Summary
Burada, LC/MS analizi ile birleştiğinde lazer yakalama mikrodiseksiyon dağınık şekilde ölçmek-akciğer tüberkülozu granülomlar içinde uyuşturucu dağıtımı için bir iletişim kuralı'nı açıklar. Yaklaşım ilaç konsantrasyonları yüksek uzaysal detay dokularda miktarının için geniş uygulanabilirliği vardır.
Abstract
Tüberküloz hala morbidite ve mortalite dünya çapında önde gelen bir nedenidir. İlerleme-e doğru mevcut uyuşturucu rejimleri ve roman therapeutics gelişimi şiddetle ihtiyaç vardır. Ulaşmak ve bakteri kötü skarların nekrotik bölgeler (caseum), pulmoner granülomlar içinde sterilize etmek için biraz dozlayıp TB uyuşturucu başarılı terapötik müdahale için çok önemli bir özelliğidir. Etkili tedavi rejimleri bu nedenle uyuşturucu ile olumlu caseum penetrasyon özellikleri içermesi gerekir. Biyolojik dokuların seviyelerinde ilaç miktarının geçerli LC/MS yöntemler sınırlı Uzaysal çözünürlük yetenekleri, doğru küçük doku bölmeleri içinde bulunanlar gibi içinde mutlak ilaç konsantrasyonu belirlemek üzere nekrotik granülomlar. Burada lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM) patolojik olarak farklı doku bölgeleri LC/MS miktar ile birleştiren bir iletişim kuralı mevcut. Bu teknik granuloma caseum, hücresel lezyon ve ilişki kurmadan Akciğer doku çevreleyen içinde ilaçların mutlak miktar sağlar ve bu nedenle, doğru bir şekilde bakterisidal konsantrasyonları elde olup olmadığını belirler. Tüberküloz araştırma ek olarak, teknik hastalıklı dokularda dağınık şekilde çözülmüş miktar uyuşturucu için birçok potansiyel uygulamalar var.
Introduction
Dağınık şekilde çözme ve ilaç düzeyleri ölçmek özelliğini Anti-tüberküloz ilaçlar bakteriyel altgrupları konsantrasyonları1sterilize, akciğer lezyonları içinde ulaşmak olup olmadığını belirlemek için çok önemli bir gereksinimdir. Belirli önemi uyuşturucu penetrasyon (caseum denir) lezyon genellikle basiller en yüksek sayısını içerir ve ilaçlara vaskülarizasyon yokluğu nedeniyle erişilebilir olabilir nekrotik çekirdek içine belirliyor.
Homojenizasyon eksize pulmoner lezyonların dahil lezyon penetrasyon, değerlendirmek için geleneksel yöntemleri ardından solvent ekstraksiyon ve sıvı Kromatografi Kütle spektrometresi (LC/MS) analizi, son derece hassas ve uyuşturucu için seçici faiz. Ancak, bu yöntemleri özgün homojenize doku boyutunu sınırlı yoksul mekansal bilgi sunuyoruz. Kütle spektrometresi tabanlı görüntüleme yaklaşımlar, matris yardımlı lazer desorpsiyon iyonlaşma (maldı)2,3gibi electrospray iyonlaşma (DESI)4 ya da yüzey çıkarma sıvı gelişmiş5desorption, 6 teklif görüntüleme yetenekleri son derece dağınık şekilde çözüldü, ama doğrudan miktar son derece zor ya da imkansız heterojen iyon bastırma etkileri ve çeşitli hücreden analit farklı ayıklama verimliliği nedeniyle olabilir veya doku7türleri. Ayrıca, en doğrudan doku MS görüntüleme yaklaşımlar doğal olarak daha az LC/MS iyonlaşma ve uyuşturucu dokusundan daha düşük solvent ekstraksiyon verimliliği için rekabet endojen türlerin Kromatografik ayırma eksikliği nedeniyle daha duyarlıdır.
LC/MS analizi ile kombine lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM) yalıtmak ve proteomik8,9 çalışmalar için farklı doku bölgeleri karakterize için rutin olarak uygulanan ve son zamanlarda uyuşturucu miktar için kullanılan içinde ilaç hayvan doku10. Burada en iyi duruma getirilmiş bir protokol farklı Granülom bölmeleri içinde anti-TB uyuşturucu ölçmek için LCM LC/MS (LCM-LC/MS) analizi ile birlikte uygulama mevcut. Lazer yakalama mikrodiseksiyon işlemi bir UV lazer ile mikroskop objektif keser ve kullanıcı tarafından tanımlanan bir yolu takip ederek istenilen doku alan izole doku bölümü üzerine odaklanmıştır. Yerçekimi destekli LCM için (Bu araştırma için kullanılan teknik), doku bölümü (PET veya kalem) bir ince polimer membran slayt monte edilir ve doku slayt oturtulmuş bir koleksiyon tüp şapkalı yakalanır. Uyuşturucu eksize dokudan ayıklanır ve standart LC/MS yaklaşımları kullanarak sayılabilir. Doku toplanması için gerekli miktarı sonuçta dokuda mevcut uyuşturucu beklenen konsantrasyonu ve LC/MS yöntemi duyarlılık belirlenir. Terapötik düzeyde ilaç ve bir rutin triple quadrupole Kütle Spektrometre, 3 milyon µm2 (3 mm2) dokusunun kullanılarak analiz ilaçların çoğu analizleri için yüzey alanı yeterlidir.
