Summary
Her beskriver vi en protokoll som laser fange microdissection kombinert med LC/MS analyse romlig-kvantifisere narkotika distribusjoner i lunge tuberkulose granulomer. Tilnærmingen har bred anvendelse å kvantifisere narkotika konsentrasjoner i vev på romlige detaljer.
Abstract
Tuberkulose er fortsatt en ledende årsak til sykelighet og dødelighet over hele verden. Forbedringer til eksisterende narkotika regimer og utviklingen av romanen therapeutics er presserende nødvendig. Dosed TB narkotika nå og sterilisere bakterier i dårlig Stangeriaceae nekrose regioner (caseum) av lunge granulomer er avgjørende for vellykket terapeutisk intervensjon. Effektiv terapeutisk regimer må derfor inneholde stoffer med gunstige caseum penetrasjon egenskaper. Gjeldende LC/MS metoder for kvantifisering narkotika nivåer i biologisk vev har begrenset romlig oppløsning evner, gjør det vanskelig å nøyaktig fastslå absolutt medikamentfri konsentrasjoner i liten vev avdelinger som finnes i nekrotisk granulomer. Her presenterer vi en protokoll forbinder laser fange microdissection (LCM) pathologically forskjellige vev regioner med LC/MS kvantifisering. Denne teknikken gir absolutt kvantifisering av narkotika granulom caseum, rundt mobilnettet lesjon og uninvolved lungevev, og derfor bestemmer nøyaktig om bakteriedrepende konsentrasjoner de oppnår. I tillegg tuberkulose forskning har teknikken mange bruksmuligheter for romlig løst kvantifisering av narkotika i sykt vev.
Introduction
Romlig løse og kvantifisere narkotika nivåer er en avgjørende forutsetning for å avgjøre om Anti-tuberkulose narkotika nå bakteriell subpopulasjoner i lunge lesjoner på sterilisering konsentrasjoner1. Spesielt viktig er å avgjøre narkotika penetrasjon i nekrotisk kjernen av lesjonen (kalt caseum), som vanligvis inneholder det høyeste antallet bakterier og kan være dårlig tilgjengelig til narkotika av endometrial blodkar.
Tradisjonelle metoder for å vurdere lesjon penetrasjon, som involverer homogenisering forbrukeravgift lunge lesjoner etterfulgt av løsemiddel utvinning og flytende kromatografi massespektrometri (LC/MS) analyse, er svært følsom og selektiv for narkotika av interesse. Disse metodene tilbyr imidlertid dårlig romlig informasjon, begrenset til størrelsen på den opprinnelige homogenisert vev. Masse massespektrometri tenkelig tilnærminger, som matrix-assistert laser desorpsjon ionization (MALDI)2,3, desorption electrospray ionization (tegning)4 eller væske forbedret overflaten utvinning5, 6 tilbyr svært romlig løst tenkelig evner, men direkte kvantifisering kan være svært utfordrende eller umulig heterogene ion undertrykkelse effekter og ulike utvinning effektiviteten av analytt fra ulike cellen eller vev typer7. I tillegg er mest direkte vev MS tenkelig tilnærminger iboende mindre sensitive enn LC/MS på grunn av manglende brukt kromatografiske separasjon av endogene konkurrerer om ionisering og lavere løsemiddel utvinning effektiviteten i stoffet fra vev.
Laser fange microdissection (LCM) kombinert med LC/MS analyse er rutinemessig brukes til å isolere og karakterisere ulike vev regioner for proteomic studier8,9 og nylig benyttes for narkotika kvantifisering i dosert dyr tissue10. Her presenterer vi en optimalisert protokoll bruke LCM kombinert med LC/MS (LCM-LC/MS) analyse for å kvantifisere anti-TB narkotika distinkte granulom rom. Laser fange microdissection prosessen, er en UV laser fokusert gjennom mikroskop målet på delen vev som kutt og isolerer ønsket vevet området følger en sti defineres av brukeren. For gravitasjon-assistert LCM (teknikken brukes for denne forskningen), delen vev er montert på en tynn polymer membran lysbildet (PET eller pennen) og vevet er fanget i en samling rør cap plassert under lysbildet. Narkotika er utdraget fra forbrukeravgift vevet og kvantifisert bruke standard LC/MS tilnærminger. Mengden vev må samles er til sist bestemt fra forventet konsentrasjonen av stoffet i vevet og følsomheten til metoden LC/MS. For de fleste analyser av narkotika dosert på terapeutisk nivåer og analysert ved hjelp av en rutinemessig trippel quadrupole masse spectrometer, 3 millioner µm2 (3 mm2) av vev er areal tilstrekkelig.
