Summary
यहां, हम एक लेजर कब्जा microdissection नियंत्रण रेखा/एमएस विश्लेषण के साथ मिलकर स्थानिकी-फुफ्फुसीय तपेदिक granulomas के भीतर दवा वितरण यों का उपयोग कर प्रोटोकॉल का वर्णन । दृष्टिकोण उच्च स्थानिक विस्तार पर ऊतकों के भीतर दवा सांद्रता बढ़ाता है के लिए व्यापक प्रयोज्यता है ।
Abstract
तपेदिक अभी भी दुनिया भर में रुग्णता और मृत्यु का एक प्रमुख कारण है । मौजूदा औषध आहारों में सुधार और उपंयास चिकित्सीय विकास के लिए तत्काल आवश्यक हैं । खुराक टीबी दवाओं की क्षमता तक पहुँचने और खराब-संवहनी गल क्षेत्रों (caseum) फुफ्फुसीय granulomas के भीतर बैक्टीरिया को निष्फल करने के लिए सफल चिकित्सीय हस्तक्षेप के लिए महत्वपूर्ण है । प्रभावी चिकित्सकीय परहेजों इसलिए अनुकूल caseum प्रवेश संपत्तियों के साथ ड्रग्स शामिल होना चाहिए । वर्तमान नियंत्रण रेखा/एमएस विधि जैविक ऊतकों में दवा के स्तर को बढ़ाता है के लिए स्थानिक संकल्प क्षमताओं सीमित है, यह मुश्किल सही ऐसे भीतर पाया उन के रूप में छोटे ऊतक डिब्बों के भीतर निरपेक्ष दवा सांद्रता निर्धारित करने के लिए बना गल granulomas । यहां हम एक लेजर के संयोजन प्रोटोकॉल वर्तमान microdissection (LCM) रोग-नियंत्रण रेखा के साथ विशिष्ट ऊतक क्षेत्रों/ इस तकनीक ग्रेन्युलोमा caseum के भीतर दवाओं की निरपेक्ष ठहराव प्रदान करता है, सेलुलर घाव और फेफड़े के ऊतकों को शामिल आसपास और, इसलिए, सही है कि जीवाणुनाशक सांद्रता प्राप्त किया जा रहा है निर्धारित करता है । क्षय रोग अनुसंधान के अलावा, इस तकनीक में रोगग्रस्त ऊतकों में दवाओं के स्थानिक हल ठहराव के लिए कई संभावित आवेदन हैं ।
Introduction
विशेष रूप से समाधान और दवा के स्तर को बढ़ाता है की क्षमता का निर्धारण करने के लिए एक महत्वपूर्ण आवश्यकता है कि क्या एंटी-तपेदिक दवाओं फेफड़े के घावों के भीतर सांद्रता1बंध्याकरण पर बैक्टीरियल आबादी तक पहुंचने । विशेष महत्व के घाव (caseum कहा जाता है) है, जो आम तौर पर बेसिली की सबसे अधिक संख्या में शामिल है और खराब vascularization के अभाव के कारण दवाओं के लिए सुलभ हो सकता है की गल कोर में दवा पैठ का निर्धारण है ।
घाव के प्रवेश का आकलन करने के लिए पारंपरिक तरीके, जो विलायक निष्कर्षण और तरल क्रोमैटोग्राफी मास स्पेक्ट्रोमेट्री (नियंत्रण रेखा/एमएस) विश्लेषण के बाद उत्पाद के फेफड़े के घावों की homogenization शामिल है, अत्यधिक संवेदनशील है और की दवाओं के लिए चयनात्मक ब्याज. हालांकि, इन तरीकों गरीब स्थानिक जानकारी प्रदान करते हैं, मूल homogenized ऊतक के आकार तक ही सीमित है । मास स्पेक्ट्रोमेट्री-आधारित इमेजिंग दृष्टिकोण, जैसे मैट्रिक्स-असिस्टेड लेजर desorption ionization (मालदी)2,3, desorption electrospray ionization (देसी)4 या तरल-बढ़ाया सतह निष्कर्षण5, 6 उच्च स्थानिकी हल इमेजिंग क्षमताओं का प्रस्ताव है, लेकिन प्रत्यक्ष ठहराव अत्यंत चुनौतीपूर्ण या विषम आयन दमन प्रभाव के कारण असंभव हो सकता है और विभिन्न सेल से analyte के निष्कर्षण क्षमता अलग या ऊतक के प्रकार7। इसके अतिरिक्त, सबसे सीधे ऊतक एमएस इमेजिंग दृष्टिकोण स्वाभाविक रूप से कम संवेदनशील है नियंत्रण रेखा/अंतर्जात प्रजातियों के क्रोमेटोग्राफिक जुदाई की कमी के कारण ionization और ऊतक से दवा के निचले विलायक निष्कर्षण दक्षता के लिए प्रतिस्पर्धा ।
लेजर कैप्चर microdissection (LCM) नियंत्रण रेखा/एमएस विश्लेषण के साथ संयुक्त नियमित रूप से अलग करने के लिए लागू किया गया है और proteomic अध्ययन के लिए विशिष्ट ऊतक क्षेत्रों की विशेषता8,9 और हाल ही में दवा ठहराव के लिए खुराक में उपयोग पशु ऊतक10। यहां हम एक अनुकूलित LCM नियंत्रण रेखा/एमएस (LCM-lc/एमएस) विश्लेषण के साथ विशिष्ट ग्रेन्युलोमा डिब्बों के भीतर विरोधी टीबी दवाओं यों तो लागू प्रोटोकॉल वर्तमान । लेजर कैप्चर microdissection प्रक्रिया में, एक यूवी लेजर पर माइक्रोस्कोप उद्देश्य के माध्यम से केंद्रित है ऊतक अनुभाग, जो कटौती और एक उपयोगकर्ता द्वारा परिभाषित पथ का पालन करके वांछित ऊतक क्षेत्र को अलग । गुरुत्वाकर्षण के लिए सहायता LCM (इस अनुसंधान के लिए इस्तेमाल तकनीक), ऊतक अनुभाग एक पतली बहुलक झिल्ली स्लाइड पर मुहिम शुरू की है (पालतू या कलम) और ऊतक एक संग्रह ट्यूब स्लाइड के नीचे साइट टोपी में कब्जा कर लिया है । दवाओं के उत्पादीय ऊतक और मानक नियंत्रण रेखा/MS दृष्टिकोण का उपयोग कर quantified से निकाले जाते हैं । ऊतक की मात्रा को एकत्र किया जाना आवश्यक अंततः ऊतक में मौजूद दवा की उम्मीद एकाग्रता से निर्धारित होता है और नियंत्रण रेखा की संवेदनशीलता/ दवाओं के अधिकांश विश्लेषण के लिए चिकित्सकीय स्तर पर खुराक और एक नियमित ट्रिपल quadrupole मास स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग कर विश्लेषण, ३,०००,००० µm2 (3 मिमी2) ऊतक सतह क्षेत्र के पर्याप्त है ।
