Summary
Hier beschrijven we een protocol met behulp van laser vangt microdissection LC/MS-analyse wordt gekoppeld aan het ruimtelijk-kwantificeren drug distributies binnen longtuberculose granulomas. De aanpak heeft brede toepasbaarheid te kwantificeren van de drug concentraties in weefsels bij hoge ruimtelijke detail.
Abstract
Tuberculose is nog steeds een belangrijke oorzaak van morbiditeit en mortaliteit wereldwijd. Verbeteringen aan bestaande drug regimes en de ontwikkeling van nieuwe therapeutics zijn dringend noodzakelijk. De mogelijkheid van gedoseerd TB drugs te bereiken en steriliseren van bacteriën binnen de slecht-gevacuoliseerd necrotische regio's (caseum) van pulmonaire granulomen is cruciaal voor succesvolle therapeutische interventie. Effectieve therapeutische regimes moeten daarom drugs met gunstige caseum penetratie eigenschappen bevatten. Huidige LC/MS-methoden voor het kwantificeren van de drug niveaus in biologische weefsels hebben beperkte spatiële resolutie mogelijkheden, waardoor het moeilijk te bepalen nauwkeurig absolute drug concentraties binnen kleine weefsel compartimenten zoals die gevonden in necrotische granulomas. Hier presenteren we een protocol laser vangt microdissection (LCM) van pathologisch-verschillende weefsel regio's combineren met LC/MS kwantificering. Deze techniek biedt absolute kwantificering van drugs binnen granuloma caseum, omringende cellulaire laesie en afzijdig longweefsel en daarom nauwkeurig bepaalt of bactericide concentraties worden bereikt. Naast tuberculose-onderzoek heeft de techniek vele mogelijke toepassingen voor ruimtelijk-resolved kwantificering van drugs in zieke weefsels.
Introduction
De mogelijkheid voor ruimtelijk oplossen en kwantificeren van de niveaus van de drug is een cruciale eis om te bepalen of anti-tuberculose medicijnen bacteriële subpopulaties binnen pulmonaire laesies bereiken bij het steriliseren van concentraties1. Van bijzonder belang is het bepalen van drug penetratie in de necrotische kern van de laesie (ook wel caseum genoemd), die meestal bevat het hoogste aantal bacillen en kan slecht toegankelijk voor drugs te wijten aan de afwezigheid van vascularisatie.
Traditionele methodes om te beoordelen van de penetratie van de laesie, waarbij de homogenisering van de verwijderde pulmonaire laesies gevolgd door oplosmiddelen extractie en vloeistofchromatografie massaspectrometrie (LC/MS) analyse, zijn zeer gevoelige en selectieve voor de drugs belang. Echter, deze methoden bieden slechte ruimtelijke informatie, beperkt tot de grootte van het oorspronkelijke gehomogeniseerde weefsel. Massa spectrometrie gebaseerde imaging benaderingen, zoals laser matrix-bijgewoonde desorptie ionisatie (MALDI)2,3, desorptie electrospray ionisatie (DESI)4 of vloeistof-enhanced oppervlakte extractie5, 6 zeer ruimtelijk-resolved beeldvormende mogelijkheden bieden, maar directe kwantificering kan zeer uitdagend of onmogelijk toe te schrijven aan de heterogene ion onderdrukking effecten en verschillende extractie-efficiëntie van de analyt uit de verschillende cel of weefsel bestandstypen7. Bovendien zijn de meest directe weefsel MS imaging benaderingen inherent minder gevoelig dan LC/MS als gevolg van het ontbreken van de gaschromatografische scheiding van endogene soorten concurreren voor ionisatie en de lagere solvent extractie-efficiëntie van de drug van weefsel.
Laser vangt microdissection (LCM) gecombineerd met LC/MS analyse is routinematig toegepast om te isoleren en karakteriseren van weefsel van de onderscheiden regio's voor proteomic8,9 bestudeert en onlangs gebruikt voor de kwantificering van de drug in gedoseerd dierlijk weefsel10. Hier presenteren we een geoptimaliseerde protocol LCM gecombineerd met LC/MS (LCM-LC/MS) analyse om te kwantificeren van anti-TB geneesmiddelen binnen verschillende granuloma compartimenten toe te passen. In het opnameproces microdissection laser, is een UV-laser gericht door de doelstelling van de Microscoop op het gedeelte van het weefsel, dat snijdt en isoleert het gewenste weefsel gebied door het volgen van een pad dat is gedefinieerd door de gebruiker. Voor zwaartepunt-bijgewoonde LCM (de techniek die gebruikt wordt voor dit onderzoek), de weefselsectie is gemonteerd op een dunne polymeer membraan dia (PET of PEN) en het weefsel wordt vastgelegd in een collectie buis cap gevestigd onder de dia. De drugs worden geëxtraheerd uit het verwijderde weefsel en gekwantificeerd aan de hand van standaard LC/MS benaderingen. De hoeveelheid weefsel vereist te verzamelen wordt uiteindelijk bepaald door de verwachte concentratie van de drug in het weefsel aanwezig en de gevoeligheid van de LC/MS methode. Voor de meeste analyses van drugs gedoseerd therapeutische niveau en geanalyseerd met behulp van een massaspectrometer routine triple vierpolige, 3 miljoen µm2 (3 mm2) weefsel van het is oppervlak voldoende.