Denne protokollen beskriver den kraftige kombinasjonen av romlige profilering og full kvantifisering tilbys av LCM-LC/MS, gir absolutt medikamentfri konsentrasjoner i alle deler av TB granulomer. Teknikken kan også brukes til å avgjøre narkotika konsentrasjonene i mange forskjellige sykt vev viktig stoff og utvikling informasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyrestudier ble utført i samsvar med veiledningen for omsorg og bruk av forsøksdyr av National Institutes of Health med godkjennelse fra den institusjonelle Animal Care og bruk komiteen av NIAID (NIH), Bethesda, Maryland
1. dyreforsøk og vev samling
Denne delen av protokollen beskriver dyr prosedyrer og prøvetaking vilkår biosikkerhet nivå 3 (BSL3). Detaljert protokoller av Mycobacterium tuberculosis aerosol infeksjon fremgangsmåten og Bedøve Administrasjon protokoller i kanin har vært beskrevet tidligere11,12.
- Infisere New Zealand hvit kanin (mannlige og kvinnelige 4-5 måneder gammel) med M. tuberkulose HN878 med en nese-bare aerosol system, som tidligere beskrevet11.
- Administrere valgte narkotika (Ethambutol i eksemplet presenteres her) via foretrukket rute og avlive dyrene på 2, 6 og 24 timer etter administrasjon. Først bedøve kaninen ved intramuskulær injeksjon av ketamin 35 mg/kg og Xylazine 5 mg/kg. Vente i ti minutter og bekrefter riktig anesthetization ved pinching halen og forsiktig berører øyet. Hvis det er ingen reaksjon, euthanize av intravenøs administrasjonen av pentobarbital og phenytoin (se Tabell for materiale) på 1 mL/4,5 kg i 2 mL sterilt saltvann.
Merk: Disse timepoints er optimale dekke farmakokinetiske profilen for Ethambutol og krever justering/optimalisere for andre studier narkotika. - Bruke pinsett, saks eller skalpell, fjerne lungene fra brystet hulrom, resect lunge biopsier inneholder store nekrotisk granulomer innebygd i omkringliggende uninvolved lungevev (som beskrevet tidligere3). Nekrotisk granulomer vises beige i farge og vanligvis stikker litt fra omkringliggende rød/rosa-farget lungene. For å lette lett og kryosnitt, kan du sikre at biopsier er større enn 2 x 1,5 x 1,5 cm.
- Ved hjelp av pinsett, plass biopsy på forhåndsinnstilte merket cryomold skuff med ønsket kutte overflaten i direkte kontakt med bunnen av skuffen. Etter frysing, får et flatt underlag som cryosections vil bli kuttet.
- Fryse biopsy i flytende nitrogen damp. Fylle en styrofoam beholder til en dybde på 2 inches med flytende nitrogen og plassere en metalltråd tube rack. Stativet bør stikker over vannflaten flytende nitrogen gir et flatt underlag som vev skuffene er plassert. Sett lokket på styrofoam beholderen og la vev i 10 minutter å fullt fryse.
- Fjern vev magasinene, raskt bryte i aluminium film og plasser i individuelt merket gjenlukkbare plastposer og segl. Overføre-80 ° C fryser for lagring.
Merk: Trinn 1.1-1.6 utføres BSL3 betingelser (inkludert alle dyr og håndtering av infiserte organer og vev). Gamma irradiate lunge biopsier på 3 Megarads å aktivere håndtering utenfor BSL3 forvaring. Laser fange microdissection på unsterilized vev kan utføres i BLS3 anlegget hvis godkjent sikkerhet protokoller er på plass. Resten av denne protokollen beskriver imidlertid nedstrøms behandling i BSL-2 anlegg.
2. vev snitting
- Angi kryostaten til ønsket kutte temperatur. Overføre gamma irradiated lunge biopsi fra-80 ° C lagring til kryostaten og la stå i 30 minutter til equilibrate Vevstemperaturen. Merk: 20 til-22 ° C er optimal for TB lesjon biopsier.
- Ved hjelp av pinsett, fikse biopsy å kryostaten chuck bruker en liten mengde optimal kutte temperatur lim (OCT) for å følge bunnen av vevet til chuck. Plasser vev slik at den flate delen (som var i kontakt med undersiden av cryomold) er de eksponerte på overflaten for å skjære. Sikre Tilpasningsverktøy for Office ikke gjør forurense vevet overflaten, som dette kan forstyrre påfølgende massespektrometri analysen.