इस प्रोटोकॉल स्थानिक रूपरेखा और पूर्ण LCM द्वारा की पेशकश की ठहराव के शक्तिशाली संयोजन-नियंत्रण रेखा/MS, टीबी granulomas के सभी डिब्बों के भीतर निरपेक्ष दवा सांद्रता प्रदान करने का वर्णन । तकनीक भी कई अलग रोगग्रस्त ऊतकों में दवा सांद्रता निर्धारित करने के लिए लागू किया जा सकता है महत्वपूर्ण दवा खोज और विकास की जानकारी प्रदान ।
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Protocol
सभी पशु अध्ययन की देखभाल और NIAID (NIH), बेथेस्डा, एमडी के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति से अनुमोदन के साथ स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के प्रयोगशाला पशुओं के उपयोग के लिए गाइड के अनुसार किया गया ।
1. पशु प्रयोगों और ऊतक संग्रह
प्रोटोकॉल के इस खंड का वर्णन करता है पशु प्रक्रियाओं और नमूना संग्रह के तहत सुरक्षा स्तर 3 (BSL3) शर्तों । माइकोबैक्टीरियम क्षयरोग एयरोसोल संक्रमण प्रक्रिया और खरगोशों में औषधि प्रशासन प्रोटोकॉल के विस्तृत प्रोटोकॉल पहले11,12बताया गया है ।
- एक नाक केवल एयरोसोल प्रणाली का उपयोग कर, जैसा कि पहले11वर्णित ंयूजीलैंड सफेद खरगोश (4-5 महीने की उंर में पुरुष और महिला ) एम . तपेदिक HN878 के साथ संक्रमित ।
- प्रशासन चुने हुए दवाओं (उदाहरण में Ethambutol यहां प्रस्तुत) पसंदीदा मार्ग के माध्यम से और 2, 6, और 24 ज पर पशुओं euthanize सबसे पहले, Ketamine के इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन द्वारा खरगोश को anesthetize पर ३५ मिलीग्राम/किलोग्राम और Xylazine पर 5 मिलीग्राम/ दस मिनट के लिए रुको और पूंछ चुटकी और धीरे से आंख को छूने से उचित anesthetization की पुष्टि करें । कोई प्रतिक्रिया नहीं है, तो pentobarbital और फ़िनाइटोइन की नसों में प्रशासन द्वारा euthanize ( सामग्री की तालिकादेखें) पर 1 मिलीलीटर/4.5 kg में 2 मिलीलीटर बाँझ खारा.
नोट: ये timepoints Ethambutol के लिए pharmacokinetic प्रोफ़ाइल को कवर करने के लिए इष्टतम है और अंय अध्ययन दवाओं के लिए समायोजन/ - संदंश, कैंची, और/या स्केलपेल का प्रयोग, छाती गुहा से फेफड़ों को हटाने, कीट फेफड़े बायोप्सी बड़े granulomas आसपास के शामिल फेफड़ों के ऊतकों में एंबेडेड युक्त (के रूप में पहले से वर्णित है3) । गल granulomas रंग में निखार दिखाई देते हैं और आम तौर पर लाल/गुलाबी रंग के फेफड़ों से थोड़ा सा बहर । आसान cryosectioning की सुविधा के लिए, सुनिश्चित करें कि बायोप्सी 2 x १.५ x १.५ सेमी से बड़े नहीं हैं ।
- संदंश का प्रयोग, एक पूर्व पर बायोप्सी जगह-ट्रे के आधार के साथ सीधे संपर्क में वांछित काटने की सतह के साथ cryomold ट्रे लेबल । जमने के बाद यह एक समतल सतह उपलब्ध कराएगा जिसमें से cryosections कटौती की जाएगी ।
- तरल नाइट्रोजन वाष्प में बायोप्सी फ्रीज । तरल नाइट्रोजन के साथ 2 इंच की गहराई के लिए एक स्टायरोफोम कंटेनर भरें और एक धातु तार ट्यूब रैक जगह है । रैक तरल नाइट्रोजन एक सपाट सतह जिस पर ऊतक ट्रे रखा जाता है प्रदान की सतह के ऊपर फैला होना चाहिए । ढक्कन स्टायरोफोम कंटेनर पर वापस रखें और 10 मिनट के लिए पूरी तरह से फ्रीज ऊतकों छोड़ दें ।
- ऊतक ट्रे निकालें, जल्दी से एल्यूमीनियम फिल्म में लपेट और व्यक्तिगत रूप से सील प्लास्टिक बैग और सील लेबल में जगह है । -८० डिग्री सेल्सियस फ्रीजर के लिए भंडारण के लिए स्थानांतरण ।
नोट: चरण १.१-१.६ (सभी पशु काम और संक्रमित अंगों और ऊतकों की हैंडलिंग सहित) BSL3 स्थितियों में किया जाता है । गामा BSL3 के बाहर हैंडलिंग को सक्षम करने के लिए 3 Megarads पर फेफड़े बायोप्सी विकीर्ण । यदि अनुमोदित सुरक्षा प्रोटोकॉल के स्थान पर लेजर पर कब्जा microdissection BLS3 सुविधा के भीतर किया जा सकता है । हालांकि, इस प्रोटोकॉल के शेष एक बीएसएल में बहाव प्रसंस्करण-2 सुविधा का वर्णन है ।
2. टिशू सेक्शनिंग