Dit protocol beschrijft een krachtige combinatie van ruimtelijke profilering en volledige kwantificering aangeboden door LCM-LC/MS, absolute drug concentraties binnen alle compartimenten van TB granulomas verstrekken. De techniek kan ook worden toegepast op het bepalen van de concentraties van de drug in vele verschillende zieke weefsels en vitale drug ontdekking en ontwikkeling voorlichting.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierlijke studies werden uitgevoerd volgens de richtsnoeren voor de zorg en het gebruik van proefdieren van het National Institutes of Health met goedkeuring van de institutionele Animal Care en gebruik Comité van de NIAID (NIH), Bethesda, MD.
1. dierproeven en weefsel collectie
Dit gedeelte van het protocol beschrijft dierlijke procedures en sample collectie Biosafety Level 3 (BSL3) omstandigheden. Eerder beschreven gedetailleerde protocollen van de Mycobacterium tuberculosis aërosol infectie procedure drug administratie en protocollen bij konijnen zijn11,12.
- Nieuw-Zeeland wit konijnen (mannelijk en vrouwelijk op 4-5 maanden oud) met M. tuberculosis HN878 infecteren11met behulp van een neus-alleen aërosol-systeem, zoals hiervoor is beschreven.
- Beheren van de gekozen drugs (Ethambutol in het voorbeeld hier gepresenteerd) via de gewenste route en euthanaseren van de dieren op 2, 6 en 24 uur na toediening. Ten eerste, het anesthetize van het konijn door intramusculaire injectie van Ketamine op 35 mg/kg en Xylazine bij 5 mg/kg. Wacht tien minuten en juiste afstomping bevestigen door knijpen de staart en zachtjes aanraken van het oog. Als er geen reactie, euthanaseren door intraveneuze toediening van pentobarbital en fenytoïne (Zie Tabel van materialen) in 1 mL/4,5 kg in 2 mL steriele zoutoplossing.
Opmerking: Deze timepoints zijn optimale ter dekking van het farmacokinetische profiel voor Ethambutol en vereisen aanpassen/optimaliseren voor andere studie drugs. - Gebruik pincet, schaar en/of scalpel, verwijderen van de longen van de borstholte, resect Long biopsieën met grote necrotische granulomas ingebed in het omringende afzijdig longweefsel (zoals eerder beschreven3). Necrotische granulomas verschijnen in beige kleur en meestal iets uitsteken van de omliggende rood/roze-gekleurde Long. Ter vergemakkelijking gemakkelijk cryosectioning, ervoor zorgen dat biopten niet groter zijn dan 2 x 1,5 x 1,5 cm.
- Plaats de biopsie op een vooraf gelabelde cryomold dienblad met de gewenste snijvlak met pincet, in direct contact met de basis van de lade. Na invriezing, zorgt dit voor een plat oppervlak waaruit cryosecties zal worden gesneden.
- Het bevriezen van de biopsie in vloeibare stikstof damp. Vul een piepschuim container tot een diepte van 2 inch met vloeibare stikstof en plaatsen van een metalen buis draadrek. Het rek moet uitsteken boven het oppervlak van de vloeibare stikstof bieden een plat oppervlak waarop de weefsel schaaltjes zijn geplaatst. Plaats het deksel terug op de styrofoam-container en laat weefsels voor 10 minuten naar het volledig bevriezen.
- Verwijder de weefsel schaaltjes, snel wikkel in aluminium film en plaats afzonderlijk label hersluitbare plastic zakken en zegel. Overbrengen-80 ° C vrieskast voor opslag.
Opmerking: Stappen 1.1-1.6 zijn uitgevoerd in BSL3 voorwaarden (met inbegrip van alle dierlijke werk en behandeling van besmette organen en weefsels). Gamma bestralen de Long biopsieën 3 megarad behandeling buiten BSL3 insluiting inschakelen. Laser vangt microdissection op unsterilized weefsel kan worden uitgevoerd binnen de BLS3 faciliteit als goedgekeurd veiligheid protocollen zijn getroffen. De rest van dit protocol wordt echter beschreven downstream processing in een faciliteit BSL-2.
2. de weefsels segmenteren
- De cryostaat tot het snijden van de gewenste temperatuur instellen De gamma-bestraalde Long biopsie van-80 ° C opslag overbrengen naar de cryostaat en laat gedurende 30 minuten om de temperatuur van het weefsel equilibreer. Opmerking: -20 tot-22 ° C is optimaal voor TB laesie biopsieën.
- Met pincet, bevestigen de biopsie aan de cryostaat chuck met behulp van een kleine hoeveelheid van optimale scherpe temperatuur lijm (OCT) te houden van de basis van het weefsel aan de chuck. Het weefsel oriënteren zodat het platte oppervlak (dat was in contact met de basis van de cryomold) het blootgestelde oppervlak voor het snijden is. Zorg ervoor dat de LGO vervuilt niet het oppervlak van het weefsel, omdat dit met de Spectrometrie van de massa van de daaropvolgende analyse interfereren kan.