- Kutte tre vev deler på 25 µm tykkelse og montere på PET membran lysbilder. Forsiktig touch membranen til delen vev og fjerne. Hvis for mye press, kan den tynne membranen rive.
- Unngå overdreven håndtering av lysbildene før montering som dette vil resultere i PET membranen blir belastet og dårlig vedheft av vev. Sikre at membran lysbildet holdes ved romtemperatur å aktivere Tin-montering og vellykket vedheft av vev til membranen.
- Fjern lysbildet fra kryostaten og la air-dry i 3 minutter. Hvis LCM-LC/MS/MS utføres umiddelbart, sel lysbildet i en liten lufttett sealable pose og overføring til-80 ° C lagring til nødvendig for disseksjon.
- Skjær en tilstøtende delen på 10-12 µm og Tin-montere på en standard objektglass for Hematoxylin og Eosin (H & E) flekk og referanse. Flere seksjoner kan kuttes på dette tidspunktet for andre ønskede histochemistry flekker (for eksempel Ziehl-Niellsen for å visualisere Mycobacterium tuberculosis (MTB)).
3. Microdissection
- Fjerne forseglet pose som inneholder lysbildet fra-80 ° C lagring og la nå romtemperatur i 5 minutter.
Merk: Hvis kaldt lysbildet avsløres umiddelbart til laboratoriet atmosfæren, vev vil bli belagt med kondens og romlig integriteten til stoffet kan være kompromittert. - Slå på mikroskopet og laser (laser krever 5-10 minutter varme opp før kutte kan starte). Last flat-cap 0,20 mL PCR rør inn i holderen.
- Lysbildet fra posen og ta en optisk image i delen vev på PET lysbildet med en planskanner.
- Plasser lysbildet inn i lysbildeholderen (vev siden vender ned) og tilordne separat innsamling rør til bestemte granulom regioner av interesse ved hjelp av mikroskop programvare. Vanligvis disse vil være 'uninvolved lunge,"'mobilnettet granulom,' og 'caseum' (nekrotisk center), men kan variere avhengig av bestemte patologi granulom/biopsi.
- Fokus på vev med 5 X mikroskop mål. Denne forstørrelsen bør gi en god oversikt over vev som inneholder både mobilnettet og nekrose granulom områder. Velg røret utpekt 'caseum' å flytte det på plass under vevet i programvaren.
- Angi ønsket disseksjon parameterne. Vanlige innstillinger for en 25 µm tykk lunge inndeling er laser makt 30, 15, og blenderåpning 35 (vilkårlig enheter). Men varierer dette avhengig av mikroskopet brukes og potensial avtagende kraft på grunn av alderen av laser.
- Velg verktøyet "gratis-uavgjort", og bruke en mus eller berøringsskjerm, skissere ønsket område for disseksjon. Arealet av området vises i programvaren. Holde utvalgte regioner under 500.000 µm2 (0,5 mm2) å lette lettere disseksjon. Gjenta dissection til 3 millioner µm2 (3 mm2) har vært samlet totalt i rør cap.
- Ganger kan dissekert regionen forbli fast til omkringliggende membranen (for eksempel på grunn av statisk attraksjon) og ikke faller inn i samling cap. Fjern disse regionene fra kumulative arealet totale ved å merke og fjerne manuelt i programvaren.
- Velger korken for 'mobilnettet lesjon' og samle 3 millioner µm2 av vev med samme fremgangsmåte som i trinn 3.7.
- Velger korken for 'uninvolved lunge' og samle 3 millioner µm2 av vev med samme fremgangsmåte som i trinn 3.7. Merk at uninvolved lungevev inneholder mange bronchioles og alveolar områder. Ekstra oppmerksom på utelukke disse fra regionene definerte vev for disseksjon.
- Fjern cap holderen og nøye unclip, sel og merk hver rør. Beskytte dissekert vev fra omkringliggende luften forstyrrelser (for eksempel fra air flow avbrudd fra en åpning døren). Analysere dissekert vev umiddelbart, eller lagre-80 ° c og tine før behandling og LCMS analyse.
4. utvinning og LCMS analyse
- Forberede utvinning løsning av 1:1 acetonitrile/metanol inneholder Ethambutol d-10 interne standard. Når du velger en intern standard, bruk en stabil merket form av analytt stoffet (som deuterium-merket EMB brukes i denne demonstrasjonen) med tilstrekkelig masse Skift å unngå isotop cross snakke mellom analytt narkotika og standard (vanligvis minst 4 daltons) .