Bu iletişim kuralı kayma profil oluşturma güçlü bir kombinasyon açıklar ve mutlak ilaç konsantrasyonları TB granülomlar bütün bölümler içinde sağlayan tam miktar LCM-LC/MS tarafından sunulan. Teknik aynı zamanda birçok farklı hastalıklı dokuları hayati ilaç bulma ve geliştirme bilgi veren konsantrasyonlarda uyuşturucu belirlemek için uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan çalışmaları doğrultusunda Kılavuzu bakım ve kullanım laboratuvar hayvanları Ulusal Sağlık Enstitüleri ile kurumsal hayvan bakım onayını ve kullanım Komitesi, NIAID (NIH), Bethesda, MD için yapılmıştır
1. hayvan deneyleri ve doku koleksiyonu
Bu bölümde Protokolü'nün hayvan yordamlar ve örnek koleksiyon Biyogüvenlik seviye 3 (BSL3) koşullar altında açıklanmaktadır. Protokol tavşanların Mycobacterium tüberküloz aerosol enfeksiyon yordam ve İlaç İdaresi detaylı iletişim kuralları daha önce açıklanan11,12.
- Yeni Zelanda beyaz tavşan (erkek ve kadın, 4-5 aylık) M. tuberculosis HN878 ile enfekte bir salt burun aerosol sistemi kullanarak, daha önce açıklanan11.
- Seçilen ilaçlar (burada sunulan örnekte etambutol) tercih edilen rota yönetmek ve hayvanlar 2, 6 ve 24 h yönetim takip ötenazi. İlk olarak, tavşan tarafından ketamin 5 mg/kg kas içi enjeksiyon 35 mg/kg ve Xylazine anestezi. 10 dakika bekleyin ve doğru anesthetization kuyruk pinching ve yavaşça göz dokunmadan onaylayın. Herhangi bir tepki ise, Fentobarbital ve fenitoin ( Tablo malzemelerigörmek) intravenöz yönetimi tarafından 1 mL/4.5 kg 2 mL steril serum fizyolojik içinde ötenazi.
Not: Bu timepoints farmakokinetik profil etambutol için karşılamak için en iyi durumda ve ayarlama/diğer çalışma uyuşturucu için en iyi duruma getirme gerektirebilir. - Pens, makas ve/veya skalpel kullanarak, akciğerler göğüs boşluğundan Kaldır, akciğer biyopsisi (3daha önce açıklandığı gibi) ilişki kurmadan Akciğer doku çevreleyen gömülü büyük nekrotik granülomlar içeren çıkarabileceğim. Nekrotik granülomlar görünür içinde bej renk ve genellikle biraz çıkıntı çevreleyen kırmızı/pembe renkli akciğer. Kolay cryosectioning kolaylaştırmak için biyopsiler 2 x 1.5 x 1,5 cm büyük olduğundan emin olun.
- Forseps kullanarak, önceden etiketli cryomold tepsi istenen kesme yüzeyi üzerine biyopsi tepsiyi Bankası ile doğrudan temas yerleştirin. Sonra dondurma, bu hangi cryosections keserim düz bir yüzey sağlar.
- Sıvı azot buharı biyopsiyi durdur. Bir styrofoam konteyner 2 inç derinliğe kadar sıvı azot ile doldurun ve bir metal tel tüp rafa yerleştirin. Raf düz bir yüzey üzerinde doku tepsiler yerleştirilir sağlayan sıvı azot yüzeyi üzerinde çıkıntı. Kapağı geri styrofoam konteyner üzerinde yerleştirin ve dokuları tam olarak dondurmak 10 dakika bırakın.
- Doku tepsileri kaldırın, hızlı bir şekilde alüminyum filmde sarın ve tek tek resealable plastik torbalar ve mühür etiketli yerleştirin. -80 ° C dondurucu depolama için transfer.
Not: Adımlar 1.1-1.6 (tüm hayvan iş de dahil olmak üzere ve hastalıklı organ ve dokulara işleme) BSL3 koşullarda gerçekleştirilir. Gama ışınlatayım BSL3 kapsama dışında işlemeyi etkinleştirmek IÇIN 3 Megarads, akciğer biyopsisi. Lazer yakalama mikrodiseksiyon unsterilized doku üzerinde güvenlik protokollerini onaylandığı takdirde tesis kilometresi BLS3 içinde gerçekleştirilebilir. Ancak, bu iletişim kuralını kalan BSL-2 tesiste aşağı akım işleme açıklar.
2. doku kesit
- Cryostat istenen kesme sıcaklık ayarlayın. Gama radyasyona maruz akciğer biyopsisi için cryostat-80 ° C depolama ortamından aktarmak ve doku sıcaklık equilibrate 30 dakika bekletin. Not:-22 ° C-20-TB Lezyondan biyopsi için en uygunudur.
- Cımbız kullanarak, Chuck doku Bankası bağlı kalmak için en uygun kesme sıcaklık yapıştırıcı (OCT) küçük bir miktar kullanarak cryostat Chuck biyopsi düzeltmek. Doku (yani cryomold Bankası ile temas oldu) düz yüzey kesme maruz yüzeydir gelecek şekilde yönlendirin. Bu sonraki kütle spektrometresi analizi ile girişime neden olabilir gibi OKT doku yüzeyi kontamine değil emin olun.