- Drie weefselsecties bij 25 µm dikte snijden en mount in PET membraan dia's. Zachtjes aanraken van het membraan naar de weefselsectie en verwijderen. Als te veel druk wordt toegepast, kan de dunne membraan scheurt.
- Vermijd buitensporige behandeling van de dia's vóór montage aangezien dit zal resulteren in het membraan van de PET steeds geladen en slechte hechting van de weefselsecties. Ervoor zorgen dat de membraan dia wordt bewaard bij kamertemperatuur om dooi-montage en succesvolle hechting van het weefsel aan de membraan.
- De dia uit de cryostaat verwijderen en laten drogen gedurende 3 minuten. Als LCM-LC/MS/MS zal niet onmiddellijk worden uitgevoerd, zegel de dia in een luchtdicht afsluitbaar zakje en overdracht aan-80 ° C opslag totdat vereist voor dissectie.
- Snijd een aangrenzende sectie op 10-12 µm en dooi-mount op een standaard glasplaatje voor haematoxyline en eosine (H & E) kleuring en verwijzing. Extra secties kunnen worden gesneden op dit moment voor andere gewenste histochemie vlekken (zoals Ziehl-Niellsen voor het visualiseren van Mycobacterium tuberculosis (MTB)).
3. Microdissection
- Verwijderen van verzegelde zak met de dia uit de opslag van-80 ° C en laat kamertemperatuur gedurende 5 minuten bereiken.
Opmerking: Als de koude dia wordt direct blootgesteld aan de atmosfeer laboratorium, het weefsel zal worden bekleed met condensatie en de ruimtelijke integriteit van de drug kan worden aangetast. - Schakel de Microscoop en laser (laser vereist 5-10 minuten opwarmen voordat snijden kan beginnen). Laad flat-cap 0,20 mL PCR buizen in de houder.
- Dia verwijderen uit de zak en nemen een optische beeld van de weefselsectie op de PET-dia een flatbedscanner gebruikt.
- Plaats van de dia in de dia houder (weefsel kant naar beneden) en gescheiden inzameling buizen toewijzen aan specifieke granuloma regio's van belang met behulp van de Microscoop software. Meestal zullen deze 'afzijdig lung,' 'cellulaire granuloma,' en 'caseum' (necrotisch midden), maar kan variëren afhankelijk van de specifieke pathologie van de granuloma/biopsie.
- Focus op het weefsel met de 5 X Microscoop doelstelling. Deze vergroting dient een goed overzicht van het weefsel bevattende zowel cellulaire en necrotische granuloma gebieden. Selecteer de aangewezen 'caseum' om deze te verplaatsen naar de gewenste positie onder het weefsel van de buis in de software.
- Voer de gewenste dissectie-parameters. Standaardinstellingen voor een 25 µm dik Long sectie zijn laser macht 30, 15, en diafragma 35 (willekeurige eenheden). Dit zal echter verschillen afhankelijk van de Microscoop gebruikt en potentieel afnemende macht als gevolg van de leeftijd van de laser.
- Selecteer het gereedschap 'gratis-draw' en met behulp van een muis of touchscreen pen, overzicht van het gewenste gebied voor dissectie. De oppervlakte van de regio zal getoond worden in de software. Geselecteerde regio's onder 500.000 µm2 (0,5 mm2) ter vergemakkelijking van gemakkelijker dissectie houden. Herhaal de dissectie tot 3 miljoen µm2 (3 mm2) zijn verzameld in totaal in de dop van de tube.
- Soms kan de ontleed regio blijven steken naar de omliggende membraan (bijvoorbeeld als gevolg van statische attractie) en niet vallen in het GLB collectie. Deze regio's uit de cumulatieve oppervlakte totaal verwijderen door te selecteren en handmatig verwijderen binnen de software.
- Selecteer het GLB voor 'cellulaire laesie' en verzamelen van 3 miljoen µm2 van weefsel via hetzelfde proces zoals beschreven in stap 3.7.
- Selecteer het GLB voor 'afzijdig lung' en verzamelen van 3 miljoen µm2 van weefsel via hetzelfde proces zoals beschreven in stap 3.7. Merk op dat afzijdig longweefsel vele bronchioli en alveolaire ruimten bevat. Let goed op het uitsluiten van de gedefinieerde weefsel regio's voor dissectie.
- Verwijder de dop houder en zorgvuldig unclip, zegel en label van elke buis. Bescherm de ontleed weefsels uit de omliggende lucht verstoringen (zoals met ingang van verstoring van de stroom van de lucht van een deur openen). Analyseer de ontleed weefsels onmiddellijk, of opslaan bij-80 ° C en voorafgaand aan de verwerking en analyse van de LCMS ontdooien.
4. extractie en LCMS analyse
- Bereid extractieoplossing van 1:1 acetonitril/methanol met Ethambutol d-10 interne standaard. Bij het selecteren van een interne standaard, gebruik een stabiele gelabelde vorm van de analyt drug (zoals deuterium-geëtiketteerden EMB gebruikt in deze demonstratie) en met voldoende massa SHIFT ingedrukt om te voorkomen dat isotoop cross talk tussen de analyt drug en standaard (meestal minimaal 4 Dalton) .