NOTE å opprette standarder i homogenate av hver respektive vev er vanskelig fordi det er svært begrenset kontroll vev som å opprette homogenate standarder. Som et alternativ til å lage standarder fra et piggete homogenate utvalg, kan en standard opprettes ved å legge til tomme vev og test sammensatte sammen og utpakking. En mengde kontroll vev i en homogenate som samsvarer med målet kvantum av studien eksempel vev kombineres direkte med en mengde test sammensatte som vil være til stede på en gitt konsentrasjon. - Beregne målrettet vev volumet basert på areal og tykkelsen på delen vev og bestemme den nødvendige fortynningsfaktoren for homogenate ved hjelp av antall homogenate som skal legges til standard og QC prøver. Beregninger er illustrert nedenfor for et 3 millioner µm2 (3 mm2) dissekert målområde med 25 µm tykkelse og 2 µL volum av homogenate.
- Forutsatt en vev tetthet av 1 g/mL, forberede homogenate aksjen ved veiing 50 mg kontroll vev og legge til PBS buffer å fortynne (bruker fortynningsfaktoren for 26.67 homogenate beregnet i trinn 4.2 fortynningsmiddel er 1.283 mL). Homogenize av perle slo lungevev og PBS buffer i 5 minutter ved 1750 o på en perle homogenizer.
- Fortynne 1 mg/mL narkotika aksjer konsentrasjon i 1:1 acetonitrile/vann for å lage standardkurve skyter løsninger. Bestemme skyter standard konsentrasjoner basert på topp volumet og vev målvolumet. Illustrert eksemplet er for en 100 ng/mL standard med et 10 µL spike volum.
- Ta ut rør som inneholder microdissected vev fra-80 ° C lagring og la nå romtemperatur i 5 minutter.
- Legge til 10 µL av 1:1 acetonitrile/vann og 2 µL PBS bufferen til rør som inneholder microdissected vev.
- Standardkurve og kvalitetskontroll rør, legge 10 µL av skyter løsning 2 µL av kontroll lunge homogenate.
- Legge til 50 µL av utvinning løsning i hver retning.
- Vortex hver rør i 5 minutter, sonicate i 5 minutter og sentrifuge 5000 RPM i 5 minutter å danne pellets av film og vev i hver retning.
- Overføre 50 µL av nedbryting til en 96-brønns dyptgående brønn plate og fortynn med en ekstra 50 µL deionisert vann i hver brønn.
- Utføre Langbane-/ MS-/ MS analyse med optimalisert instrument parameterne for Ethambutol og Ethambutol-d10 interne standard (som tidligere beskrevet i detalj12).
- Bruk en fortynningsfaktoren for å korrigere den nøyaktige mengden vev dissekert for hvert utvalg.
5. metoden validering
- Opprette en homogenate i kontrollen lungevev ved å kombinere 1 del lunge, 2 deler PBS og 3-4 stål perler. Slå lungevev og PBS buffer i 5 minutter ved 1750 o bruker en perle homogenizer.
- Spike i homogenate ved å legge 10 µL av 1 mg/mL Ethambutol DMSO lager i 990 µL homogenate opprette en siste konsentrasjon av 10.000 ng/mL (10 mg/mL) og vortex i 1 minutt.
- Opprette en frossen homogenate blokk av pouring homogenate i en cryomold og raskt fryse på tørris i 5 minutter.
- Forberede 25 µm tykk deler av den homogenate som beskrevet i trinnene 2.1-2.5.
- Dissekere vev målområdet som angitt i trinn 3.2-3.10.
- Legge til 10 µL 1:1 acetonitrile/vann og 2 µL PBS bufferen til rør som inneholder microdissected vev.
- Legge til 50 µL av utvinning løsning i hver retning. Følg trinnene 4.9-4,12 å opprette en standard kurve og bestemme narkotika konsentrasjonen i vev homogenate blokk.
- Beregne utvinning effektivitet ved hjelp av formelen nedenfor:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En oversikt over LCM-LC/MS tilnærming er vist i figur 1. Etter steriliseringen vev av gamma-bestråling, skje alle etterfølgende trinnene (fra vev snitting og utover) utenfor BSL3 forhold. Figur 2 viser lesjonen biopsi deler før og etter vev isolasjon av LCM. Necrotic og cellulær områder av TB lesjoner kan lett identifiseres og isolert av visuell inspeksjon av optisk bildene alene (uten behovet å se histologisk-farget tilstøtende vev). Disseksjon prosessen gir et rent kutt med minimale forstyrrelser til omkringliggende vev og dissekere 3 millioner µm2 (3 mm2) på hvert område av interesse fra lesjoner tar ca 1 time totalt.
