfulgt af opløsningsmiddelekstraktion og væskekromatografi massespektrometri (LC/MS) analyse, er yderst følsom og selektiv for stoffer af interesse. Men disse metoder giver dårlig geografisk information, begrænset til størrelsen af den oprindelige homogeniseret væv. Massespektrometri-baseret tænkelig tilgange, såsom matrix assisted laser desorption ionisering (MALDI)2,3, desorption electrospray Ionisation (DESI)4 eller væske-forstærket overflade udvinding5, 6 tilbyder meget rumligt løst billedbehandling kapaciteter, men direkte kvantificering kan være ekstremt udfordrende eller umuligt på grund af heterogene ion undertrykkelse effekter og forskellige udvinding effektivitetsgevinster af analysand fra de forskellige celle eller væv typer7. Derudover er mest direkte væv MS Billeddannende metoder i sagens natur mindre følsomme end LC/MS på grund af manglende kromatografiske adskillelse af endogene arter konkurrerer om ionisering og lavere opløsningsmiddelekstraktion effektiviteten af narkotika fra væv.
Laser fange microdissection (LCM) kombineret med LC/MS analyse har været rutinemæssigt anvendt for at isolere og karakterisere forskellige væv regioner for proteom undersøgelser8,9 og for nylig udnyttet for drug kvantificering i doseret animalsk væv10. Her præsenterer vi en optimeret protokol anvender LCM'EN kombineret med LC/MS (LCM-LC/MS) analyse for at kvantificere anti-TB narkotika inden for forskellige granuloma rum. I laser fange microdissection proces, er et UV laser fokuseret gennem mikroskop mål på afsnittet væv, som skærer og isolerer det ønskede væv område ved at følge en sti, der er defineret af brugeren. For alvor-støttede LCM (teknik, der anvendes til denne forskning), afsnittet væv er monteret på en tynd polymer membran dias (PET eller PEN) og væv er fanget i en collection tube cap placeres under diaset. Narkotika er udvundet fra den skåret væv og kvantificeres ved hjælp af standard LC/MS tilgange. Mængden af væv skal indsamles er i sidste ende bestemmes ud fra den forventede koncentration af stoffet i vævet og følsomheden af metoden LC/MS. For de fleste analyser af narkotika doseret på terapeutiske niveauer og analyseret ved hjælp af en rutinemæssig tredobbelt Quadrupol massespektrometer, 3 millioner µm2 (3 mm2) væv er areal tilstrækkelig.
Denne protokol beskriver den kraftfulde kombination af geografisk profilering og fuld kvantificering tilbydes af LCM-LC/MS, giver absolut drug koncentrationer inden for alle segmenter af TB granulomer. Teknikken kan også anvendes til bestemmelse af narkotika koncentrationer i mange forskellige syge væv giver afgørende Lægemiddelinformation opdagelse og udvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg blev gennemført i overensstemmelse med retningslinjer for pleje og anvendelse af forsøgsdyr af National Institutes of Health med godkendelse fra den institutionelle Animal Care og brug Udvalget af NIAID (NIH), Bethesda, MD.
1. dyreforsøg og væv samling
Dette afsnit af protokollen beskriver dyr procedurer og prøvetagning biosikkerhed niveau 3 (BSL3) betingelser. Detaljerede protokoller af Mycobacterium tuberkulose aerosol infektion procedure og drug administration protokoller i kaniner har været beskrevet tidligere11,12.
- Inficere New Zealand hvide kaniner (mandlige og kvindelige på 4-5 måneder gammel) med M. tuberkulose HN878 bruger en næse-only aerosol system, som tidligere beskrevet11.
- Administrere de valgte stoffer (Ethambutol i eksemplet præsenteres her) via den foretrukne rute og aflive dyrene på 2, 6 og 24 timer efter indgift. Først, bedøver kanin ved intramuskulær injektion af ketamin på 35 mg/kg og xylazin på 5 mg/kg. Vent 10 minutter og bekræfte korrekt anesthetization ved at knibe halen og forsigtigt røre øjet. Hvis der er nogen reaktion, aflive ved intravenøs administration af pentobarbital og phenytoin (Se Tabel af materialer) på 1 mL/4,5 kg i 2 mL sterilt saltvand.