- वांछित काटने के तापमान के लिए cryostat सेट करें । cryostat के लिए-८० ° c भंडारण से गामा विकिरणित फेफड़ों की बायोप्सी स्थानांतरण और ऊतक के तापमान equilibrate करने के लिए 30 मिनट के लिए छोड़ दें । नोट:-20 से-22 डिग्री सेल्सियस टीबी घावों बायोप्सी के लिए इष्टतम है ।
- चिमटी का प्रयोग, cryostat चक करने के लिए बायोप्सी फिक्स इष्टतम काटने तापमान चिपकने की एक छोटी राशि का उपयोग (अक्टूबर) चक करने के लिए ऊतक के आधार का पालन करने के लिए । ओरिएंट ऊतक इतना है कि सपाट सतह (कि cryomold के आधार के साथ संपर्क में था) काटने के लिए उजागर सतह है । सुनिश्चित करें कि OCT ऊतक सतह को दूषित नहीं करता है, क्योंकि यह बाद में बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के साथ हस्तक्षेप कर सकता है ।
- 25 µm मोटाई में तीन ऊतक वर्गों में कटौती और पीईटी झिल्ली स्लाइड पर माउंट । धीरे ऊतक अनुभाग और हटाने के लिए झिल्ली को छूने । यदि बहुत अधिक दबाव डाला जाता है, तो पतली झिल्ली फाड़ सकती है ।
- के रूप में इस पालतू झिल्ली बनने का आरोप लगाया और ऊतक वर्गों के गरीब आसंजन में परिणाम होगा पहले स्लाइड के अत्यधिक हैंडलिंग से बचें । झिल्ली स्लाइड झिल्ली को ऊतक के गल-बढ़ते और सफल आसंजन सक्षम करने के लिए कमरे के तापमान पर रखा जाता है कि यह सुनिश्चित करें ।
- cryostat से स्लाइड निकालें और 3 मिनट के लिए एयर-ड्राई की अनुमति दें । यदि LCM-LC/ms/ms तुरंत नहीं किया जाएगा, एक छोटा सा वाटरप्रूफ सील बैग में स्लाइड सील और विच्छेदन के लिए आवश्यक जब तक-८० ° c संग्रहण करने के लिए स्थानांतरण ।
- Hematoxylin और Eosin (एच एंड ई) धुंधला और संदर्भ के लिए एक मानक गिलास स्लाइड पर 10-12 µm और गल-माउंट पर एक आसंन अनुभाग में कटौती । अन्य वांछित histochemistry दाग (जैसे Ziehl-Niellsen visualizing माइकोबैक्टीरियम तपेदिक (एमटीबी)) के लिए इस समय अतिरिक्त अनुभागों में कटौती की जा सकती है ।
3. Microdissection
- -८० ° c भंडारण से स्लाइड युक्त सीलबंद बैग निकालें और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान तक पहुंचने की अनुमति दें ।
नोट: यदि ठंड स्लाइड तुरंत प्रयोगशाला वातावरण को उजागर किया है, ऊतक संघनित्र के साथ लेपित हो जाएगा, और दवा की स्थानिक अखंडता समझौता हो सकता है । - माइक्रोस्कोप और लेजर पर बारी (लेजर शुरू कर सकते हैं काटने से पहले गर्म 5-10 मिनट की आवश्यकता है). धारक में फ्लैट कैप ०.२० मिलीलीटर पीसीआर ट्यूबों लोड ।
- बैग से स्लाइड निकालें और एक flatbed स्कैनर का उपयोग कर पीईटी स्लाइड पर ऊतक अनुभाग के एक ऑप्टिकल छवि ले ।
- स्लाइड धारक (ऊतक की ओर नीचे का सामना करना पड़) में स्लाइड प्लेस और विशिष्ट ब्याज की ग्रेन्युलोमा क्षेत्रों के लिए अलग संग्रह ट्यूबों प्रदान माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर का उपयोग कर । आमतौर पर, इन ' होगा फेफड़े, ' ' सेलुलर ग्रेन्युलोमा, ' और ' caseum ' (गल केंद्र), लेकिन ग्रेन्युलोमा की विशिष्ट विकृति के आधार पर भिंन हो सकते है/
- 5x माइक्रोस्कोप उद्देश्य का उपयोग कर ऊतक पर ध्यान केंद्रित । इस आवर्धन सेलुलर और गल ग्रेन्युलोमा क्षेत्रों दोनों युक्त ऊतक का एक अच्छा सिंहावलोकन प्रदान करना चाहिए । सॉफ्टवेयर में ' caseum ' नामित ट्यूब यह ऊतक के तहत स्थिति में स्थानांतरित करने के लिए चयन करें ।
- इच्छित विच्छेदन पैरामीटर्स दर्ज करें । एक 25 µm मोटी फेफड़ों अनुभाग के लिए विशिष्ट सेटिंग्स लेजर पावर 30, स्पीड 15, और एपर्चर ३५ (मनमानी इकाइयों) हैं । हालांकि, इन इस्तेमाल किया खुर्दबीन और लेजर की उंर के कारण संभावित गिरावट शक्ति पर निर्भर करता है अलग होगा ।
- ' मुक्त-ड्रा ' उपकरण का चयन करें और, या तो एक माउस या touchscreen पेन का उपयोग कर, विच्छेदन के लिए वांछित क्षेत्र की रूपरेखा । इस क्षेत्र की सतह क्षेत्र सॉफ्टवेयर में प्रदर्शित किया जाएगा । आसान विच्छेदन की सुविधा के लिए ५००,००० µm2 (०.५ mm2) के तहत चयनित क्षेत्रों रखें । ३,०००,००० µm2 (3 मिमी2) जब तक विच्छेदन को दोहराने ट्यूब टोपी में कुल में एकत्र किया गया है ।
- इस अवसर पर, विच्छेदित क्षेत्र आसपास की झिल्ली तक अटका रह सकता है (उदाहरण के लिए स्थिर आकर्षण के कारण) और संग्रह टोपी में गिरावट नहीं है । सॉफ़्टवेयर के भीतर मैन्युअल रूप से चुनकर और निकालकर संचयी सतह क्षेत्र कुल से इन क्षेत्रों को निकालें.