Utvinning ytelse og stabilitet av metoden LCM-LC/MS ble vurdert bruker Ethambutol EMB-piggete lunge homogenate (tabell 1). Komplett utvinning av stoffet ble observert, og ingen narkotika stabilitetsproblemer ble oppdaget gjennom disseksjon og utvinning prosessen. LCM-LC/MS utvinning og kvantifisering protokollen ble ytterligere validert ved å sammenligne etablerte LC/MS kvantifisering metoder brukes på samme vev. På grunn av den iboende heterogenitet nekrotisk lunge TB lesjoner og dårlig romlige spesifisitet som standard vev homogenisering, bekreftet vi metoden LCM-LC/MS av direkte sammenligne narkotika konsentrasjoner i uninvolved lunge analysert av begge analytiske teknikker (på grunn av sin relativt høy vev homogenitet). Tabell 2 viser narkotika konsentrasjonen i uninvolved lunge fra biopsier tatt fra tre Ethambutol-dosert kaniner som vurdert av: 1) homogenisere 25 µm tykk vev deler og analysere standard LC/MS og 2) LCM-LC/MS analyse av uninvolved lunge områder tatt fra en tilstøtende 25 µm tykk vev delen. Dataene viser at to tilnærminger produsere konsekvente kvantifisering data, demonstrere egnetheten for rutinemessig romlige kvantifisering.
Vi har brukt LCM-LC/MS kunne romlig-kvantifisere mange eksisterende og nye anti-TB narkotika i lunge lesjoner. Figur 3A viser eksempeldataene fra MTB-infiserte kaniner dosed stabil med Ethambutol. LCM-LC/MS aktivert full kvantifisering av stoffet løst i caseum og mobilnettet lesjon uninvolved lunge vev områder. EMB ble observert å trenge inn i lesjonen og nå sterilisering konsentrasjoner i nekrotisk caseum. Tilsvarende MALDI-MS bildet av EMB distribusjon fra en nærliggende vev delen vises i figur 3B. Kvalitativ MALDI-MS bilder korrelerer med kvantitative LCM-LC/MS data med lavere narkotika konsentrasjoner i nekrotisk caseum i forhold til mobilnettet felgen. LCM-LC/MS data ble validert i direkte forhold til vev homogenates analysert av standard LC/MS.
Figur 1 : Skjematisk av LCM-LC/MS. Kanin lunge biopsier inneholder nekrose leksjonen sammen med rundt uninvolved lunge er samlet og frosset. Cryosections skjæres til tynne PET membraner og områder av uninvolved lunge, mobilnettet, og caseous lesjon er dissekert og isolert for kvantifisering av LC/MS. tilpasset fra Zimmerman et al. 12 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Lesjon (A, B) og uninvolved lungekreft (C, D) som de vises av mikroskopet før (A, C) og etter (B, D) microdissection. Caseous lesjon vises mørkere og "sprakk" i optisk image scan (en grønn omriss). Mobilnettet lesjon er lysere i fargen og mer solid i struktur (A, rød kontur). Uninvolved lunge skal samples minst 5 mm fra den lesjon grensen og vises røde/rosa farge (C, cyan disposisjon). Skalere barer (svart, blått og lilla) = 400 µm. Merk at bare solid områdene av uninvolved lunge bør velges for å unngå inkludert alveolar områder og bronchioles i det samlede arealet av vev innhentes (som vist i i D). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Eksempel LCM-LC/MS datasett fra lesjonen biopsier tatt fra to kaniner dosert med 100 mg/kg EMB i 7 dager. (A) gunstig gjennomtrengning av stoffet i alle lunge og lesjon rom ble observert. Stoffet konsentrasjoner kvantifisert ved LCM-LC/MS (hul barer) /MS var i sterk avtale med de kvantifisert fra homogenisert dissekert lesjoner av standard LC/MS (solid barer, gjennomsnittlig ± standard avvik, n = 3-8). Minimum konsentrasjonen kreves for å drepe 99% av ekstracellulære etterligner bakterier (MBC99) og 99% av intracellulære bakterier i makrofager (iMBC99) angis. (B) toppanelet: MALDI-MS bildet viser arbeidsfordelingen EMB [M + H]+ ion (m/z 205.193) i en nærliggende vev. Merk at MALDI-MS bildet antyder dårlig gjennomtrengning av EMB i caseum på grunn av de nåværende narkotika konsentrasjonene blir under den nedre grensen for påvisning (LOD) av teknikken. Men viser den romlige spesifisitet og overlegen LOD av LCM-LC/MS stoffet er nå sterilisering konsentrasjoner i alle lesjon rom inkludert i caseum. Nedre panel: Hematoxylin & Eosin farget vev delen direkte tilknytning til delen brukes for MALDI MSI. Cellular (C) og nekrose granulomer (NG) var til stede i vevet. Caseum kjernen er skissert i hvitt. Tilpasset fra Zimmerman et al. 12 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Dissekert området (µm2) | Målt EMB conc. (ng/g) (n = 3) | EMB utvinning (%) (n = 3) |
| 3 millioner | 10633 (±404) | 106 (±4) |
| 5 millioner | 10057 (±1132) | 101 (±11) |
| 10 millioner | 10563 (±1128) | 105 (±11) |
Tabell 1: Utvinning effektiviteten av LC-LC/MS metoden for kvantifisering EMB i lunge. Fullstendig gjenoppretting av EMB ble observert i EMB piggete lunge homogenate dissekert vev for alle evaluerte vev volumer.