Bemærk: Disse timepoints er optimale til at dække den farmakokinetiske profil for Ethambutol og kan kræve justering/optimering for andre undersøgelse narkotika. - Brug pincet, saks, og/eller skalpel, fjerne lungerne fra brysthulen, resect lunge biopsier indeholdende store nekrotiske granulomer indlejret i omkringliggende uengagerede lungevæv (som tidligere beskrevet3). Nekrotisk granulomer vises beige i farve og typisk rager lidt fra den omgivende rød/pink-farvet lunge. For at lette let cryosectioning, sikre at biopsier er ikke større end 2 x 1,5 x 1,5 cm.
- Brug af pincet, placere biopsi på en forud mærket cryomold bakke med den ønskede skærefladen i direkte kontakt med bunden af bakken. Efter frysning, vil dette give en flad overflade, hvorfra snit frosset organmateriale vil blive skåret.
- Fryse biopsi i flydende nitrogen dampe. Fyld en styrofoam containere til en dybde af 2 inches med flydende kvælstof og placere en metaltråd tube rack. Rack bør stikker op over overfladen af flydende kvælstof giver en flad overflade som væv skufferne er placeret. Låget lægges tilbage på styrofoam containere og forlade væv i 10 minutter til fuldt fryse.
- Fjern væv bakker, hurtigt wrap i aluminium film og placere i individuelt mærket genlukkelig plastposer og segl. Overførsel til-80 ° C fryser til opbevaring.
Bemærk: Trin 1.1-1.6 er udført i BSL3 betingelser (herunder alle animalske arbejde og håndtering af inficerede organer og væv). Gamma bestråle lunge biopsier med 3 megarad aktivere håndtering uden for BSL3 indeslutning. Laser fange microdissection på usteriliseret væv kan udføres i BLS3 facilitet hvis godkendt sikkerhed protokoller er på plads. Men resten af denne protokol beskriver downstream behandling på et anlæg, BSL-2.
2. væv skæring
- Indstille kryostaterne til den ønskede skæring temperatur. Overføre gamma-bestrålet lung biopsi fra-80 ° C opbevaring til kryostater og henstår i 30 minutter til Reagensglasset væv temperatur. Bemærk: -20 til 22 ° C er optimal for TB læsion biopsier.
- Brug af pincet, lave biopsi til kryostaten chuck ved hjælp af en lille mængde af optimal opskæring temperatur selvklæbende (OCT) for at overholde base af væv til chuck. Orientere væv, således at den flade del (der var i kontakt med bunden af cryomold) er den eksponerede overflade til at skære. Sikre OLT ikke forurener væv overflade, da dette kan forstyrre den efterfølgende massespektrometri analyse.
- Skær tre væv sektioner på 25 µm tykkelse og montere på PET membran dias. Blidt røre membran til afsnittet væv og fjerne. Hvis for meget pres er anvendt, kan den tynd membran rive.
- Undgå overdreven håndtering af dias før montering da dette vil resultere i PET membranen at blive opladet og dårlig vedhæftning af sektionerne væv. Sørge for at diasset membran holdes ved stuetemperatur til at aktiverer tø-montering og vellykket vedhæftning af væv til membranen.
- Fjern diasset fra kryostaterne og lad lufttørre i 3 minutter. Hvis LCM-LC/MS/MS ikke vil blive udført øjeblikkeligt, forsegle diaset i en lille lufttæt forseglbar taske og overførsel til-80 ° C opbevaring indtil kræves til dissektion.
- Skære en tilstødende afsnit på 10-12 µm og tø-mount på et standard glas dias for hæmatoxylin og Eosin (H & E) farvning og reference. Yderligere sektioner kan skæres på dette tidspunkt for andre ønskede histokemi pletter (såsom Ziehl-Niellsen til at visualisere Mycobacterium tuberculosis (MTB)).
3. Microdissection
- Fjerne forseglet pose indeholder dias fra-80 ° C opbevaring og gør det muligt for at nå stuetemperatur i 5 minutter.
Bemærk: Hvis den kolde dias er straks udsat for laboratoriet atmosfære, væv vil blive belagt med kondens, og rumlige integriteten af stoffet kan være kompromitteret. - Tænde mikroskopet og laser (laser kræver 5-10 minutter varme op før skæring kan påbegyndes). Indlæse fladskærms-cap 0,20 mL PCR rør ind i holderen.
- Fjern dias fra posen og tage et optisk billede af afsnittet væv på PET dias ved hjælp af en flatbed-scanner.