- ' सेलुलर घाव ' के लिए टोपी का चयन करें और ३.७ चरण में उल्लिखित के रूप में एक ही प्रक्रिया का उपयोग कर ऊतक के ३,०००,००० µm2 इकट्ठा.
- के लिए टोपी का चयन करें ' unµmed फेफड़ों ' और इकट्ठा ३,०००,००० ऊतक के2 एक ही प्रक्रिया का उपयोग कर के रूप में ३.७ कदम में उल्लिखित । ध्यान रखें कि फेफड़े के ऊतकों में कई ब्रांकिओल्स और वायुकोशीय स्थान शामिल हैं । विच्छेदन के लिए परिभाषित ऊतक क्षेत्रों से इन बाहर करने के लिए सावधान ध्यान देना ।
- कैप धारक निकालें और ध्यान से अनक्लिप, सील और प्रत्येक ट्यूब लेबल । हवा में गड़बड़ी के आसपास से विच्छेदित ऊतकों की रक्षा (जैसे हवा का प्रवाह व्यवधान से एक खोलने के दरवाजे से) । विच्छेदित ऊतकों का तुरंत विश्लेषण करें, या प्रसंस्करण और LCMS विश्लेषण से पहले-८० डिग्री सेल्सियस और गल पर स्टोर ।
4. निष्कर्षण और LCMS विश्लेषण
- Ethambutol डी-10 आंतरिक मानक युक्त 1:1 acetonitrile/मेथनॉल के निष्कर्षण समाधान तैयार करें । जब एक आंतरिक मानक का चयन, analyte दवा के एक स्थिर लेबल फार्म का उपयोग करें (जैसे ड्यूटेरियम-लेबल EMB इस प्रदर्शन में इस्तेमाल किया) पर्याप्त द्रव्यमान analyte दवा और मानक (आमतौर पर 4 daltons की एक ंयूनतम) के बीच आइसोटोप पार बात से बचने के लिए शिफ्ट के साथ .
नोट: प्रत्येक संबंधित ऊतक प्रकार के homogenate में मानकों का निर्माण मुश्किल है क्योंकि वहां बहुत सीमित नियंत्रण ऊतक जिसके साथ homogenate मानकों को बनाने के लिए है । एक नुकीला homogenate नमूना से मानक बनाने के लिए एक विकल्प के रूप में, एक मानक खाली ऊतक और परीक्षण यौगिक एक साथ जोड़कर और निकालने के द्वारा बनाया जा सकता है । एक homogenate है कि अध्ययन नमूना ऊतक वर्गों के लक्ष्य की मात्रा से मेल खाता है में नियंत्रण ऊतक का एक मात्रा परीक्षण यौगिक है कि एक दिया एकाग्रता में मौजूद होगा की एक राशि के साथ सीधे संयुक्त है. - सतह क्षेत्र और ऊतक अनुभाग की मोटाई के आधार पर लक्षित ऊतक की मात्रा की गणना और मानक और QC नमूनों में जोड़ा जाएगा कि homogenate की मात्रा का उपयोग कर homogenate के लिए आवश्यक कमजोर पड़ने कारक का निर्धारण । गणना एक ३,०००,००० µm2 (3 मिमी2) के लिए एक 25 µm मोटाई और homogenate के 2 µ एल मात्रा के साथ लक्ष्य विदारक क्षेत्र के लिए नीचे सचित्र हैं ।
- 1 ग्राम/एमएल के एक ऊतक घनत्व संभालने, नियंत्रण ऊतक के ५० मिलीग्राम वजन और पंजाबियों बफर जोड़ने से homogenate शेयर तैयार (२६.६७ homogenate कमजोर पड़ने फैक्टर ४.२ चरण में गणना का उपयोग कर, मंदक १.२८३ मिलीलीटर है) । एक मनका homogenizer पर १७५० rpm पर 5 मिनट के लिए मनका धड़कन फेफड़ों के ऊतकों और पंजाबियों बफर द्वारा Homogenize ।
- पतला 1 मिलीग्राम/एमएल औषध स्टॉक्स 1:1 acetonitrile/पानी में एकाग्रता मानक वक्र spiking समाधान बनाने के लिए । स्पाइक मात्रा और लक्ष्य ऊतक की मात्रा के आधार पर spiking मानक सांद्रता निर्धारित करें । सचित्र उदाहरण के लिए एक १०० एनजी/एमएल एक 10 µ एल स्पाइक मात्रा का उपयोग कर मानक है ।
- से microdissected ऊतकों युक्त ट्यूबों निकालें-८० ° c भंडारण और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान तक पहुंचने के लिए अनुमति देते हैं ।
- microdissected ऊतक युक्त ट्यूबों के लिए 1:1 acetonitrile/पानी समाधान और पंजाब के 2 µ एल के 10 µ एल जोड़ें ।
- मानक वक्र और गुणवत्ता नियंत्रण ट्यूबों के लिए, नियंत्रण फेफड़ों homogenate के 2 µ एल के लिए spiking समाधान के 10 µ एल जोड़ें ।
- प्रत्येक ट्यूब के लिए निष्कर्षण समाधान के ५० µ एल जोड़ें ।
- भंवर 5 मिनट के लिए प्रत्येक ट्यूब, 5 मिनट के लिए sonicate और 5 मिनट के लिए ५००० RPM पर केंद्रापसारक के लिए फिल्म और प्रत्येक ट्यूब में ऊतक के एक गोली फार्म ।
- स्थानांतरण ५० एक ९६ के लिए supernatant के µ एल-अच्छी तरह से गहरी अच्छी तरह से थाली और एक अतिरिक्त ५० µ एल के साथ पतला एक अच्छी तरह से में पानी की ।
- Ethambutol और Ethambutol-d10 आंतरिक मानक के लिए ऑप्टिमाइज़ किए गए इंस्ट्रूमेंट पैरामीटर्स का उपयोग करके नियंत्रण रेखा/ms/एमएस विश्लेषण (जैसा कि पहले विस्तार में वर्णित है12) ।
- प्रत्येक नमूने के लिए विच्छेदित ऊतक की सटीक राशि के लिए सही करने के लिए एक कमजोर पड़ने कारक का उपयोग करें ।
5. विधि मान्यता