- Üç doku bölüm 25 µm kalınlık, kesme ve evde beslenen hayvan membran slaytlar monte. Yavaşça membran doku bölümüne dokunma ve kaldırın. Çok fazla baskı uygulanırsa, ince zar gözyaşı.
- Bu şarj edilmiş ve zavallı yapışma doku bölümlerin olma evde beslenen hayvan membran yol açar gibi montaj öncesinde slaytlar aşırı kullanımı önlemek. Membran slayt tezcan-montaj ve başarılı yapışma doku membran için etkinleştirmek için oda sıcaklığında tutulur emin olun.
- Slayt cryostat kaldırmak ve 3 dakika kurumasını bekleyin. LCM-LC/MS/MS hemen gerçekleştirilmez, slayt küçük hava geçirmez yapışmalı çanta ve diseksiyon için gerekli kadar-80 ° C depolama birimine transfer kapatın.
- 10-12 µm ve tezcan-mount Hematoksilen ve Eozin (H & E) Boyama ve referans için standart cam slayt üzerindeki bitişik bir bölüm kesmek. Ek bölümler (Mycobacterium tüberküloz (MTB) görüntülenmesi için Ziehl-Niellsen gibi) diğer istenen histochemistry lekeler için şu anda kesebilir.
3. mikrodiseksiyon
- -80 ° C depolama slayt içeren mühürlü torba kaldırmak ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca ulaşmak için izin verir.
Not: soğuk slayt hemen laboratuvar atmosfer yararlanılır, doku yoğunlaşma ile kaplı olmak ve ilaç kayma bütünlüğünü tehlikeye olabilir. - Mikroskop ve lazer açın (kesme başlamak önce lazer 5-10 dakika kadar sıcak gerektirir). Düz-cap 0.20 mL PCR tüpleri yuvasına yükleyin.
- Slayt çantasından çıkarın ve Düz Yataklı Tarayıcı kullanarak evde beslenen hayvan slayt üzerinde doku bölümünün bir optik görüntü al.
- Slayt Slayt tutucusuna (doku yüzü aşağı bakacak şekilde) koyun ve ayrı toplama tüpler istimal mikroskop bilgisayar yazılımı ilgi belirli Granülom bölgelerine atayabilirsiniz. Genellikle, bunlar-ecek var olmak 'ilişki kurmadan akciğer,' 'hücresel Granülomu,' ve 'caseum' (nekrotik Merkez), ama olabilir Granülom/biyopsi belirli patoloji bağlı olarak değişir.
- 5 X mikroskop objektif kullanarak doku odaklanmak. Bu büyütme dokusu hem hücresel ve nekrotik Granülom alanları içeren iyi bir bakış sağlamak. Yazılımda konum'un altında doku içine taşımak için 'caseum' belirlenmiş tüp seçin.
- İstenen diseksiyon parametrelerini girin. Lazer güç 30, hız 15 ve diyafram 35 (rasgele adet) 25 µm kalınlığında akciğer bölüm için tipik ayarlarıdır. Ancak, bunlar kullanılan mikroskop ve güç lazer yaş nedeniyle azalan potansiyel bağlı olarak farklı olacaktır.
- 'Ücretsiz-beraberlik' aracını seçin ve bir fare veya dokunmatik ekran kalemi kullanarak, istenilen bölge diseksiyon için anahat. Bölgesinin yüzey alanı-ecek var olmak göstermek içinde belgili tanımlık bilgisayar yazılımı. Seçili bölgeler daha kolay diseksiyon kolaylaştırmak için 500.000 µm2 (0,5 mm2) altında tutun. Tüp şapkalı toplam 3 milyon µm2 (3 mm2) toplanan kadar diseksiyon yineleyin.
- Bazı durumlarda, disseke bölge (örneğin statik cazibe) nedeniyle çevredeki membran için takılıp kalır ve koleksiyon kap düşmek değil. Bu bölgeler seçerek ve el ile kaldırma yazılım içinde toplu yüzey alanındaki toplam silin.
- Cap 'hücresel lezyon' için seçin ve 3 milyon µm2 adım 3.7 belirtildiği gibi aynı işlem kullanılarak doku toplamak.
- Cap 'ilişki kurmadan akciğer' için seçin ve 3 milyon µm2 adım 3.7 belirtildiği gibi aynı işlem kullanılarak doku toplamak. İlişki kurmadan Akciğer doku birçok bronchioles ve alveoler alanlarda içerdiğini unutmayın. Bunlar diseksiyon için tanımlanmış doku bölgelerden dışlamak için dikkat.
- Kapak Tutucu kaldırmak ve dikkatle Açıl, mühür ve her tüpün etiket. Hava bozuklukları (gibi) hava akışı kesintileri bir açılış kapıdan itibaren çevreleyen disseke doku korumak. Disseke dokularda hemen, analiz veya-80 ° C'de depolayın ve önceden işleme ve LCMS analiz çözülme.