- Placer dias i diasholderen (væv side vender nedad) og tildele særskilt indsamling rør til specifikke granuloma regioner af interesse ved hjælp af mikroskop software. Typisk, disse vil blive 'uengagerede lunge,' 'cellulære granuloma,' og 'caseum' (nekrotisk center), men kan variere afhængigt af den specifikke patologi af granuloma/biopsi.
- Fokusere på væv ved hjælp af 5 X mikroskop mål. Denne forstørrelse bør give et godt overblik over det væv, som indeholder begge cellulære og nekrotisk granuloma områder. Vælg røret udpeget 'caseum' til at flytte det ind i position under vævet i softwaren.
- Angiv de ønskede dissektion parametre. Typiske indstillinger for en 25 µm tykt lunge sektion er laser power 30, 15, og blænde 35 (arbitrære enheder). Disse varierer dog afhængigt af mikroskop bruges og potentiale faldende magt på grund af alder af laser.
- Vælg værktøjet gratis-draw, og ved hjælp af enten en mus eller en berøringsskærm pen, skitsere den ønskede region for dissektion. Overfladearealet af regionen vises i softwaren. Holde udvalgte regioner under 500.000 µm2 (0,5 mm2) til at lette lettere dissektion. Gentag dissektion, indtil 3 millioner µm2 (3 mm2) er blevet indsamlet i alt i rør cap.
- Lejlighedsvis, kan regionen dissekeret blive hængende til den omgivende membran (for eksempel på grund af statisk tiltrækning) og ikke falder i samling fælles landbrugspolitik. Fjerne disse regioner fra samlede kumulative areal ved at markere og fjerne manuelt i softwaren.
- Vælg fælles landbrugspolitik for cellulære læsion og indsamle 3 millioner µm2 af væv ved hjælp af den samme proces, som beskrevet i trin 3.7.
- Vælg fælles landbrugspolitik for «uengagerede lunge» og indsamle 3 millioner µm2 af væv ved hjælp af den samme proces, som beskrevet i trin 3.7. Bemærk at uengagerede lungevæv indeholder mange bronchioles og alveolær rum. Omhyggelig opmærksomhed at udelukke disse fra regionerne definerede væv til dissektion.
- Fjern hætten indehaveren og omhyggeligt unclip, forsegle og mærke hver tube. Beskytte dissekeret væv fra omgivende luft forstyrrelser (f.eks. fra luft flow forstyrrelser fra en åbning af døren). Analysere dissekeret væv straks, eller opbevares ved-80 ° C og tø forud for behandling og LCMS analyse.
4. udvinding og LCMS analyse
- Forberede ekstraktionsopløsning 1:1 acetonitril/methanol indeholdende Ethambutol d-10 intern standard. Når du vælger en intern standard, brug en stabil mærket form af analysanden narkotika (såsom deuterium-mærket EMB anvendes i denne demonstration) med tilstrækkelig masse Skift at undgå isotop cross talk mellem den analysand stof og standard (normalt mindst 4 Dalton) .
Bemærk: At skabe standarder i homogenatet af hver respektive vævstype er svært, fordi der er meget begrænset kontrol væv til at skabe homogenatet standarder. Som et alternativ til at lave standarder fra en spidse homogenatet prøve, kan en standard oprettes ved at tilføje tomme væv og testforbindelsen sammen og udvinding. En volumen kontrol væv i en homogenatet, der matcher destinationsdiskenheden af sektionerne undersøgelse prøve væv kombineres direkte med en mængde af test sammensatte, der ville være til stede i en given koncentration. - Beregne målrettet væv diskenheden baseret på areal og tykkelse af afsnittet væv og fastlægge de nødvendige fortyndingsfaktoren for homogenatet ved hjælp af volumen af homogenatet, der vil blive tilføjet til standard- og QC prøver. Beregninger er illustreret nedenfor for en 3 millioner µm2 (3 mm2) dissekeret målområde med 25 µm tykkelse og 2 µL volumen af homogenatet.
- Antager en væv massefylden 1 g/ml, forberede homogenatet bestand af vejer 50 mg kontrol væv og tilføje PBS buffer til at fortynde (ved hjælp af fortyndingsfaktoren 26.67 homogenatet beregnet i trin 4.2, fortyndingsvæsken er 1.283 mL). Der homogeniseres ved perle slå lungevæv og PBS buffer for 5 minutter på 1750 rpm på en perle homogeniseringsapparat.