- 1 भाग फेफड़े, 2 भागों पंजाबियों, और 3-4 स्टील मोतियों के संयोजन से नियंत्रण फेफड़ों के ऊतकों में एक homogenate बनाएं । १७५० rpm पर 5 मिनट के लिए एक मनका homogenizer का उपयोग कर फेफड़ों के ऊतकों और पंजाबियों बफर मारो ।
- 1 मिनट के लिए १०,००० एनजी/एमएल (10 मिलीग्राम/एमएल) और भंवर की एक अंतिम एकाग्रता बनाने के लिए ९९० µ एल homogenate में 10 µ एल के homogenate को जोड़कर स्पाइक करें ।
- एक cryomold में homogenate डालने और तेजी से 5 मिनट के लिए सूखी बर्फ पर ठंड से एक जमे हुए homogenate ब्लॉक बनाएं ।
- २.१-२.५ चरणों में वर्णित के रूप में homogenate ब्लॉक से 25 µm मोटी अनुभागों को तैयार करें ।
- काटना लक्ष्य ऊतक क्षेत्र के रूप में ३.२-३.१० चरणों में निर्दिष्ट किया है ।
- microdissected ऊतक युक्त ट्यूबों के लिए 10 µ एल 1:1 acetonitrile/पानी और पंजाबियों बफर के 2 µ एल जोड़ें ।
- प्रत्येक ट्यूब के लिए निष्कर्षण समाधान के ५० µ एल जोड़ें । एक मानक वक्र बनाने के लिए और ऊतक homogenate ब्लॉक में दवा एकाग्रता निर्धारित करने के लिए ४.९-४.१२ चरणों का पालन करें ।
- नीचे दिए गए सूत्र का उपयोग करके निष्कर्षण कुशलता की गणना करें:
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Representative Results
LCM-नियंत्रण रेखा/MS दृष्टिकोण का ओवरव्यू चित्र 1में दिखाया गया है । गामा विकिरण द्वारा ऊतक बंध्याकरण करने के बाद, सभी बाद के चरणों (ऊतक अनुभाग के बाद से) BSL3 शर्तों के बाहर जगह ले । चित्रा 2 LCM द्वारा ऊतक अलगाव से पहले और बाद घाव बायोप्सी वर्गों से पता चलता है. टीबी घावों के गल और सेलुलर क्षेत्रों को आसानी से पहचाना और अकेले ऑप्टिकल छवियों के दृश्य निरीक्षण द्वारा पृथक किया जा सकता है (आवश्यकता के बिना histologically-सना हुआ आसन्न ऊतक वर्गों को देखें) । विच्छेदन प्रक्रिया आसपास के ऊतकों को ंयूनतम अशांति के साथ एक साफ कटौती पैदा करता है, और विच्छेदन ३,०००,००० µm2 (3 मिमी2) घावों से ब्याज की प्रत्येक क्षेत्र के कुल में लगभग 1 घंटे लगते हैं ।
निष्कर्षण दक्षता और LCM-LC/MS विधि की स्थिरता Ethambutol (EMB)-नुकीला फेफड़े homogenate (तालिका 1) का उपयोग करके मूल्यांकन किया गया था । दवा का पूरा निष्कर्षण मनाया गया था, और कोई दवा स्थिरता मुद्दों विच्छेदन और निष्कर्षण प्रक्रिया के माध्यम से पता लगाया गया. LCM-lc/ms निष्कर्षण और ठहराव प्रोटोकॉल आगे स्थापित नियंत्रण रेखा/ms ठहराव एक ही ऊतकों के लिए लागू की तुलना द्वारा मांय किया गया था । विविधता फेफड़े के टीबी के घावों और गरीब स्थानिक मानक ऊतक homogenization द्वारा की पेशकश की विशिष्टता के निहित के कारण, हम LCM-नियंत्रण रेखा/एमएस विधि दोनों द्वारा विश्लेषित फेफड़े में दवा सांद्रता की तुलना सीधे पुष्टि विश्लेषणात्मक तकनीक (अपने अपेक्षाकृत उच्च ऊतक एकरूपता के कारण) । 2 तालिका के द्वारा मूल्यांकन के रूप में तीन Ethambutol-खुराक खरगोश से लिया बायोप्सी से जुड़े फेफड़े में दवा सांद्रता से पता चलता है: 1) अनुमन्य 25 µm मोटी ऊतक वर्गों और मानक नियंत्रण रेखा से विश्लेषण/ms, और 2) LCM-नियंत्रण रेखा/ एक आसंन 25 µm मोटी ऊतक अनुभाग से लिया क्षेत्रों । डेटा से पता चलता है कि दो दृष्टिकोण लगातार ठहराव डेटा उत्पादन, दिनचर्या स्थानिक ठहराव के लिए उपयुक्तता का प्रदर्शन ।
फेफड़े के घावों के भीतर कई मौजूदा और उपंयास एंटी टीबी दवाओं के लिए हम LCM-LC/MS लागू किया है । चित्रा 3 ए एमटीबी-संक्रमित खरगोशों से उदाहरण के डेटा से पता चलता है Ethambutol के साथ स्थिर-राज्य खुराक । LCM-LC/MS caseum के भीतर हल दवा का पूरा ठहराव सक्षम, सेलुलर घावों, और शामिल फेफड़ों के ऊतकों क्षेत्रों । EMB को घाव में अच्छी तरह से घुसना और गल caseum के भीतर सांद्रता निष्फल तक पहुंचने के लिए मनाया गया । एक आसंन ऊतक अनुभाग से प्राप्त EMB वितरण की इसी मालदी-एमएस छवि चित्र बीमें दिखाया गया है । गुणात्मक मालदी-ms छवियां कम दवा सेलुलर रिम की तुलना में गल caseum में पाया सांद्रता के साथ LCM-नियंत्रण रेखा/एमएस डेटा के साथ अच्छी तरह से संबद्ध । LCM-नियंत्रण रेखा/एमएस डेटा ऊतक homogenates के लिए प्रत्यक्ष तुलना द्वारा सत्यापित किया गया था मानक नियंत्रण रेखा से विश्लेषण/