4. çıkarma ve LCMS analizi
- 1:1 Asetonitril/metanol etambutol d-10 dahili standart içeren ayıklama çözüm hazırlamak. Bir iç standart seçerken, kullanım analit uyuşturucu etiketli formun kararlı bir izotop önlemek için yeterli yığın shift ile (döteryum etiketli EMB Bu gösteride kullanılan gibi) çapraz konuşma analit uyuşturucu ve standart (genellikle en az 4 Dalton) arasında .
Not: çünkü çok sınırlı denetim doku homogenate standartları oluşturmak için ilgili doku türlerinin homogenate içinde standartları oluşturmak zordur. Standartları bir çivili homogenate örnek yapma alternatif olarak, bir standart boş doku ve test bileşik birlikte ve açılan ekleyerek oluşturulabilir. Hedef birimin çalışma örnek doku bölümler eşleştirir bir homogenate kontrol doku hacmi doğrudan verilen bir konsantrasyon mevcut olurdu test bileşik bir miktar ile birleştirilmiştir. - Yüzey alanı ve doku bölümü kalınlığına göre hedeflenen doku hacmi hesaplamak ve standart ve QC örnekleri-ecek var olmak mülhak homogenate hacmi kullanarak homogenate için gerekli seyreltme faktörü belirlemek. Hesaplamalar aşağıda 3 milyon µm2 (3 mm2) disseke hedef alanı için bir 25 µm kalınlık ve homogenate hacmi 2 µL ile gösterilmiştir.
- 1 g/mL, doku yoğunluğu varsayarak hazırlamak homogenate stok kontrol doku 50 mg ağırlığında ve sulandırmak için PBS arabellek ekleme (26.67 homogenate seyreltme faktörü kullanılarak hesaplanır adım 4.2, eritici 1.283 mL). Boncuk boncuk homogenizer 1750 devirde 5 dakika akciğer dokusu ve PBS arabellek yenerek tarafından lunaparkçı.
- 1 mg/mL ilaç stokları konsantrasyonu 1:1 Asetonitril/su çözümleri spiking standart eğri oluşturmak için sulandırmak. Spike birim ve hedef doku birimi temel standart konsantrasyonları spiking belirlemek. Bir 100 ng/mL için bir 10 µL spike birim için standart resimli örnektir.
- -80 ° C depolama microdissected dokulardan içeren tüpler kaldırın ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca ulaşmak için izin.
- 1:1 Asetonitril/su çözüm 10 µL ve PBS arabelleğinin 2 µL microdissected doku içeren tüpler ekleyin.
- Standart eğri ve kalite kontrol tüpleri için eriyik-e doğru kontrol akciğer homogenate 2 µL spiking 10 µL ekleyin.
- Ayıklama çözüm 50 µL her tüp için ekleyin.
- Girdap her tüpün 5 dakika, 5 dakika için solüsyon içeren temizleyicide ve Pelet film ve her tüpün doku oluşturmak için 5000 devirde 5 dakika santrifüj kapasitesi.
- 96-şey derin-şey plakasına süpernatant ile 50 µL aktarmak ve bir ek 50 µL her şey deiyonize su ile sulandırmak.
- Etambutol ve etambutol-d10 iç standart (daha önce ayrıntılı12' açıklandığı gibi) için en iyi duruma getirilmiş enstrüman parametrelerini kullanarak LC/MS/MS çözümlemesi gerçekleştirin.
- Seyreltme faktörü her örnek için disseke doku miktarı için düzeltmek için kullanın.
5. yöntemi doğrulama
- Bir homogenate 1 Bölüm akciğer, 2 parça PBS ve 3-4 çelik boncuk birleştirerek denetim akciğer dokusunda oluşturun. Akciğer dokusu ve PBS arabellek 1750 devirde boncuk homogenizer kullanarak 5 dakika yendi.
- Homogenate 10.000 ng/mL (10 mg/mL) ve girdap son konsantrasyon 1 dakika oluşturmak için 990 µL homogenate içine 1 mg/ml etambutol DMSO hisse senedi 10 µL ekleyerek spike.
- Tarafından homogenate bir cryomold dökme ve hızla 5 dakika kuru buza buz gibi donmuş homogenate Bloğu Oluştur.
- 2.1-2,5 adımlarda açıklandığı gibi homogenate blok 25 µm kalınlığında bölümleri hazırlayın.
- Hedef doku alan adımları 3.2-3.10 belirtildiği gibi incelemek.
- 10 µL 1:1 Asetonitril/su ve 2 µL PBS arabelleği microdissected doku içeren tüpler ekleyin.
- Ayıklama çözüm 50 µL her tüp için ekleyin. Standart bir eğri oluşturmak ve doku homogenate blok içinde ilaç konsantrasyonu belirlemek için 4,9-4.12 adımları izleyin.
- Ayıklama verimliliği aşağıdaki formülü kullanarak hesaplar:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
LCM-LC/MS yaklaşım genel bakış şekil 1' de gösterilen. Gama-ışın tarafından doku sterilize sonra (doku itibaren kesit) üzerinden tüm sonraki adımları BSL3 koşullar dışında gerçekleşecek. Şekil 2 lezyon öncesi ve sonrası doku yalıtım LCM tarafından biyopsisi bölümleri gösterir. TB lezyonlar nekrotik ve hücresel bölgelerin kolayca tespit ve optik görüntü (olmadan bitişik doku histolojik olarak lekeli bölümlerine başvurmak için gereklilik) yalnız görsel denetim tarafından izole. Diseksiyon işlemi çevreleyen doku için en az düzeyde rahatsızlık ile düzgün bir kesik yapar ve 3 milyon dissekan µm2 (3 mm2) lezyonlar dan ilgi her bölgesinin yaklaşık 1 saat toplamda alır.