- Fortyndes 1 mg/mL drug bestande koncentration i 1:1 acetonitril/vand til at oprette standardkurven spiking løsninger. Bestemme spiking standard koncentrationer baseret på spike volumen og væv destinationsdiskenheden. Det illustrerede eksempel er for en 100 ng/mL standard med en 10 µL spike diskenhed.
- Fjerne de rør, der indeholder microdissected væv fra-80 ° C opbevaring og gør det muligt for at nå stuetemperatur i 5 minutter.
- Tilføje 10 µL af 1:1 acetonitril/vand opløsning og 2 µL af PBS buffer rør indeholdende microdissected væv.
- Standardkurven og kvalitetskontrol rør, tilføje 10 µL af spiking løsning 2 µL af kontrol lunge homogenatet.
- Tilføje 50 µL af ekstraktionsopløsningen til hver tube.
- Vortex hver tube i 5 minutter, Læg instrumenterne i ultralydsbad i 5 minutter og centrifugeres ved 5000 RPM i 5 minutter til at danne en pellet film og væv i hvert rør.
- Overføre 50 µL af supernatanten til en 96-brønd deep-godt plade og fortyndes med en yderligere 50 µL med deioniseret vand i hver brønd.
- Udføre LC/MS/MS analyse ved hjælp af optimeret instrument parametre for Ethambutol og Ethambutol-d10 intern standard (som tidligere beskrevet i detaljer12).
- Brug en fortyndingsfaktoren at korrigere for det nøjagtige beløb af væv dissekeret for hver prøve.
5. metode validering
- Oprette en homogenatet i kontrolelementet lungevæv ved at kombinere 1 del lunge, 2 dele PBS og 3-4 stål perler. Slå lungevæv og PBS buffer for 5 minutter på 1750 rpm ved hjælp af en perle homogeniseringsapparat.
- Spike i homogenatet ved at tilføje 10 µL af 1 mg/mL Ethambutol DMSO materiel til 990 µL homogenatet til at oprette en endelig koncentration på 10.000 ng/mL (10 mg/mL) og vortex i 1 minut.
- Oprette en frossen homogenatet blok ved at hælde homogenatet i en cryomold og hurtigt frysning på tøris i 5 minutter.
- Forberede 25 µm tykt afsnit fra homogenatet blokken som beskrevet i trin 2.1-2.5.
- Dissekere vævet målområdet som angivet i trin 3.2-3.10.
- Tilføje 10 µL 1:1 acetonitril/vand og 2 µL af PBS buffer rør indeholdende microdissected væv.
- Tilføje 50 µL af ekstraktionsopløsningen til hver tube. Følg trin 4,9-4.12 for at oprette en standardkurve og bestemme koncentrationen af stof i væv homogenatet blok.
- Beregne ekstraktionseffektivitet af ved hjælp af nedenstående formel:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En oversigt over LCM-LC/MS tilgang er vist i figur 1. Efter sterilisation vævet af gamma-bestråling, finde alle efterfølgende trin (fra væv skæring og fremefter) sted uden for BSL3 betingelser. Figur 2 viser læsion biopsi sektioner før og efter væv isolation af LCM. Nekrotisk og cellulære områder af TB læsioner kan let identificeres og isoleret ved visuel inspektion af optiske billeder alene (uden krav til histologisk farvede tilstødende væv afsnittene). Dissektion proces producerer et rent snit med minimal forstyrrelse til det omkringliggende væv, og dissekere 3 millioner µm2 (3 mm2) i hver region af interesse fra læsioner tager ca. 1 time i alt.
Udvinding effektivitet og stabilitet af LCM-LC/MS metoden blev vurderet ved hjælp af Ethambutol EMB-spiked lunge homogenatet (tabel 1). Komplet udvinding af stoffet blev observeret, og ingen stof stabilitetsproblemer blev opdaget gennem dissektion og udvinding processen. LCM-LC/MS udvinding og kvantificering protokollen blev yderligere valideret ved at sammenligne med etablerede LC/MS kvantificering metoder anvendes til de samme væv. På grund af den iboende heterogenitet af nekrotisk pulmonal TB læsioner og dårlig fysisk specificitet tilbydes af standard væv homogenisering, valideret vi metoden LCM-LC/MS ved direkte sammenligning drug koncentrationer i uengagerede lunge analyseret af begge analytiske teknikker (på grund af sin relativt høje væv homogenitet). Tabel 2 viser drug koncentrationer i uengagerede lunge fra biopsier tages fra tre Ethambutol-doseret kaniner som vurderet af: 1) homogenisering 25 µm tykt væv sektioner og analyse af standard LC/MS og 2) LCM-LC/MS analyse af uengagerede lunge områder taget fra en tilstødende 25 µm tykt væv sektion. Dataene viser, at to tilgange producere konsekvent kvantificering data, demonstrerer egnethed for rutinemæssig fysisk kvantificering.