Opmerking: Opstellen van normen op homogenaat van elke respectieve weefseltype is moeilijk omdat er is zeer beperkte controle weefsel waarmee homogenaat normen maken. Als alternatief voor het maken van de normen van een puntige homogenaat monster, kan een standaard worden gemaakt door toevoeging van lege weefsel en teststof samen en uitgepakt. Een volume van weefsel van het besturingselement in een homogenaat die overeenkomt met het doelvolume voor de studie steekproef weefselsecties wordt gecombineerd rechtstreeks met een bedrag van de teststof dat bij een bepaalde concentratie aanwezig zou zijn. - Berekenen van het volume van de gerichte weefsel op basis van de oppervlakte en de dikte van de weefselsectie en bepalen de nodige verdunningsfactor voor het homogenaat met behulp van de hoeveelheid homogenaat die zal worden toegevoegd aan de standaard en QC-monsters. Berekeningen zijn hieronder geïllustreerd voor 3 miljoen µm2 (3 mm2) ontleed doelgebied met een 25 µm dikte en 2 µL homogenaat hoeveelheid.
- Uitgaande van een weefsel dichtheid van 1 g/mL, bereiden de homogenaat voorraad door met een gewicht van 50 mg controle weefsel en het toevoegen van PBS buffer om te verdunnen (met behulp van de verdunningsfactor 26.67 homogenaat berekend in stap 4.2, het oplosmiddel is 1.283 mL). Meng door parel gewonnen van longweefsel en PBS buffer voor 5 minuten van 1750 toeren per minuut op een kraal homogenizer.
- Verdunnen 1 mg/mL drug voorraden concentratie in 1:1 acetonitril/water maken standaard curve stekelige oplossingen. Bepalen stekelige standaard concentraties op basis van het volume spike en het doelvolume weefsel. Het geïllustreerde voorbeeld is voor een 100 ng/mL standaard gebruik van een 10 µL spike volume.
- Verwijder de buizen met de microdissected weefsels uit opslag-80 ° C en laat tot kamertemperatuur voor 5 minuten.
- 10 µL van 1:1 acetonitril/water-oplossing en 2 µL van PBS buffer toevoegen aan de buizen met microdissected weefsel.
- Voor standaard curve en kwaliteitscontrole buizen, voegt u 10 µL van stekelige oplossing voor 2 µL van controle Long homogenaat.
- Voeg 50 µL van extractieoplossing aan elke buis.
- Vortex elke buis voor 5 minuten, bewerk ultrasone trillingen ten gedurende 5 minuten en centrifugeer bij 5000 TPM gedurende 5 minuten tot het vormen van een pellet van film en weefsel in elke buis.
- Breng 50 µL van bovendrijvende substantie over een diep-well 96-wells-plaat en Verdun met een extra 50 µL van gedeïoniseerd water in elk putje.
- LC/MS/MS analyses met behulp van geoptimaliseerde instrument parameters voor Ethambutol en Ethambutol-d10 interne standaard (zoals eerder beschreven in detail12) uit te voeren.
- Gebruik een verdunningsfactor om te corrigeren voor het exacte bedrag van weefsel ontleed voor elk monster.
5. methode validatie
- Maak een homogenaat in longweefsel controle door het combineren van 1 deel Long, 2 delen PBS en 3-4 stalen kralen. Beat longweefsel en PBS buffer voor 5 minuten van 1750 toeren per minuut met behulp van een kraal homogenizer.
- Spike de homogenaat door toevoeging van 10 µL van 1 mg/mL Ethambutol DMSO voorraad in 990 µL homogenaat maken een eindconcentratie van 10.000 ng/mL (10 mg/mL) en vortex gedurende 1 minuut.
- Maak een bevroren homogenaat blok door het homogenaat gieten in een cryomold en snel bevriezen op droog ijs gedurende 5 minuten.
- Bereiden van 25 µm dik secties van het homogenaat blok zoals beschreven in stappen 2.1-2.5.
- Het doelgebied van de weefsel zoalsgespecificeerd in stappen 3.2-3.10 ontleden.
- 10 µL 1:1 acetonitril/water en 2 µL van PBS buffer toevoegen aan de buizen met microdissected weefsel.
- Voeg 50 µL van extractieoplossing aan elke buis. Stappen 4.9-4.12 maakt een standaard curve te bepalen van de concentratie van de drug in het weefsel homogenaat blok.
- Bereken de extractie-efficiëntie met behulp van de onderstaande formule:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een overzicht van de LCM-LC/MS-aanpak is afgebeeld in Figuur 1. Na het steriliseren van het weefsel door gamma-bestraling, plaatsvinden alle opeenvolgende stappen (van weefsel afdelen vanaf) buiten BSL3 voorwaarden. Figuur 2 toont de laesie biopsie secties voor en na weefsel isolatie door de LCM. Necrotisch en cellulaire gebieden van TB letsels kunnen gemakkelijk worden geïdentificeerd en geïsoleerd door visuele inspectie van optische beelden alleen (zonder de verplichting om te verwijzen naar aangrenzende weefselsecties histologisch gebeitste). De dissectie-proces produceert een schoon gesneden met minimale verstoring van het omliggende weefsel en ontleden van 3 miljoen µm2 (3 mm2) van elke regio van belang van de laesies duurt ongeveer 1 uur in totaal.