Ayıklama verimliliği ve LCM-LC/MS yöntemi kararlılığını değerlendirildi etambutol EMB-çivili akciğer homogenate (Tablo 1) kullanarak. İlacın tam ayıklama gözlendi ve hiçbir ilaç istikrar sorunları diseksiyon ve çıkarma işleminde tespit edildi. LCM-LC/MS çıkarma ve miktar Protokolü daha da kurulan LC/MS miktar yöntemleri aynı dokuların uygulanan karşılaştırarak doğrulandı. Nekrotik akciğer TB lezyonlar ve standart doku homojenizasyon tarafından sunulan zavallı kayma özgüllük doğasında heterojen nedeniyle, biz doğrudan ilişki kurmadan akciğer her ikisi için de analiz konsantrasyonlarda uyuşturucu karşılaştırarak LCM-LC/MS yöntemi doğrulanmış analitik teknikler (nedeniyle onun nispeten yüksek doku homojenliği). Tablo 2 tarafından değerlendirilen olarak üç etambutol ilaç tavşan alınan biyopsi dan ilişki kurmadan akciğer ilaç konsantrasyonları gösterir: 1) 25 µm kalın doku bölümleri homojenizasyon ve standart LC/MS ve ilişki kurmadan akciğer analizini 2) LCM-LC/MS tarafından analiz bir bitişik 25 µm kalın doku bölümünden alınan alanları. Verileri iki yaklaşım tutarlı miktar veri, rutin kayma miktar uygunluk gösteren üretmek gösterir.
Dağınık şekilde ölçmek-akciğer lezyonları içinde birçok mevcut ve yeni anti-TB uyuşturucu LCM-LC/MS başvurdum. Şekil 3A biraz dozlayıp kararlı durum MTB-enfekte tavşan etambutol ile örnek verileri gösterir. LCM-LC/MS caseum, hücresel lezyon ve ilişki kurmadan Akciğer doku alanları içinde çözülmüş ilacın tam miktar etkin. EMB de lezyon nüfuz ve sterilize konsantrasyonları nekrotik caseum içinde ulaşmak gözlendi. Bir bitişik doku bölümünden alınan EMB dağıtım karşılık gelen maldı-MS görüntü şekil 3B' gösterilir. Nitel maldı-MS görüntüleri hücresel RIM ile karşılaştırıldığında nekrotik caseum tespit daha düşük ilaç konsantrasyonları ile de nicel LCM-LC/MS veri ile ilişkilendirir. LCM-LC/MS veri doku homogenates standart LC/MS tarafından analiz için doğrudan karşılaştırma tarafından doğrulandı.
Resim 1 : LCM-LC/MS işleminin şematik. Tavşan akciğer biyopsisi ile birlikte ilişki kurmadan akciğer çevreleyen nekrotik lezyon içeren toplanan ve dondurulmuş. Cryosections ince evde beslenen hayvan membranlar kesilir ve ilişki kurmadan akciğer, hücresel ve caseous lezyon bölgelerinde disseke ve miktar için LC/MS. adapte tarafından izole--dan Zimmerman vd. 12 Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Lezyon (A, B) ve (A, C) önce mikroskop kullanarak görüntülendiğinde görünür ilişki kurmadan akciğer (C, D) olarak onlar ve sonra (B, D) mikrodiseksiyon. Caseous lezyon alanları daha koyu ve 'kırık' optik görüntü tarama (bir, yeşil anahat) olarak görünür. Hücresel lezyon renkli daha hafif ve daha sağlam yapısı (A, kırmızı anahat). İlişki kurmadan akciğer en az 5 mm lezyon sınır uzak örneklenmiş ve kırmızı/pembe renkte (C, camgöbeği anahat) görünür. Ölçek çubukları (siyah, mavi ve mor) 400 µm. sadece düz alanlar ilişki kurmadan akciğer dokusunun (D içinde gösterildiği gibi) toplanan Toplam yüzey alanındaki alveoler alanlarda ve bronchioles eklemeyi önlemek için seçilmesi gerekir Not =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : İki tavşan ile 100 mg/kg EMB 7 gün boyunca ilaç alınan Lezyondan biyopsi kümesinden örnek LCM-LC/MS. (A) ilaç olumlu penetrasyon içine tüm akciğer ve lezyon bölmeler görülmektedir. LCM-LC/MS (içi boş çubuk) /MS tarafından sayısal ilaç konsantrasyonları vardı güçlü sözleşmede bu homojenize disseke lezyon standart LC/MS tarafından sayılabilir (katı barlar, ortalama ± standart sapma, n = 3-8). Ekstrasellüler kopyalayan basiller (MBC99) % 99'u ve makrofajlar (iMBC99) hücre içi basiller % 99'u öldürmek için gereken en düşük konsantrasyonlarda gösterilir. (B) üst panel: maldı-MS görüntü EMB dağılımını gösteren bir bitişik doku bölümünde [M + H]+ iyon (m/z 205.193). MALDI-MS görüntü EMB zavallı penetrasyon içine caseum algılama (lod olarak) tekniği alt sınırın altına varlık mevcut ilaç konsantrasyonları nedeniyle öneriyor unutmayın. Ancak, kayma özgüllük ve üstün LOD, LCM-LC/MS ilacı sterilize konsantrasyonları caseum de dahil olmak üzere bütün lezyon bölümler içinde ulaşıyor göstermektedir. Alt paneli: Hematoksilen ve Eozin lekeli doku bölümü maldı MSI için kullanılan kısmına bitişik. Doku Cellular (C) ve nekrotik granülomlar (NG) bulundu. Caseum çekirdek beyaz olarak sıraladı. Zimmerman ve ark. adapte 12 Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Disseke alan (µm2) | Ölçülen EMB konsantrasyonlu (ng/g) (n = 3) | EMB kurtarma (%) (n = 3) |
| 3 milyon | 10633 (±404) | 106 (±4) |
| 5 milyon | 10057 (±1132) | 101 (±11) |
| 10 milyon | 10563 (±1128) | 105 (±11) |
Tablo 1: Ayıklama verimliliğini EMB akciğerde miktarının için LC-LC/MS yöntemi. EMB tam kurtarma tüm değerlendirilmiş doku birimleri için çivili EMB akciğer homogenate disseke dokularda gözlendi.