Vi har anvendt LCM-LC/MS for at rumligt kvantificere mange eksisterende og nye anti-TB narkotika inden for pulmonal læsioner. Figur 3A viser eksempeldata fra MTB-inficerede kaniner doseret steady-state med Ethambutol. LCM-LC/MS aktiveret fuld kvantificering af stoffet løses inden for caseum, cellulære læsion og uengagerede lunge væv områder. EMB blev observeret at trænge langt ind i læsion og nå sterilisering koncentrationer inden for de nekrotiske caseum. Tilsvarende MALDI-MS billedet af EMB distribution erhvervet fra en tilstødende væv afsnit er vist i figur 3B. De kvalitative MALDI-MS billeder korrelerer med den kvantitative LCM-LC/MS data med lavere stof koncentrationer blev fundet i de nekrotiske caseum i forhold til den cellulære rand. LCM-LC/MS data blev valideret ved direkte sammenligning til væv homogeniseret analyseret af standard LC/MS.
Figur 1 : Skematisk af LCM-LC/MS proces. Kanin lunge biopsier indeholdende nekrotisk læsion sammen med omkring uengagerede lunge er indsamlet og frosset. Snit frosset organmateriale er skåret på tynde PET membraner og områder af uengagerede lunge, cellulære og caseoes læsion er dissekeret og isoleret for kvantificering af LC/MS. tilpasset fra Zimmerman et al. 12 Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Læsion (A, B) og uengagerede lunge (C, D) som de vises, når vises ved hjælp af mikroskop før (A, C) og efter (B, D) microdissection. Caseoes læsion områder vises mørkere og 'halvtosset' i optisk Billed scan (en, grønne kontur). Cellulære læsion er lysere i farven og mere fast i strukturen (A, rød kontur). Uengagerede lunge bør udtages mindst 5 mm fra grænsen læsion og vises rød/pink i farven (C, cyan kontur). Skalere barer (sort, blå og lilla) = 400 µm. Bemærk at kun faste områder af uengagerede lunge bør vælges at undgå herunder alveolære rum og bronchioles i det samlede overfladeareal af væv indsamlet (som vist i i D). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Eksempel LCM-LC/MS datasæt fra læsion biopsier tages fra to kaniner doseres med 100 mg/kg EMB i 7 dage. (A) gunstige indtrængen af narkotika i alle lunge og læsion rum blev observeret. Drug koncentrationer kvantificeres ved LCM-LC/MS (hule stænger) /MS var i stærk aftale med dem kvantificeret fra homogeniseret dissekeret læsioner ved standard LC/MS (fast barer, gennemsnit ± standardafvigelse, n = 3-8). De mindste koncentrationer forpligtet til at dræbe 99% af ekstracellulære replicerer baciller (MBC99) og 99% af intracellulære baciller i makrofager (iMBC99) er angivet. (B) øverste panel: MALDI-MS billede viser fordelingen af EMB [M + H]+ ion (m/z 205.193) i en tilstødende væv sektion. Bemærk at MALDI-MS billede tyder på dårlig indtrængen af EMB i caseum på grund af de nuværende drug koncentrationer under den nedre grænse detektionsgrænsen (LOD) af teknik. Den rumlige specificitet og overlegen LOD af LCM-LC/MS viser imidlertid stoffet er ved at nå sterilisering koncentrationer inden for alle læsion rum herunder caseum. Nederste panel: hæmatoxylin & Eosin farves væv afsnit støder direkte op til den sektion, der indeholder MALDI MSI. Cellular (C) og nekrotisk granulomer (NG) var til stede i vævet. Caseum kernen er skitseret i hvid. Tilpasset fra Zimmerman et al. 12 Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Dissekeret område (µm2) | Målt EMB koncentreret (ng/g) (n = 3) | EMB opsving (%) (n = 3) |
| 3 millioner | 10633 (±404) | 106 (±4) |
| 5 millioner | 10057 (±1132) | 101 (±11) |
| 10 millioner | 10563 (±1128) | 105 (±11) |
Tabel 1: Ekstraktionseffektivitet af LC-LC/MS metode til kvantificering af EMB i lunge. Fuldstændig helbredelse af EMB blev observeret i EMB spidse homogenatet dissekeret lungevæv for alle evaluerede væv diskenheder.