चित्र 1 : LCM-नियंत्रण रेखा/एमएस प्रक्रिया की योजनाबद्ध । खरगोश फेफड़े बायोप्सी आसपास के साथ साथ गल घाव युक्त फेफड़ों एकत्र और जमे हुए हैं । Cryosections पतली पालतू झिल्ली और संलग्न फेफड़ों, सेलुलर के क्षेत्रों पर कटौती कर रहे हैं, और मामले में घाव और ठहराव के लिए अलग-थलग कर रहे हैं/Zimmerman एट अल से अनुकूलित । 12 कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 2 : घाव (a, b) और (c, d) फेफड़े (सी, डी) के रूप में वे दिखाई देते हैं जब पहले माइक्रोस्कोप का उपयोग कर देखा (ए, सी) और बाद (बी, डी) microdissection. केस वाले घावों वाले क्षेत्र गहरे रंग के दिखाई देते हैं और ऑप्टिकल इमेज स्कैन (A, green बाह्यरेखा) में फटा हुआ है । सेलुलर घाव रंग में हल्का है और संरचना में और अधिक ठोस (एक, लाल रूपरेखा) । शामिल फेफड़ों को कम से कम 5 मिमी घाव सीमा से दूर नमूना लिया जाना चाहिए और लाल/गुलाबी रंग में प्रकट होता है (सी, सियान रूपरेखा). स्केल पट्टियां (काला, नीला, और जामुनी) = ४०० µm । ध्यान दें कि न केवल संलग्न फेफड़ों के ठोस क्षेत्रों वायुकोशीय रिक्त स्थान और ऊतक एकत्र की कुल सतह क्षेत्र में ब्रांकिओल्स सहित से बचने के लिए चुना जाना चाहिए (के रूप में डी में दिखाया गया है) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 3 : उदाहरण LCM-नियंत्रण रेखा/MS dataset से दो खरगोशों १०० मिलीग्राम/kg EMB के साथ 7 दिनों के लिए लिया गया घाव बायोप्सी से ली गई है । (क) सभी फेफड़ों और घावों के डिब्बों में दवा का अनुकूल प्रवेश देखा गया । LCM द्वारा quantified दवा सांद्रता-lc/ms (खोखले पट्टियां)/MS मानक नियंत्रण रेखा से homogenized विच्छेदित घावों से उन quantified के साथ मजबूत समझौते में थे/ms (ठोस सलाखों, मतलब ± मानक विचलन, n = 3-8) । extracellular नकल बेसिली (अति पिछड़े वर्ग९९) और ९९% intracellular बेसिली में मैक्रोफेज (iMBC९९) के ९९% को मारने के लिए आवश्यक न्यूनतम सांद्रता के संकेत हैं । (ख) शीर्ष पैनल: मालदी-MS छवि EMB का वितरण दिखा [m + H]+ आयन (m/z २०५.१९३) एक आसन्न ऊतक अनुभाग के भीतर. ध्यान दें कि मालदी-एमएस छवि वर्तमान दवा सांद्रता का पता लगाने की निचली सीमा से नीचे जा रहा है के कारण caseum में EMB के गरीब प्रवेश पता चलता है (लोद) तकनीक का । हालांकि, स्थानिक विशिष्टता और LCM के बेहतर लोद-LC/एमएस दिखाने दवा caseum सहित सभी घावों डिब्बों के भीतर सांद्रता निष्फल पहुंच रहा है । लोअर पैनल: Hematoxylin और Eosin सना हुआ ऊतक अनुभाग मालदी MSI के लिए इस्तेमाल किया अनुभाग के लिए सीधे सटे. टिशू में सेलुलर (सी) और गल granulomas (एनजी) मौजूद थे । caseum कोर सफेद में उल्लिखित है । Zimmerman एट अल से अनुकूलित । 12 कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
| विदारक क्षेत्र (µm2) | मापा EMB (एनजी/जी) (n = 3) | EMB रिकवरी (%) (n = 3) |
| ३,०००,००० | १०६३३ (± ४०४) | १०६ (± 4) |
| ५,०००,००० | १००५७ (± ११३२) | १०१ (± 11) |
| १०,०००,००० | १०५६३ (± ११२८) | १०५ (± 11) |
तालिका 1: फेफड़ों में EMB को बढ़ाता है के लिए नियंत्रण रेखा के निष्कर्षण दक्षता/ EMB की पूरी वसूली सभी मूल्यांकन ऊतक की मात्रा के लिए EMB नुकीला फेफड़े homogenate विच्छेदित ऊतकों में मनाया गया ।
| खरगोश आईडी | LC/MS EMB (एनजी/ | LCM-LC/MS EMB (एनजी/ | अंतर (%) |
| ८९९ | २९१० | ३३२० | 14 |
| ९०४ | २०१० | १८७० | -7 |
| ९११ | २१५० | २३७० | 9 |
तालिका 2: EMB ठहराव की तुलना में 3 खुराकीय खरगोशों से जुड़े फेफड़े बायोप्सी में नियंत्रण रेखा/ms और LCM-LC/ms । समकक्ष दवा सांद्रता दोनों तरीकों से पता चला और LCM-नियंत्रण रेखा/MS प्रक्रिया के दौरान क्षरण या निष्कर्षण के कारण संकेत का कोई नुकसान नहीं देखा गया ।
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Discussion
फेफड़े के टीबी के घावों के भीतर दवाओं की स्थानिकी हल ठहराव कि दवा जोखिम अलग घावों के डिब्बों के भीतर रहने वाले जीवाणु आबादी के लिए सांद्रता निष्फल तक पहुँच जाता है यह निर्धारित करने के लिए आवश्यक है । LCM-नियंत्रण रेखा/एमएस विधि यहां वर्णित सभी घावों डिब्बों के भीतर एंटी टीबी दवाओं के निरपेक्ष ठहराव बैक्टीरिया युक्त caseum सहित, कुल में केवल 1-3 ऊतक वर्गों का उपयोग कर सक्षम बनाता है । ऊतक में दवा ठहराव के लिए पारंपरिक ऊतक homogenization और नियंत्रण रेखा/एमएस दृष्टिकोण अक्सर विशिष्ट घावों डिब्बों को हल करने के लिए स्थानिक विशिष्टता की कमी है और यहां तक कि जब यह संभव है, वहां महत्वपूर्ण क्षमता को दूषित सेलुलर पार और मैंयुअल निष्कर्षण प्रक्रिया के दौरान घावों के क्षेत्र में गल जाना ।