De extractie-efficiëntie en stabiliteit van de LCM-LC/MS methode werd beoordeeld met behulp van Ethambutol EMB-spiked Long homogenaat (tabel 1). Volledige extractie van de drug werd waargenomen, en geen stabiliteitsproblemen drugs werden ontdekt door de dissectie en extractie proces. Het protocol voor extractie en kwantificering van LCM-LC/MS werd verder gevalideerd door vergelijking met gevestigde LC/MS kwantificering methodes toegepast op de dezelfde weefsels. Als gevolg van de inherente heterogeniteit van necrotisch pulmonaire TB laesies en de slechte ruimtelijke specificiteit aangeboden door standaard weefsel homogenisering, we de LCM-LC/MS methode gevalideerd door rechtstreeks vergelijken drug concentraties in afzijdig Long geanalyseerd door beide analytische technieken (als gevolg van de relatief hoge weefsel homogeniteit). Tabel 2 toont de drug concentraties in afzijdig Long van biopten genomen van drie Ethambutol-gedoseerd konijnen zoals geëvalueerd door: 1) homogenisatie van 25 µm dik weefselsecties en analyseren door standaard LC/MS, en 2) LCM-LC/MS analyse van afzijdig Long gebieden een aangrenzende 25 µm dik weefselsectie ontnomen. De gegevens blijkt dat twee benaderingen consistente kwantificering gegevens produceren, het aantonen van de geschiktheid voor routinematige ruimtelijke kwantificering.
Wij hebben toegepast LCM-LC/MS om ruimtelijk-kwantificeren veel bestaande en nieuwe anti-TB geneesmiddelen binnen de pulmonaire laesies. Figuur 3A in het volgende worden voorbeeldgegevens weergegeven uit MTB-besmette konijnen gedoseerd steady-state met Ethambutol. LCM-LC/MS ingeschakeld volledige kwantificering van de drug opgelost binnen caseum, cellulaire laesie en afzijdig Long weefsel gebieden. EMB werd waargenomen om te penetreren in de laesie en steriliserende concentraties binnen het necrotische caseum bereiken. De overeenkomstige MALDI-MS afbeelding van EMB distributie verworven van een aangrenzende weefselsectie wordt getoond in figuur 3B. De kwalitatieve MALDI-MS beelden correleert met de kwantitatieve gegevens van de LCM-LC/MS met concentraties lager drug zijn ontdekt in het necrotische caseum in vergelijking met de cellulaire velg. LCM-LC/MS data werd gevalideerd door directe vergelijking met weefsel homogenates geanalyseerd door standaard LC/MS.
Figuur 1 : Schematische van de LCM-LC/MS proces. Konijn Long biopsieën met necrotic laesie samen met omringende afzijdig Long worden verzameld en ingevroren. Cryosecties worden gesneden op dunne PET membranen en gebieden van afzijdig Long, cellulaire en kaasachtige laesie worden ontleed en geïsoleerd voor kwantificering door LC/MS. aangepast van Zimmerman et al. 12 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Laesie (A, B) en afzijdig longkanker (C, D) als ze verschijnen wanneer bekeken met behulp van de Microscoop voor (A, C) en na (B, D) microdissection. Kaasachtige laesie gebieden weergegeven donkerder en 'gekraakte' in de optische beeld van de scan (een, groene omtrek). Cellulaire laesie is lichter van kleur en meer solide structuur (A, rode omtrek). Afzijdig Long moet worden bemonsterd ten minste 5 mm afstand van de grens van de laesie en verschijnt rood/roze in kleur (C, cyaan overzicht). Schaal bars (zwart, blauw en paars) = 400 µm. opmerking dat alleen effen gebieden van afzijdig Long moeten worden geselecteerd om te voorkomen alveolaire spaties en bronchioli inclusief in de totale oppervlakte van weefsel verzameld (zoals weergegeven in D). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Voorbeeld LCM-LC/MS dataset van laesie biopten genomen van twee konijnen gedoseerd met EMB 100 mg/kg gedurende 7 dagen. (A) gunstige penetratie van de drug in alle compartimenten van de Long- en laesie werd waargenomen. Drug concentraties gekwantificeerd door LCM-LC/MS (holle balken) /MS waren in sterke overeenkomst met die van gehomogeniseerde ontleed laesies gekwantificeerd door standaard LC/MS (solid bars, gemiddelde ± standaard afwijking, n = 3-8). De minimale concentraties nodig om te doden van 99% van extracellulaire replicerende bacillen (MBC99) en 99% van de intracellulaire bacillen in macrofagen (iMBC99) zijn aangegeven. (B) bovenste paneel: MALDI-MS afbeelding toont de verdeling van de EMB [M + H]+ ion (m/z 205.193) binnen een aangrenzende weefselsectie. Merk op dat de MALDI-MS afbeelding suggereert slechte penetratie van EMB in de caseum als gevolg van de huidige concentraties van de drug onder de ondergrens aantoonbaarheidsgrens (LOD) van de techniek. De ruimtelijke specificiteit en superieure LOD voor LCM-LC/MS blijkt echter dat de drug is het bereiken van steriliserende concentraties binnen alle compartimenten van de laesie met inbegrip van de caseum. Lagere paneel: haematoxyline en eosine gekleurd weefselsectie direct grenzend aan de sectie voor MALDI MSI gebruikt. Cellular (C) en necrotische granulomas (NG) waren aanwezig in het weefsel. De caseum kern is uiteengezet in wit. Aangepast van Zimmerman et al. 12 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Ontleed gebied (µm2) | EMB conc. (ng/g) gemeten (n = 3) | EMB herstel (%) (n = 3) |
| 3 miljoen | 10633 (±404) | 106 (±4) |
| 5 miljoen | 10057 (±1132) | 101 (±11) |
| 10 miljoen | 10563 (±1128) | 105 (±11) |
Tabel 1: Extractie-efficiëntie van de LC-LC/MS methode voor de kwantificering van EMB in Long. Volledig herstel van EMB werd waargenomen in de EMB spiked Long homogenaat ontleed weefsels voor alle volumes van de geëvalueerde weefsel.