| Kanin-ID | LC/MS EMB (ng/g) | LCM-LC/MS EMB (ng/g) | Forskel (%) |
| 899 | 2910 | 3320 | 14 |
| 904 | 2010 | 1870 | -7 |
| 911 | 2150 | 2370 | 9 |
Tabel 2: Sammenligning af EMB kvantificering i uengagerede lunge biopsier fra 3 doseret kaniner af LC/MS og LCM-LC/MS. Tilsvarende stof koncentrationer blev opdaget af både metoder og ingen tab af signal på grund af nedbrydning eller udvinding i løbet af LCM-LC/MS processen blev observeret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Rumligt løst kvantificering af stoffer inden for pulmonal TB læsioner er forpligtet til at fastslå, om stoffet eksponering når sterilisering koncentrationer til bakteriel befolkninger bosat inden for de forskellige læsion rum. LCM-LC/MS metoden her gør det absolut kvantificering af anti-TB narkotika inden for alle læsion rum, herunder bakterier-rige caseum, bruger kun 1-3 væv sektioner i alt. Traditionelle væv homogenisering og LC/MS tilgange til stoffet kvantificering i væv ofte mangler den rumlige specificitet for at løse specifikke læsion rum og selv når det er muligt, der er betydelige muligheder for at krydse forurene cellulære og nekrotisk læsion områder under den manuelle udvinding proces.
LCM-LC/MS-tilgang har flere vigtige fordele til massespektrometri-baseret tænkelig teknologier. Primære blandt disse er de fuldt kvantitative kapaciteter af metoden og de ekstra følsomhed af LC/MS analyse på grund af løse stof fra at gribe/undertrykke endogene arter via kromatografisk separation. Men MALDI-MSI giver mere detaljerede geografiske oplysninger vedrørende narkotika distribution. Som både MALDI-MSI og LCM-LC/MS/MS kræver de samme prøve Forberedelsestrinnene til at generere frossen væv sektioner, kan de to teknikker udføres parallelt på det samme væv biopsi giver fuld kvantificering sammen med meget detaljerede billeddannelse af narkotika distribution. Et eksempel på kravet om højere analytiske følsomhed er vist i figur 3. Kun var meget lave niveauer af EMB signal registreret i den centrale nekrotiske granuloma region MALDI MS billede (vist i figur 3B), tyder på caseum indtrængen af narkotika er dårlige. Men på grund af den overlegne grænsen for påvisning af LCM-LC/MS stoffet blev klart påvist for at nå sterilisering koncentrationer inden for dette rum og stof koncentration til stede var overvejende målbart af MALDI (figur 3A).
Væv farvningsprotokoller anvendes typisk før LCM for proteom programmer for at muliggøre nem identifikation af væv områder og cellepopulationer ligger inden for. Rutine histokemiske pletter såsom H & E ikke er kompatible med narkotika kvantificering, som mange af opløsningsmiddel vaske trin involveret ville delocalize stof fra afsnittet væv. Tilstødende cut sektioner kan plettet med H & E og bruges som en guide til microdissection. Men dette er ikke normalt nødvendige, som læsion rum optisk kan løses under den standard LCM brightfield mikroskop (figur 2).
Optimering af skridt, skæring og microdissection er afgørende for vellykket læsion kvantificering. Under udviklingen af metoden vurderet vi to forskellige membran materialer, polyethylenterephthalat (PET) og polyethylen poly(ethylennaphthalat) (PEN), som substrat for montering væv sektioner for microdissection. PEN membraner lidt fra øget statisk opladning i forhold til PET membraner og ca 30% af alle dissekeret væv områder var tabt på grund af statisk tiltrækning mellem regionen dissekeret væv og membranen. Af denne grund, PET membraner blev valgt for fremtidige dissektioner på grund af den væsentligt reducerede statisk attraktion observeret (kun 5% af regioner dissekeret fra PET membraner gik tabt under LCM-processen).