| Tavşan kimliği | LC/MS EMB (ng/g) | LCM-LC/MS EMB (ng/g) | Fark (%) |
| 899 | 2910 | 3320 | 14 |
| 904 | 2010 | 1870 | -7 |
| 911'i | 2150 | 2370 | 9 |
Tablo 2: İlişki kurmadan akciğer biyopsisi LC/MS ve LCM-LC/Bayan tarafından 3 biraz dozlayıp tavşan üzerinden EMB karşılaştırma miktar Eşdeğer ilaç konsantrasyonları yöntemleri ve sinyal bozulması nedeniyle kaybı olmaksızın tarafından tespit edildi ya da çıkarma LCM-LC/MS işlemi sırasında gözlendi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dağınık şekilde çözülmüş miktar akciğer TB lezyonlar içinde ilaçların ilaç pozlama sterilize konsantrasyonları bakteriyel nüfus farklı lezyon bölmeleri içinde ikamet eden ulaşır olup olmadığını belirlemek için gereklidir. Burada açıklanan LCM-LC/MS yöntemi kullanarak yalnızca 1-3 doku bölümleri toplam bakteri açısından zengin caseum de dahil olmak üzere bütün lezyon bölümler içinde anti-TB ilaçların mutlak miktar sağlar. Geleneksel doku homojenizasyon ve LC/MS yaklaşımlar için sık sık uyuşturucu miktar doku eksikliği belirli lezyon bölmeleri gidermek için kayma özgüllük ve hatta mümkün olduğunda, cep çapraz kirletmek önemli potansiyel yoktur ve nekrotik lezyon alanları el ile ayıklama işlemi sırasında.
LCM-LC/MS yaklaşım kütle spektrometresi dayalı görüntüleme teknolojileri için birkaç önemli avantajları vardır. Yöntem tam olarak nicel yeteneklerini ve uyuşturucu türlerden müdahale/bastırmak endojen Kromatografik ayırma ile çözme nedeniyle LC/MS analizi ek duyarlılık bunların arasında birincil. Ancak, maldı-MSI mekansal bilgi ilaç dağıtım ile ilgili daha ayrıntılı sağlar. MALDI-MSI ve LCM-LC/MS/MS donmuş doku bölümler oluşturmak için aynı örnek hazırlık adımları gerektiği, iki teknik tandem uyuşturucu tam miktar yanında çok detaylı görüntüleme sağlayan aynı doku biyopsisi üzerinde gerçekleştirilebilir dağıtım. Daha yüksek analitik hassasiyet gereksinimini örneği şekil 3' te gösterilmiştir. Sadece çok az düzeyde EMB sinyal caseum penetrasyon uyuşturucu kötüdür düşündüren Merkezi nekrotik Granülom bölgede ( şekil 3B' olarak gösterilen) maldı MS görüntünün tespit edildi. Ancak, algılama LCM-LC/MS üstün sınırı nedeniyle ilaç açıkça bu bölme içinde sterilize konsantrasyonları ulaşmak için gösterilmiştir ve mevcut ilaç konsantrasyonu maldı (şekil 3A) tarafından ağırlıklı olarak tespit edilemez.
Doku boyama iletişim kuralları genellikle LCM proteomik uygulamalar için önce doku alanlarda kolay tanımlanması ve içinde yer alan hücre popülasyonlarının etkinleştirmek için kullanılır. Adımları yer yıkama birçok çözücü ilaç doku bölümünden delocalize gibi H & E uyuşturucu miktar ile uyumlu değildir gibi rutin histochemical lekeleri. Bitişik kesme bölümleri ile H & E lekeli ve mikrodiseksiyon için bir kılavuz kullanılır. Lezyon bölmeleri optik (Şekil 2) standart LCM aydınlık alan mikroskop altında çözülebilir gibi Ancak, bu genellikle gerekli değildir.