| Konijn-ID | LC/MS EMB (ng/g) | LCM-LC/MS EMB (ng/g) | Verschil (%) |
| 899 | 2910 | 3320 | 14 |
| 904 | 2010 | 1870 | -7 |
| 911 | 2150 | 2370 | 9 |
Tabel 2: Vergelijking van EMB kwantificering in afzijdig Long Biopten van 3 gedoseerd konijnen door LC/MS en LCM-LC/MS. Gelijkwaardige drug concentraties werden ontdekt door zowel methoden en geen verlies van signaal als gevolg van aantasting of extractie tijdens het LCM-LC/MS werd waargenomen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ruimtelijk-resolved kwantificering van drugs in de pulmonaire TB laesies is vereist om te bepalen of blootstelling van de drug bereikt steriliserende concentraties aan bacteriële bevolking woonachtig binnen de verschillende laesie compartimenten. De hier beschreven methode van LCM-LC/MS kunt absolute kwantificering van anti-TB geneesmiddelen binnen alle compartimenten van de laesie, met inbegrip van de bacteriën-rijke caseum, met behulp van slechts 1-3 weefselsecties in totaal. Traditionele weefsel homogenisering en LC/MS benaderingen voor drug kwantificering in weefsel vaak missen de ruimtelijke specificiteit u kunt oplossen door specifieke laesie compartimenten en zelfs wanneer het mogelijk is, er is een groot potentieel om te vervuilen mobiele kruis en necrotic laesie gebieden tijdens het handmatig uitpakken.
De LCM-LC/MS-aanpak heeft verscheidene belangrijke voordelen aan massa spectrometrie gebaseerde imaging-technologieën. Primaire onder deze zijn de volledig kwantitatieve mogelijkheden van de methode en de extra gevoeligheid van de LC/MS-analyse toe te schrijven aan de oplossing van de drug van endogene soorten mengen/onderdrukken via chromatografische scheiding. MALDI-MSI biedt echter meer ruimtelijke informatie met betrekking tot de distributie van drugs. Aangezien zowel de MALDI-MSI en de LCM-LC/MS/MS dezelfde steekproef voorbereiding stappen vereisen voor het genereren van bevroren weefselsecties, kunnen de twee technieken worden uitgevoerd in tandem op de dezelfde weefsel biopsie bieden volledige kwantificering naast zeer gedetailleerde beeldvorming van de drug distributie. Een voorbeeld van het vereiste voor hogere analytische gevoeligheid is afgebeeld in Figuur 3. Slechts werden zeer lage niveaus van EMB signaal ontdekt in de regio van de centrale necrotische granuloma van de MALDI MS afbeelding (afgebeeld in figuur 3B), suggereren caseum penetratie van de drug is slecht. Echter, als gevolg van de superieure limiet van detectie voor LCM-LC/MS de drug werd duidelijk aangetoond te bereiken steriliserende concentraties binnen dat compartiment en de drug concentratie aanwezig was overwegend niet detecteerbaar door MALDI (figuur 3A).
Weefsel kleuring protocollen worden doorgaans gebruikt voor LCM voor proteomic toepassingen om gemakkelijke identificatie van weefsel gebieden en de bevolking van de cel bevinden. Routine histochemische vlekken zoals H & E zijn niet compatibel met drug de kwantificering, zoals de vele oplosmiddel wassen stappen betrokken de drug van de weefselsectie van het iedereen zou. Aangrenzende gesneden secties kunnen worden gekleurd met H & E en worden gebruikt als een gids voor microdissection. Echter, dit is meestal niet nodig, omdat de laesie compartimenten kunnen optisch worden opgelost onder de standaard LCM helderveld Microscoop (Figuur 2).