| Kanin ID | LC/MS EMB (ng/g) | LCM-LC/MS EMB (ng/g) | Forskjellen (%) |
| 899 | 2910 | 3320 | 14 |
| 904 | 2010 | 1870 | -7 |
| 911 | 2150 | 2370 | 9 |
Tabell 2: Sammenligning av EMB kvantifisering i uninvolved lunge biopsier fra 3 dosed kaniner LC/MS og LCM-LC/MS. Tilsvarende narkotika konsentrasjoner ble oppdaget av både metoder og uten tap av tapsfrie degradering eller utvinning under LCM-LC/MS prosessen ble observert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Romlig løst kvantifisering av narkotika i lunge TB lesjoner er nødvendig for å avgjøre om narkotika eksponering når sterilisering konsentrasjoner til bakteriell befolkninger bosatt innenfor de ulike lesjon avdelinger. LCM-LC/MS metoden beskrevet her kan absolutt kvantifisering av anti-TB narkotika alle lesjon rom, inkludert bakterier-rike caseum, med bare 1-3 vev deler totalt. Tradisjonelle vev homogenisering og LC/MS tilnærminger for narkotika kvantifisering i vev ofte mangler romlige spesifisitet for å løse spesifikke lesjon rom og selv når det er mulig, er det betydelig potensial cross forurense mobilnettet og nekrose leksjonen områder under manuell utpakkingen.
LCM-LC/MS tilnærmingen har flere viktige fordeler til masse massespektrometri-baserte bildeteknologi. Primære blant disse er fullt kvantitative egenskapene til metoden og ekstra følsomheten av LC/MS analyse på grunn av løse stoffet fra forstyrre/undertrykke endogene arter via brukt kromatografiske separasjon. MALDI-MSI gir imidlertid mer romlig informasjon om distribusjon. Som både MALDI-MSI og LCM-LC/MS/MS krever samme eksempel forberedelsene til å generere frossent deler, kan de to teknikkene utføres parallelt på den samme vev biopsy gir full kvantifisering sammen med svært detaljerte bilder av narkotika distribusjon. Et eksempel på behovet for høyere analytisk følsomhet er vist i Figur 3. Bare ble svært lave nivåer av EMB signal oppdaget i sentrale nekrotisk granulom størrelsesorden MALDI MS bildet (vist i figur 3B), antyder caseum penetrasjon av stoffet er dårlig. Men på grunn av førsteklasses grensen for påvisning av LCM-LC/MS stoffet ble klart vist til sterilisering konsentrasjoner i kupé og narkotika konsentrasjonen stede var hovedsakelig undetectable av MALDI (figur 3A).
Vev flekker protokoller brukes vanligvis før LCM for proteomic programmer for enkel identifisering av vev og celle populasjoner ligger. Rutine histochemical flekker som H & E ikke er kompatible med narkotika kvantifisering, som mange løsemiddelet vaske trinnene involvert ville delocalize stoffet fra delen vev. Tilstøtende kuttet deler kan være farget med H & E og brukes som en guide for microdissection. Dette er imidlertid ikke vanligvis nødvendig som lesjon seksjonene kan løses optisk under standard LCM brightfield mikroskopet (figur 2).
Optimalisering av punktene snitting og microdissection er avgjørende for vellykket lesjon kvantifisering. Under utviklingen av metoden vurdert vi to forskjellige membran materialer, polyetylentereftalat (PET) og polyetylen naphthalate (PENN), som substrat for montering delene vev for microdissection. PENN membraner led av økt statisk lading i forhold til PET membraner og ca 30% av alle dissekert vev områder var tapt på grunn av statisk gravitasjonskraften mellom regionen dissekert vev og membranen. Derfor PET membraner ble valgt ut for fremtidige disseksjoner på grunn av betydelig redusert statisk tiltrekningen observert (bare 5% av regioner dissekert fra PET membraner gikk tapt under LCM prosessen).