LCM-LC/MS दृष्टिकोण मास-स्पेक्ट्रोमेट्री-आधारित इमेजिंग प्रौद्योगिकियों के लिए कई महत्वपूर्ण लाभ है । इनमें से प्राथमिक विधि की पूरी तरह से मात्रात्मक क्षमताओं और क्रोमेटोग्राफिक जुदाई के माध्यम से अंतर्जात प्रजातियों में दखल/दबा से दवा को हल करने के कारण नियंत्रण रेखा के अतिरिक्त संवेदनशीलता/ हालांकि, मालदी-MSI दवा वितरण के बारे में अधिक विस्तृत स्थानिक जानकारी प्रदान करता है । दोनों मालदी के रूप में-MSI और LCM-LC/ms/ms एक ही नमूना तैयारी के लिए जमे हुए ऊतक वर्गों उत्पन्न करने के लिए कदम की आवश्यकता होती है, दो तकनीकों में एक ही ऊतक बायोप्सी अत्यधिक विस्तृत इमेजिंग के साथ पूर्ण ठहराव प्रदान करने पर मिलकर प्रदर्शन किया जा सकता दवा का वितरण. उच्च विश्लेषणात्मक संवेदनशीलता के लिए आवश्यकता का एक उदाहरण आरेख 3में दिखाया गया है । EMB संकेत के केवल बहुत कम स्तर मालदी एमएस छवि के केंद्रीय गल ग्रेन्युलोमा क्षेत्र में पता लगाया गया ( चित्र बी) में दिखाया गया है, दवा के caseum प्रवेश का सुझाव गरीब है । हालांकि, LCM का पता लगाने की बेहतर सीमा के कारण-नियंत्रण रेखा/एमएस दवा स्पष्ट रूप से उस डिब्बे के भीतर सांद्रता बंध्याकरण और दवा मौजूद एकाग्रता तक पहुंचने के लिए प्रदर्शन किया गया था मुख्य रूप से मालदी (चित्रा 3) द्वारा undetectable था ।
ऊतक दाग प्रोटोकॉल आमतौर पर proteomic अनुप्रयोगों के लिए LCM से पहले उपयोग के लिए ऊतक क्षेत्रों और कोशिका के भीतर स्थित आबादी की आसान पहचान सक्षम हैं । ऐसे एच एंड ई के रूप में नियमित histochemical दाग दवा ठहराव के साथ संगत नहीं हैं, के रूप में कई विलायक धोने कदम शामिल ऊतक अनुभाग से दवा का स्थानीयकरण करना होगा । आसंन कट वर्गों एच एंड ई के साथ दाग और microdissection के लिए एक गाइड के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । हालांकि, यह आमतौर पर आवश्यक नहीं है, के रूप में घाव डिब्बों ऑप्टिकली मानक LCM brightfield माइक्रोस्कोप के तहत हल किया जा सकता है (चित्रा 2) ।
अनुभागीकरण और microdissection चरणों का अनुकूलन सफल घावों ठहराव के लिए महत्वपूर्ण है । विधि के विकास के दौरान, हम दो अलग झिल्ली सामग्री, पॉलीथीन terephthalate (पीईटी) और पॉलीथीन naphthalate (कलम), microdissection के लिए ऊतक वर्गों बढ़ते के लिए सब्सट्रेट के रूप में मूल्यांकन किया । पेन झिल्ली पीईटी झिल्ली की तुलना में वृद्धि हुई स्थैतिक चार्ज और सभी विच्छेदित ऊतक क्षेत्रों के लगभग 30% से ग्रस्त थे विच्छेदित ऊतक क्षेत्र और झिल्ली के बीच स्थिर आकर्षण के कारण खो गए । इस कारण से, पालतू झिल्ली भविष्य में काफी कम स्थिर आकर्षण के कारण विच्छेदन के लिए चुना गया (पालतू झिल्ली से विच्छेदित क्षेत्रों के केवल 5% LCM प्रक्रिया के दौरान खो गए थे) ।
ऊतक वर्गों के भीतर दवाओं की स्थिरता एक महत्वपूर्ण विचार है जब एक LCM-नियंत्रण रेखा/ सेक्शनिंग और विच्छेदन प्रक्रिया के दौरान, ऊतक वर्गों के लिए प्रयोगशाला तापमान और प्रकाश की अवधि के लिए एक घंटे से कम समय के लिए उजागर कर रहे हैं । अन्य मुद्दों पर विचार करने के लिए ऊतक वर्गों से दवा की निष्कर्षण दक्षता शामिल हैं, के रूप में वहाँ कोई homogenization कदम शामिल है (निष्कर्षण केवल भंवर मिश्रण और sonication द्वारा किया जाता है). हमारे अनुभव में, निष्कर्षण ऊतक अनुपात के लिए इस्तेमाल उच्च निष्कर्षण विलायक के कारण ऊतक homogenization की कमी से ग्रस्त नहीं है और ऊतक वर्गों की ओट में विच्छेदित । हमारी टिप्पणियों के साथ समझौते में है एक पहले से वर्णित ऑनलाइन LCM-नियंत्रण रेखा/एमएस विधि मस्तिष्क और जिगर, जहां ऊतक से दवा का पूरा निष्कर्षण 20 µm और ४० µm मोटी से मनाया गया था की microdissected ऊतक वर्गों में propranolol मात्रा 10अनुभाग । हम LCM प्रक्रिया के दौरान दवा निष्कर्षण और दवा स्थिरता की दक्षता की पुष्टि सीधे फेफड़े के ऊतकों की सांद्रता की तुलना द्वारा (एक ही खरगोश और फेफड़ों के पालि से) LCM द्वारा विश्लेषण-नियंत्रण रेखा/ homogenization और नियंत्रण रेखा/MS (एक उदाहरण तालिका 1में दिखाया गया है) । यह तुलना संकेत के किसी भी परिवर्तन दो के तरीके के बीच होने वाली है कि क्या निर्धारित करने के लिए हमें अनुमति देता है.