Optimalisatie van de segmenteren en microdissection stappen is cruciaal voor succesvolle laesie kwantificering. We geëvalueerd tijdens de ontwikkeling van de methode, twee verschillende membraan materialen, polyethyleentereftalaat (PET) en polyethyleen poly(ethyleennaftalaat) (PEN), als basismateriaal voor de montage van de weefselsecties voor microdissection. PEN membranen lijden van verhoogde statische opladen in vergelijking met PET membranen en ongeveer 30% van alle ontleed weefsel gebieden werden verloren als gevolg van statische aantrekkingskracht tussen de regio ontleed weefsel en het membraan. Om deze reden, PET-membranen werden gekozen voor toekomstige dissecties als gevolg van de aanzienlijk lagere statische attractie waargenomen (slechts 5% van de regio's van PET membranen ontleed verloren tijdens het LCM gingen).
De stabiliteit van drugs in weefselsecties is een belangrijke overweging bij het ontwerpen van een studie van de LCM-LC/MS. Tijdens het segmenteren en dissectie worden de weefselsecties blootgesteld aan lab temperatuur en licht voor een periode van ten minste 1 uur. Andere kwesties om te overwegen omvat de extractie-efficiëntie van de drug van de weefselsecties, aangezien er geen homogenisering stap betrokken (extractie wordt alleen uitgevoerd door vortex mengen en ultrasoonapparaat). In onze ervaring last de extractie geen van het ontbreken van weefsel homogenisering als gevolg van de hoge extractievloeistof weefsel verhouding gebruikt en de dunheid van de weefselsecties ontleed. Onze opmerkingen zijn in overeenstemming met een eerder beschreven online LCM-LC/MS methode ontwikkeld om te kwantificeren van propranolol in microdissected weefselsecties van hersenen en lever, waar volledige extractie van de drug van weefsel werd waargenomen van 20 µm en 40 µm dik secties10. We de efficiëntie van de drug extractie gevalideerd en de stabiliteit van de drug tijdens het LCM door rechtstreeks vergelijken Long weefsel concentraties (uit de dezelfde konijn en Long kwab) geanalyseerd door LCM-LC/MS met concentraties bepaald door standaard weefsel homogenisering en LC/MS (een voorbeeld is weergegeven in tabel 1). Deze vergelijking kan we bepalen of elke verandering van signaal tussen de twee methoden voordoet zich.
De dichtheid van ontleed weefsel regio's is ook een belangrijke overweging wanneer het kwantificeren van de drug niveaus op basis van de oppervlakte van weefsel of het volume. Dit is van bijzonder belang voor longkanker en letsels biopsieën, waarin de afzijdig Long weefsel gebieden hebben een over het algemeen lagere dichtheid dan cellulaire en caseum (minder weefsel die betrekking hebben op de dezelfde relatieve oppervlakte) als gevolg van de aanwezigheid van meerdere open bronchioli en alveolaire ruimten. De gevolgen van dit verschil in dichtheid kunnen worden verzacht door zorgvuldig te tekenen rond de open ruimtes om te voorkomen dat ook hen binnen de cumulatieve oppervlakte van verzamelde weefsels (zoals weergegeven in Figuur 2).
Een extra beperking is dat de onderhavige LCM-LC/MS methode alleen totale drug concentratie binnen de geïsoleerde weefsel (net als alle weefsel homogenisering, solvent extractie en benaderingen van de kwantificering van de LC/MS kwantificeert) en niet is opgelost eiwit-gebonden drug concentraties niet-afhankelijke breuken. Microdialysis is een alternatieve benadering voor het kwantificeren van niet-afhankelijke drug binnen weefsel en maakt nauwkeurige kwantificering van gratis drug concentraties extracellulaire populaties van bacteriën13te bereiken. Echter de techniek zou worden het beste toegepast als een complementaire aanpak, omdat het ontbreekt aan de ruimtelijke specificiteit voor LCM-LC/MS en alleen oplosbare drug niveaus binnen weefsel extracellulaire vloeistof, niet over de intracellulaire inhoud kwantificeert.