Stabiliteten av narkotika vev deler er en viktig faktor når du utformer en LCM-LC/MS studie. Under snitting og disseksjon, blir delene vev utsatt for lab temperatur og lys for en periode på minst 1 time. Andre problemer å inkludere utvinning effektiviteten i stoffet fra delene vev som det er ingen homogenisering trinn involvert (utvinning utføres bare av vortex miksing og sonication). I vår erfaring, gjør utvinning ikke lider av mangel på vev homogenisering på grunn av høy utvinning løsemiddelet vev forholdet brukes og thinness av vev dissekert. Våre observasjoner er enige med tidligere beskrevet online LCM-LC/MS metode utviklet for å kvantifisere propranolol i microdissected vev deler av hjernen og leveren, der komplett utvinning av stoffet fra vev ble observert fra 20 µm og 40 µm tykk avsnitt10. Vi validert effektiviteten i stoffet utvinning og narkotika stabiliteten under LCM prosessen ved å direkte sammenligne lunge vev konsentrasjoner (fra samme kanin og lunge lobe) analysert av LCM-LC/MS med konsentrasjonene som er fastsatt av standard vev homogenisering og LC/MS (et eksempel er vist i tabell 1). Denne sammenligningen tillater oss å bestemme om endringer av signal skjer mellom de to metodikkene.
Tettheten av dissekert vev regioner er også en viktig faktor når kvantifisere narkotika nivåer basert på vev område eller volum. Dette er av spesiell interesse for lunge og lesjoner biopsier, der uninvolved lunge vev områdene har en generell lavere tetthet enn cellular og caseum (mindre vev som dekker det samme relative arealet) av flere åpne bronchioles og alveolar områder. Effektene av denne forskjellen i tetthet kan begrenses ved nøye tegningen rundt det åpne rom å unngå å inkludere dem i kumulative arealet av samlet vev (som vist i figur 2).
En ekstra begrensning er at metoden for presentert LCM-LC/MS bare kvantifiserer totale konsentrasjonen i isolerte vevet (felles med alle vev homogenisering, løsemiddelekstraksjon og LC/MS kvantifisering tilnærminger) og løser ikke protein-bundet narkotika konsentrasjoner fra ubundet fraksjoner. Microdialysis er en alternativ tilnærming for kvantifisering ubundet narkotika i vev og gir nøyaktige kvantifisering av gratis narkotika konsentrasjonene nå ekstracellulære bestander av bakterier13. Imidlertid ville teknikken være best brukt som en komplementær tilnærming, som den mangler de romlige spesifisiteten av LCM-LC/MS og bare kvantifiserer løselig narkotika nivåer i vev ekstracellulære væske, ikke intracellulær innholdet.
Vi har kombinert, for første gang, LCM og LC/MS romlig kvantifisere antibiotika på stedet av tuberkulose infeksjon. Metodene er enormt kraftig siden det kan brukes på noen små molekyl narkotika brukes i enhver sykdom tilstand. Faktisk har vi nylig kvantifisert en soppdrepende stoffet kandidat i en musemodell av abdominal candidiasis14. Differansen stoffet partisjonering i heterogene svulst rom (inkludert nekrotisk kjerner) er et hovedanliggende i behandling av kreft, og et kritisk innsatsområde for forskning på kreft stoffet funnet15. LCM-LC/MS er ideelt å nærme seg disse spørsmålene. Videre LCM-LC/MS kan brukes for biomarkør funnet å kvantifisere stoffskifte, lipidomic og proteomic endringer forekommer i vev regioner og celle populasjoner under sykdom patogenesen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Paul O'Brien, Marizel Mina og Isabella Freedman for dyreforsøk, Jacquie Gonzalez og Danielle Weiner fra NIH/NIAID for hjelp med gamma bestråling av kanin vev før laser fange microdissection og Jansy Sarathy for manuskriptet tanker og råd. Dette arbeidet ble støttet av finansiering fra Bill og Melinda Gates Foundation (OPP1174780) og NIH delt instrumentering gi 1S10OD018072. Vi takker Eliseo A. Eugenin gir tilgang til Leica LMD 6500 mikroskopet og dele ekspertise og råd. Kjøp, og kontinuerlig støtte av LMD 6500 ble finansiert av The National Institute of Mental Health grant, MH096625, National Institute av nevrologiske lidelser og slag, NS105584, PHRI midler (til E.A.E) og GSK bidrag (til E.A.E).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| New Zealand White rabbits | Covance | N/A | |