Stabiliteten af narkotika inden for væv sektioner er en vigtig overvejelse, når du udformer en LCM-LC/MS undersøgelse. Under skæring og dissektion, er afsnittene væv udsat for lab temperatur og lys i en periode på mindst 1 time. Andre problemstillinger omfatter ekstraktionseffektivitet af stof fra afsnittene væv, da der ikke er nogen homogenisering trin involveret (ekstraktion foretages kun af vortex blanding og ultralydbehandling). Vores erfaring lider ikke udvinding af manglen på væv homogenisering på grund af den høje ekstraktionsmiddel til væv i forhold og thinness i afsnittene væv dissekeret. Vores observationer er enig med en tidligere beskrevet online LCM-LC/MS metode udviklet til at kvantificere propranolol i microdissected væv dele af hjernen og leveren, hvor komplet udvinding af stof fra væv blev observeret fra 20 µm og 40 µm tykt afsnit10. Vi valideret effektiviteten af lægemidlet udtræk og narkotika stabilitet under LCM-processen ved at direkte sammenligne lunge væv koncentrationer (fra den samme kanin og lunge lap) analyseret af LCM-LC/MS med koncentrationerne bestemmes af standard væv homogenisering og LC/MS (et eksempel er vist i tabel 1). Denne sammenligning giver os mulighed at afgøre, om enhver ændring af signal finder sted mellem de to metoder.
Tætheden af dissekerede væv regioner er også en vigtig overvejelse, når kvantificere drug niveauer baseret på væv overfladeareal eller volumen. Dette er af særlig bekymring for lunge og læsioner biopsier, hvor uengagerede lunge væv områder har en samlet lavere massefylde end cellulære og caseum (mindre væv der dækker den samme relative areal) på grund af tilstedeværelsen af flere åbne bronchioles og alveolære rum. Virkningerne af denne forskel i densitet kan afbødes ved omhyggeligt tegning omkring de åbne rum for at undgå herunder dem inden for den kumulative areal af indsamlet væv (som vist i figur 2).
En yderligere begrænsning er, at metoden præsenteres LCM-LC/MS kun kvantificerer samlede stof koncentration inden for den isolerede væv (ligesom alle væv homogenisering, opløsningsmiddelekstraktion og LC/MS kvantificering tilgange) og løser ikke protein-bundet drug koncentrationer fra ubundne fraktioner. Mikrodalyse er en alternativ metode til kvantificering af ubundne stof i væv og giver mulighed for nøjagtig kvantificering af gratis narkotika koncentrationer at nå ekstracellulære populationer af bakterier13. Men teknikken ville bedst anvendes som en supplerende tilgang, som det mangler den rumlige specificitet af LCM-LC/MS og kun kvantificerer opløseligt stof niveauer inden for væv ekstracellulære væske, ikke den intracellulære indhold.
Vi har kombineret, for første gang, LCM og LC/MS rumligt kvantificere antibiotika på tuberkulose infektionsstedet. Metoden er enormt kraftfulde, da den kan anvendes til enhver lille molekyle stof anvendes i enhver stat, sygdom. Faktisk har vi for nylig kvantificeret et svampedræbende lægemiddelkandidat i en musemodel af abdominal candidiasis14. Differential stof partitionering i heterogene tumor rum (herunder nekrotisk kerner) er en primære bekymring i behandlingen af kræft, og et kritisk område for forskning i kræft drug discovery15. LCM-LC/MS er velegnet til at henvende sig til disse spørgsmål. Derudover LCM-LC/MS kan bruges til biomarkør discovery at kvantificere metaboliske, lipidomic og proteom forandringer opstår i væv regioner og cellepopulationer under sygdom patogenese.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi takke Paul O'Brien, Marizel Mina og Isabella Freedman for dyreforsøg, Jacquie Gonzalez og Danielle Weiner fra NIH/NIAID for hjælp med gammastråling af kanin væv inden laser fange microdissection og Jansy Sarathy for manuskript tanker og råd. Dette arbejde blev støttet af midler fra Bill og Melinda Gates Foundation (OPP1174780) og NIH delt instrumentation give 1S10OD018072. Vi takker Eliseo A. Eugenin for at give adgang til Leica LMD 6500 mikroskop og deling af ekspertise og rådgivning. Køb og løbende support, LMD 6500 blev finansieret af The National Institute of Mental Health grant, MH096625, National Institute for neurologiske forstyrrelser og slagtilfælde, NS105584, PHRI (til E.A.E) og GSK bidrag (til E.A.E).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| New Zealand White rabbits | Covance | N/A | |