We hebben gecombineerd, voor de eerste keer, LCM en LC/MS te kwantificeren ruimtelijk antibiotica op de site van tuberculose-infectie. De methodologie is enorm krachtig aangezien het kan worden toegepast op een klein molecuul drug die wordt gebruikt in een staat van de ziekte. Inderdaad, hebben we onlangs een antischimmel drug kandidaat in een muismodel van abdominale candidiasis14gekwantificeerd. Differentiële drug partitioneren in heterogene tumor compartimenten (met inbegrip van necrotisch kernen) is een primaire zorg in de behandeling van kanker en een cruciaal gebied voor onderzoek naar kanker drug discovery15. LCM-LC/MS is ideaal geschikt voor de aanpak van deze vragen. Anderzijds LCM-LC/MS kan worden gebruikt voor de ontdekking van biomarker te kwantificeren van metabole, lipidomic en Proteoom veranderingen die zich voordoen in de regio's van weefsel en cel populaties tijdens pathogenese van de ziekte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We bedanken Paul O'Brien, Marizel Mina en Isabella Freedman voor dierproeven, Jacquie Gonzalez en Danielle Weiner van NIH/NIAID voor hulp bij gamma bestraling van konijn weefsels voorafgaand aan de laser vangt microdissection en Jansy Sarathy voor manuscript gedachten en advies. Dit werk werd gesteund door financiële middelen van de Bill en Melinda Gates Foundation (OPP1174780) en NIH gedeeld instrumentatie verlenen 1S10OD018072. Wij danken Eliseo A. Eugenin voor toegang tot de Leica LMD 6500 Microscoop en het delen van expertise en advies. De aankoop en continue ondersteuning van de 6500 LMD werd gefinancierd door het National Institute of Mental Health grant, MH096625, het National Institute of Neurological Disorders en beroerte, NS105584, PHRI financiering (E.A.E) en GSK bijdragen (aan E.A.E).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| New Zealand White rabbits | Covance | N/A | |
| HN878 Mycobacterium tuberculosis | BEI Resources | NR-13647 | |
| Ketathesia (Ketamine) 100 mg/mL C3N | Henry Schein Animal Health | 56344 | |
| Anased (Xylazine) 100 mg/mL | Henry Schein Animal Health | 33198 | |
| Euthasol (pentobarbital sodium and phenytoin sodium) Solution | Virbac | 710101 | |
| Acetonitrile (LC-MS grade) | Fisher | A955-212 | |
| Methanol (LC-MS grade) | Fisher | A456-212 | |
| Formic Acid (LC-MS grade) | Fisher | A117-50 | |
| Water (LC-MS grade) | Fisher | W6212 | |
| 0.2 mL flat-cap PCR tubes | Corning | 07-200-392 | |
| Steel frames, PET-membrane | Leica | 11505151 | |
| Premium Frosted Microscope Slides | Fisher | 12-544-2 | |
| 96 Deep well plate 2.0ML PP RB | Fisher | NC0363259 | |
| Zorbax SB-C8 column (4.6 by 50 mm; particle size, 3.5 μm) | Agilent | 820631-001D | |
| "Zipper” Seal Sample Bags | Fisher | 01-816-1B | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| CM1850 cryostat | Leica | Discontinued | Leica CM1860 is the current model |
| Laser Microdissection System 6500 | Leica | Discontinued | Leica LMD 6 is the current model |
| Agilent 1260 Infinity II HPLC | Agilent | ||
| API 4000 QTRAP Mass Spectrometer | Sciex |
References
- Dartois, V. The path of anti-tuberculosis drugs: From blood to lesions to mycobacterial cells. Nat Rev Microbiol. 12 (3), 159-167 (2014).
- Prideaux, B., et al. The association between sterilizing activity and drug distribution into tuberculosis lesions. Nat Med. 21 (10), 1223-1227 (2015).
- Prideaux, B., et al. High-sensitivity MALDI-MRM-MS imaging of moxifloxacin distribution in tuberculosis-infected rabbit lungs and granulomatous lesions. Anal Chem. 83 (6), 2112-2118 (2011).
- Roscioli, K. M., et al. Desorption electrospray ionization (DESI) with atmospheric pressure ion mobility spectrometry for drug detection. Analyst. 139 (7), 1740-1750 (2014).
- Prideaux, B., et al. Mass spectrometry imaging of levofloxacin distribution in TB-infected pulmonary lesions by MALDI-MSI and continuous liquid microjunction surface sampling. Int J Mass Spectrom. 377, 699-708 (2015).
- Griffiths, R. L., Randall, E. C., Race, A. M., Bunch, J., Cooper, H. J. Raster-mode continuous-flow liquid microjunction mass spectrometry imaging of proteins in thin tissue sections. Anal Chem. 89 (11), 5683-5687 (2017).
- Prideaux, B., Stoeckli, M. Mass spectrometry imaging for drug distribution studies. J Proteomics. 75 (16), 4999-5013 (2012).
- Dilillo, M., et al. Mass spectrometry imaging, laser capture microdissection, and LC-MS/MS of the same tissue section. J Proteome Res. 16 (8), 2993-3001 (2017).
- Xu, B. J. Combining laser capture microdissection and proteomics: methodologies and clinical applications. Proteomics Clin Appl. 4 (2), 116-123 (2010).
- Cahill, J. F., Kertesz, V., Van Berkel, G. J. Laser dissection sampling modes for direct mass spectral analysis. Rapid Commun Mass Spectrom. 30 (5), 611-619 (2016).
- Subbian, S., et al. Chronic pulmonary cavitary tuberculosis in rabbits: A failed host immune response. Open Biol. 1 (4), 110016 (2011).
- Zimmerman, M., et al. Ethambutol partitioning in tuberculous pulmonary lesions explains its clinical efficacy. Antimicrob Agents Chemother. 61 (9), (2017).
- Kempker, R. R., et al. Cavitary penetration of levofloxacin among patients with multidrug-resistant tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother. 59 (6), 3149-3155 (2015).
- Zhao, Y., et al. Unraveling drug penetration of echinocandin antifungals at the site of infection in an intra-abdominal abscess model. Antimicrob Agents Chemother. , (2017).
- Pascal, J., et al. Mechanistic modeling identifies drug-uptake history as predictor of tumor drug resistance and nano-carrier-mediated response. ACS Nano. 7 (12), 11174-11182 (2013).