| HN878 Mycobacterium tuberculosis | BEI Resources | NR-13647 | |
| Ketathesia (Ketamine) 100 mg/mL C3N | Henry Schein Animal Health | 56344 | |
| Anased (Xylazine) 100 mg/mL | Henry Schein Animal Health | 33198 | |
| Euthasol (pentobarbital sodium and phenytoin sodium) Solution | Virbac | 710101 | |
| Acetonitrile (LC-MS grade) | Fisher | A955-212 | |
| Methanol (LC-MS grade) | Fisher | A456-212 | |
| Formic Acid (LC-MS grade) | Fisher | A117-50 | |
| Water (LC-MS grade) | Fisher | W6212 | |
| 0.2 mL flat-cap PCR tubes | Corning | 07-200-392 | |
| Steel frames, PET-membrane | Leica | 11505151 | |
| Premium Frosted Microscope Slides | Fisher | 12-544-2 | |
| 96 Deep well plate 2.0ML PP RB | Fisher | NC0363259 | |
| Zorbax SB-C8 column (4.6 by 50 mm; particle size, 3.5 μm) | Agilent | 820631-001D | |
| "Zipper” Seal Sample Bags | Fisher | 01-816-1B | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| CM1850 cryostat | Leica | Discontinued | Leica CM1860 is the current model |
| Laser Microdissection System 6500 | Leica | Discontinued | Leica LMD 6 is the current model |
| Agilent 1260 Infinity II HPLC | Agilent | ||
| API 4000 QTRAP Mass Spectrometer | Sciex |
References
- Dartois, V. The path of anti-tuberculosis drugs: From blood to lesions to mycobacterial cells. Nat Rev Microbiol. 12 (3), 159-167 (2014).
- Prideaux, B., et al. The association between sterilizing activity and drug distribution into tuberculosis lesions. Nat Med. 21 (10), 1223-1227 (2015).
- Prideaux, B., et al. High-sensitivity MALDI-MRM-MS imaging of moxifloxacin distribution in tuberculosis-infected rabbit lungs and granulomatous lesions. Anal Chem. 83 (6), 2112-2118 (2011).
- Roscioli, K. M., et al. Desorption electrospray ionization (DESI) with atmospheric pressure ion mobility spectrometry for drug detection. Analyst. 139 (7), 1740-1750 (2014).
- Prideaux, B., et al. Mass spectrometry imaging of levofloxacin distribution in TB-infected pulmonary lesions by MALDI-MSI and continuous liquid microjunction surface sampling. Int J Mass Spectrom. 377, 699-708 (2015).
- Griffiths, R. L., Randall, E. C., Race, A. M., Bunch, J., Cooper, H. J. Raster-mode continuous-flow liquid microjunction mass spectrometry imaging of proteins in thin tissue sections. Anal Chem. 89 (11), 5683-5687 (2017).
- Prideaux, B., Stoeckli, M. Mass spectrometry imaging for drug distribution studies. J Proteomics. 75 (16), 4999-5013 (2012).
- Dilillo, M., et al. Mass spectrometry imaging, laser capture microdissection, and LC-MS/MS of the same tissue section. J Proteome Res. 16 (8), 2993-3001 (2017).
- Xu, B. J. Combining laser capture microdissection and proteomics: methodologies and clinical applications. Proteomics Clin Appl. 4 (2), 116-123 (2010).
- Cahill, J. F., Kertesz, V., Van Berkel, G. J. Laser dissection sampling modes for direct mass spectral analysis. Rapid Commun Mass Spectrom. 30 (5), 611-619 (2016).
- Subbian, S., et al. Chronic pulmonary cavitary tuberculosis in rabbits: A failed host immune response. Open Biol. 1 (4), 110016 (2011).
- Zimmerman, M., et al. Ethambutol partitioning in tuberculous pulmonary lesions explains its clinical efficacy. Antimicrob Agents Chemother. 61 (9), (2017).
- Kempker, R. R., et al. Cavitary penetration of levofloxacin among patients with multidrug-resistant tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother. 59 (6), 3149-3155 (2015).
- Zhao, Y., et al. Unraveling drug penetration of echinocandin antifungals at the site of infection in an intra-abdominal abscess model. Antimicrob Agents Chemother. , (2017).
- Pascal, J., et al. Mechanistic modeling identifies drug-uptake history as predictor of tumor drug resistance and nano-carrier-mediated response. ACS Nano. 7 (12), 11174-11182 (2013).