En iyi duruma getirme kesit ve mikrodiseksiyon adımları başarılı lezyon miktar için önemlidir. Yöntem geliştirilmesi sırasında iki farklı membran malzeme, polietilen tereftalat (PET) ve polietilen Naftalin (PEN), alt katman mikrodiseksiyon için doku bölümleri montaj için olarak değerlendirildi. KALEM membran üzerinden artan statik şarj evde beslenen hayvan membranlar ile karşılaştırıldığında acı ve tüm disseke doku alanlarda yaklaşık % 30'u disseke doku bölge ve membran arasındaki statik çekim nedeniyle kayboldu. Bu nedenle, evde beslenen hayvan membranlar gözlenen önemli ölçüde azaltılmış statik çekim nedeniyle gelecek gruptakiler için seçilmiştir (%5 evde beslenen hayvan membranlar disseke bölgelerin LCM işlemi sırasında kayboldu sadece).
Bir LCM-LC/MS çalışma tasarlarken istikrar içinde doku bölümleri ilaçların önemli bir noktadır. Kesit ve diseksiyon işlemi sırasında doku bölümler laboratuvar sıcaklık ve ışık için en az 1 saat süreyle maruz kalır. Hiçbir homojenizasyon adım dahil olduğu göz önünde bulundurulacak diğer konular doku bölümlerden uyuşturucu ayıklama verimliliğini yer alıyor (ayıklama sadece girdap karıştırma ve sonication tarafından yapılır). Deneyim, çıkarma doku homojenizasyon yüksek ayıklama çözücü nedeniyle eksikliğinden kullanılan doku oranını ve disseke doku bölümleri inceliği için zarar vermez. Microdissected doku bölümlerinde nerede uyuşturucu tam çekme--dan doku 20 µm ve 40 µm kalınlığında gözlendi beyin ve karaciğer, propranolol ölçmek için geliştirilmiş bir daha önce açıklanan online LCM-LC/MS yöntemi ile anlaşma bizim gözlemler vardır Bölüm10. Biz uyuşturucu ayıklama verimliliğini doğrulanmış ve doğrudan Akciğer doku konsantrasyonları (gelen aynı tavşan ve Akciğer lobu) karşılaştırarak LCM işlemi sırasında uyuşturucu istikrar LCM-LC/MS tarafından standart doku tarafından belirlenen konsantrasyonları ile analiz homojenizasyon ve LC/MS (bir örnek Tablo 1' de gösterilmiştir). Bu karşılaştırma iki metodolojileri arasında sinyal herhangi bir değişiklik meydana gelen olup olmadığını belirlemek için bize izin verir.
İlaç düzeyleri miktarının doku yüzey alanı veya birimin alarak disseke doku bölgeleri yoğunluğu da önemli bir noktadır. Özellikle endişe içinde ilişki kurmadan Akciğer doku alanları var cep ve caseum daha genel olarak daha düşük bir yoğunluğu (aynı göreli yüzey alanı kapsayan daha az doku) birden çok açık bronchioles varlığı nedeniyle akciğer ve lezyonlar biyopsi için bu ve alveoler alanlarda. Dikkatle onları toplanan doku toplu yüzey alanı içinde ( Şekil 2' de gösterildiği gibi) dahil olmak üzere önlemek için açık alanlar çevresinde çizerek bu yoğunluk farklılığı etkileri azaltılabilir.
Sunulan LCM-LC/MS yöntemi yalnızca toplam ilaç konsantrasyonu (tüm doku Homojenizasyon, solvent ekstraksiyon ve LC/MS miktar yaklaşımlar) ile ortak izole doku içinde quantifies ve does değil karar vermek ek bir kısıtlamadır protein bağlı ilaç konsantrasyonları ilişkisiz kesirler üzerinden. Microdialysis doku içinde ilişkisiz ilaç miktarının için alternatif bir yaklaşım ve ücretsiz ilaç konsantrasyonları bakteri13ekstraselüler nüfus ulaşan doğru miktar sağlar. LCM-LC/MS kayma özgüllük yoksun ve sadece doku hücre dışı sıvı, hücre içi içerik içinde çözünür ilaç düzeyleri quantifies gibi Ancak, tekniği en iyi tamamlayıcı bir yaklaşım uygulanır.