| HN878 Mycobacterium tuberculosis | BEI Resources | NR-13647 | |
| Ketathesia (Ketamine) 100 mg/mL C3N | Henry Schein Animal Health | 56344 | |
| Anased (Xylazine) 100 mg/mL | Henry Schein Animal Health | 33198 | |
| Euthasol (pentobarbital sodium and phenytoin sodium) Solution | Virbac | 710101 | |
| Acetonitrile (LC-MS grade) | Fisher | A955-212 | |
| Methanol (LC-MS grade) | Fisher | A456-212 | |
| Formic Acid (LC-MS grade) | Fisher | A117-50 | |
| Water (LC-MS grade) | Fisher | W6212 | |
| 0.2 mL flat-cap PCR tubes | Corning | 07-200-392 | |
| Steel frames, PET-membrane | Leica | 11505151 | |
| Premium Frosted Microscope Slides | Fisher | 12-544-2 | |
| 96 Deep well plate 2.0ML PP RB | Fisher | NC0363259 | |
| Zorbax SB-C8 column (4.6 by 50 mm; particle size, 3.5 μm) | Agilent | 820631-001D | |
| "Zipper” Seal Sample Bags | Fisher | 01-816-1B | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| CM1850 cryostat | Leica | Discontinued | Leica CM1860 is the current model |
| Laser Microdissection System 6500 | Leica | Discontinued | Leica LMD 6 is the current model |
| Agilent 1260 Infinity II HPLC | Agilent | ||
| API 4000 QTRAP Mass Spectrometer | Sciex |
References
- Dartois, V. The path of anti-tuberculosis drugs: From blood to lesions to mycobacterial cells. Nat Rev Microbiol. 12 (3), 159-167 (2014).
- Prideaux, B., et al. The association between sterilizing activity and drug distribution into tuberculosis lesions. Nat Med. 21 (10), 1223-1227 (2015).
- Prideaux, B., et al. High-sensitivity MALDI-MRM-MS imaging of moxifloxacin distribution in tuberculosis-infected rabbit lungs and granulomatous lesions. Anal Chem. 83 (6), 2112-2118 (2011).
- Roscioli, K. M., et al. Desorption electrospray ionization (DESI) with atmospheric pressure ion mobility spectrometry for drug detection. Analyst. 139 (7), 1740-1750 (2014).
- Prideaux, B., et al. Mass spectrometry imaging of levofloxacin distribution in TB-infected pulmonary lesions by MALDI-MSI and continuous liquid microjunction surface sampling. Int J Mass Spectrom. 377, 699-708 (2015).
- Griffiths, R. L., Randall, E. C., Race, A. M., Bunch, J., Cooper, H. J. Raster-mode continuous-flow liquid microjunction mass spectrometry imaging of proteins in thin tissue sections. Anal Chem. 89 (11), 5683-5687 (2017).
- Prideaux, B., Stoeckli, M. Mass spectrometry imaging for drug distribution studies. J Proteomics. 75 (16), 4999-5013 (2012).
- Dilillo, M., et al. Mass spectrometry imaging, laser capture microdissection, and LC-MS/MS of the same tissue section. J Proteome Res. 16 (8), 2993-3001 (2017).
- Xu, B. J. Combining laser capture microdissection and proteomics: methodologies and clinical applications. Proteomics Clin Appl. 4 (2), 116-123 (2010).
- Cahill, J. F., Kertesz, V., Van Berkel, G. J. Laser dissection sampling modes for direct mass spectral analysis. Rapid Commun Mass Spectrom. 30 (5), 611-619 (2016).
- Subbian, S., et al. Chronic pulmonary cavitary tuberculosis in rabbits: A failed host immune response. Open Biol. 1 (4), 110016 (2011).
- Zimmerman, M., et al. Ethambutol partitioning in tuberculous pulmonary lesions explains its clinical efficacy. Antimicrob Agents Chemother. 61 (9), (2017).
- Kempker, R. R., et al. Cavitary penetration of levofloxacin among patients with multidrug-resistant tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother. 59 (6), 3149-3155 (2015).
- Zhao, Y., et al. Unraveling drug penetration of echinocandin antifungals at the site of infection in an intra-abdominal abscess model. Antimicrob Agents Chemother. , (2017).
- Pascal, J., et al. Mechanistic modeling identifies drug-uptake history as predictor of tumor drug resistance and nano-carrier-mediated response. ACS Nano. 7 (12), 11174-11182 (2013).