विच्छेदित ऊतक क्षेत्रों का घनत्व भी एक महत्वपूर्ण विचार है जब ऊतक सतह क्षेत्र या मात्रा पर आधारित दवा के स्तर को बढ़ाता है । यह फेफड़ों और घावों बायोप्सी के लिए विशेष चिंता का विषय है, जिसमें शामिल फेफड़ों के ऊतकों क्षेत्रों सेलुलर और caseum की तुलना में एक समग्र कम घनत्व है (एक ही रिश्तेदार सतह क्षेत्र को कवर कम ऊतक) एकाधिक खुले ब्रांकिओल्स की उपस्थिति के कारण और वायुकोशीय रिक्त स्थान । घनत्व में इस अंतर के प्रभाव को ध्यान से खुले स्थान के चारों ओर ड्राइंग द्वारा उंहें एकत्र ऊतक के संचई सतह क्षेत्र के भीतर (के रूप में चित्रा 2में दिखाया गया है) से बचने के लिए कम कर सकते हैं ।
एक अतिरिक्त सीमा है कि प्रस्तुत LCM-नियंत्रण रेखा/एमएस विधि केवल quantifies कुल दवा एकाग्रता अलग ऊतक के भीतर (सभी ऊतक homogenization, विलायक निष्कर्षण, और नियंत्रण रेखा/ms ठहराव दृष्टिकोण के साथ आम में) और हल नहीं करता है असीम भागों से प्रोटीन से बंधे दवा सांद्रता । Microdialysis ऊतक के भीतर असीम दवा को बढ़ाता है और मुक्त दवा बैक्टीरिया की extracellular आबादी तक पहुंचने सांद्रता के सटीक ठहराव सक्षम बनाता है के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण है13। हालांकि, तकनीक सबसे अच्छा एक पूरक दृष्टिकोण के रूप में लागू किया जाएगा, क्योंकि यह LCM के स्थानिक विशिष्टता का अभाव है-नियंत्रण रेखा/MS और केवल quantifies घुलनशील दवा के स्तर के भीतर ऊतक extracellular द्रव, नहीं intracellular सामग्री.
हम पहली बार के लिए संयुक्त है, LCM और नियंत्रण रेखा के लिए विशेष रूप से तपेदिक संक्रमण के स्थल पर एंटीबायोटिक दवाओं को बढ़ाता है । यह पद्धति काफी शक्तिशाली है क्योंकि इसे किसी भी छोटे अणु दवा के लिए लागू किया जा सकता है कोई रोग राज्य में इस्तेमाल किया । वास्तव में, हम हाल ही में पेट कैंडिडिआसिस के एक माउस मॉडल में एक रोधी दवा उंमीदवार quantified14। अंतर विषम ट्यूमर डिब्बों में विभाजन की दवा (गल कोर सहित) कैंसर के उपचार में एक प्राथमिक चिंता का विषय है, और अनुसंधान के कैंसर की दवा खोज में एक महत्वपूर्ण क्षेत्र15। LCM-LC/MS आदर्श इन सवालों के दृष्टिकोण के लिए अनुकूल है । इसके अलावा, LCM-नियंत्रण रेखा/MS को चयापचय, lipidomic और proteomic रोग रोगजनन के दौरान ऊतक क्षेत्रों और कोशिका आबादी में होने वाले परिवर्तनों को बढ़ाता है के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
हम पॉल ओ, Marizel मीना और इसाबेला Freedman पशु प्रयोगों के लिए धंयवाद, Jacquie गोंजालेज और डेनिएल वेनर NIH से खरगोश के ऊतकों के गामा विकिरण के साथ मदद के लिए लेजर पर कब्जा NIAID और पांडुलिपि के लिए microdissection के लिए पहले विचार और सलाह । इस काम को बिल ऐंड मेलिंडा गेट्स फाउंडेशन (OPP1174780) और NIH साझा इंस्ट्रूमेंटेशन ग्रांट 1S10OD018072 से फंडिंग का समर्थन मिला । हम Leica LMD ६५०० माइक्रोस्कोप के लिए पहुंच प्रदान करने और विशेषज्ञता और सलाह साझा करने के लिए eliseo द्वारा ए Eugenin धंयवाद । खरीद, और के चल रहे समर्थन, LMD ६५०० मानसिक स्वास्थ्य अनुदान, MH096625, राष्ट्रीय मस्तिष्क संबंधी विकार और स्ट्रोक, NS105584, PHRI वित्त पोषण संस्थान (ई. ए. ई.) और जीएसके योगदान के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा वित्त पोषित किया गया (ई. ए. ई.) ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| New Zealand White rabbits | Covance | N/A | |
| HN878 Mycobacterium tuberculosis | BEI Resources | NR-13647 | |
| Ketathesia (Ketamine) 100 mg/mL C3N | Henry Schein Animal Health | 56344 | |
| Anased (Xylazine) 100 mg/mL | Henry Schein Animal Health | 33198 | |
| Euthasol (pentobarbital sodium and phenytoin sodium) Solution | Virbac | 710101 | |
| Acetonitrile (LC-MS grade) | Fisher | A955-212 | |
| Methanol (LC-MS grade) | Fisher | A456-212 | |
| Formic Acid (LC-MS grade) | Fisher | A117-50 | |
| Water (LC-MS grade) | Fisher | W6212 | |
| 0.2 mL flat-cap PCR tubes | Corning | 07-200-392 | |
| Steel frames, PET-membrane | Leica | 11505151 | |
| Premium Frosted Microscope Slides | Fisher | 12-544-2 | |
| 96 Deep well plate 2.0ML PP RB | Fisher | NC0363259 | |
| Zorbax SB-C8 column (4.6 by 50 mm; particle size, 3.5 μm) | Agilent | 820631-001D | |
| "Zipper” Seal Sample Bags | Fisher | 01-816-1B | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| CM1850 cryostat | Leica | Discontinued | Leica CM1860 is the current model |
| Laser Microdissection System 6500 | Leica | Discontinued | Leica LMD 6 is the current model |
| Agilent 1260 Infinity II HPLC | Agilent | ||
| API 4000 QTRAP Mass Spectrometer | Sciex |
References
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