Biz, ilk kez, LCM ve LC/MS dağınık şekilde antibiyotik tüberküloz enfeksiyon yerinde ölçmek için birleştirdik. Metodoloji derece güçlü olduğu için herhangi bir hastalık durumunda kullanılan herhangi bir küçük molekül ilaç için uygulanabilir. Nitekim, son zamanlarda bir antifungal ilaç aday karın kandidiyazis14, bir fare modeli sayısal. Fark uyuşturucu heterojen tümör bölmeleri (nekrotik çekirdek de dahil olmak üzere) bölümleme kanser tedavisinde ve araştırma kanser ilaç keşif15dakika içinde kritik bir alan birincil bir sorundur. LCM-LC/MS bu soruları yaklaşım için idealdir. Ayrıca, LCM-LC/MS-ebilmek var olmak kullanılmış metabolik, ölçmek biyomarker keşif için lipidomic ve doku bölgeleri ve hücre popülasyonlarının hastalık patogenezinde sırasında meydana gelen proteomik değiştirir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Biz Paul O'Brien, Marizel Mina ve Isabella Freedman hayvan deneyleri için Jacquie Gonzalez ve Danielle Weiner NIH/NIAID dan önce lazer yakalama mikrodiseksiyon ve Jansy Sarathy tavşan doku el yazması için gama ışınlama ile yardım için teşekkür düşünce ve tavsiye. Bu eser Bill'den fon tarafından desteklendi ve Melinda Gates Vakfı (OPP1174780) ve paylaşılan NIH araçları 1S10OD018072 verin. Eliseo A. Eugenin Leica LMD 6500 mikroskop erişim sağlayan ve uzmanlık ve tavsiye paylaşımı için teşekkür ederiz. Satın alma ve devam eden desteğiyle LMD 6500 Ulusal Enstitüsü ruh sağlığı grant, MH096625, sinir hastalıkları Ulusal Enstitüsü ve kontur, NS105584, PHRI (E.A.E) finansman ve GSK katkılar (E.A.E) tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| New Zealand White rabbits | Covance | N/A | |
| HN878 Mycobacterium tuberculosis | BEI Resources | NR-13647 | |
| Ketathesia (Ketamine) 100 mg/mL C3N | Henry Schein Animal Health | 56344 | |
| Anased (Xylazine) 100 mg/mL | Henry Schein Animal Health | 33198 | |
| Euthasol (pentobarbital sodium and phenytoin sodium) Solution | Virbac | 710101 | |
| Acetonitrile (LC-MS grade) | Fisher | A955-212 | |
| Methanol (LC-MS grade) | Fisher | A456-212 | |
| Formic Acid (LC-MS grade) | Fisher | A117-50 | |
| Water (LC-MS grade) | Fisher | W6212 | |
| 0.2 mL flat-cap PCR tubes | Corning | 07-200-392 | |
| Steel frames, PET-membrane | Leica | 11505151 | |
| Premium Frosted Microscope Slides | Fisher | 12-544-2 | |
| 96 Deep well plate 2.0ML PP RB | Fisher | NC0363259 | |
| Zorbax SB-C8 column (4.6 by 50 mm; particle size, 3.5 μm) | Agilent | 820631-001D | |
| "Zipper” Seal Sample Bags | Fisher | 01-816-1B | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| CM1850 cryostat | Leica | Discontinued | Leica CM1860 is the current model |
| Laser Microdissection System 6500 | Leica | Discontinued | Leica LMD 6 is the current model |
| Agilent 1260 Infinity II HPLC | Agilent | ||
| API 4000 QTRAP Mass Spectrometer | Sciex |
References
- Dartois, V. The path of anti-tuberculosis drugs: From blood to lesions to mycobacterial cells. Nat Rev Microbiol. 12 (3), 159-167 (2014).
- Prideaux, B., et al. The association between sterilizing activity and drug distribution into tuberculosis lesions. Nat Med. 21 (10), 1223-1227 (2015).
- Prideaux, B., et al. High-sensitivity MALDI-MRM-MS imaging of moxifloxacin distribution in tuberculosis-infected rabbit lungs and granulomatous lesions. Anal Chem. 83 (6), 2112-2118 (2011).
- Roscioli, K. M., et al. Desorption electrospray ionization (DESI) with atmospheric pressure ion mobility spectrometry for drug detection. Analyst. 139 (7), 1740-1750 (2014).
- Prideaux, B., et al. Mass spectrometry imaging of levofloxacin distribution in TB-infected pulmonary lesions by MALDI-MSI and continuous liquid microjunction surface sampling. Int J Mass Spectrom. 377, 699-708 (2015).
- Griffiths, R. L., Randall, E. C., Race, A. M., Bunch, J., Cooper, H. J. Raster-mode continuous-flow liquid microjunction mass spectrometry imaging of proteins in thin tissue sections. Anal Chem. 89 (11), 5683-5687 (2017).
- Prideaux, B., Stoeckli, M. Mass spectrometry imaging for drug distribution studies. J Proteomics. 75 (16), 4999-5013 (2012).
- Dilillo, M., et al. Mass spectrometry imaging, laser capture microdissection, and LC-MS/MS of the same tissue section. J Proteome Res. 16 (8), 2993-3001 (2017).
- Xu, B. J. Combining laser capture microdissection and proteomics: methodologies and clinical applications. Proteomics Clin Appl. 4 (2), 116-123 (2010).
- Cahill, J. F., Kertesz, V., Van Berkel, G. J. Laser dissection sampling modes for direct mass spectral analysis. Rapid Commun Mass Spectrom. 30 (5), 611-619 (2016).
- Subbian, S., et al. Chronic pulmonary cavitary tuberculosis in rabbits: A failed host immune response. Open Biol. 1 (4), 110016 (2011).
- Zimmerman, M., et al. Ethambutol partitioning in tuberculous pulmonary lesions explains its clinical efficacy. Antimicrob Agents Chemother. 61 (9), (2017).
- Kempker, R. R., et al. Cavitary penetration of levofloxacin among patients with multidrug-resistant tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother. 59 (6), 3149-3155 (2015).
- Zhao, Y., et al. Unraveling drug penetration of echinocandin antifungals at the site of infection in an intra-abdominal abscess model. Antimicrob Agents Chemother. , (2017).
- Pascal, J., et al. Mechanistic modeling identifies drug-uptake history as predictor of tumor drug resistance and nano-carrier-mediated response. ACS Nano. 7 (12), 11174-11182 (2013).
