Summary
At studere DNA skader reparation kinetik kræver et system til at fremkalde læsioner på definerede sub nukleare regioner. Vi beskriver en metode til at oprette lokaliserede dobbelt-strenget pauser ved hjælp af en laser-scanning Konfokal mikroskop udstyret med en 405 nm laser og give automatiserede procedurer for at kvantificere dynamikken i reparation faktorer på disse læsioner.
Abstract
DNA skader svar (DDR) bruger en overflod af proteiner til at registrere, signal og reparere DNA læsioner. Afgrænse denne reaktion er afgørende for at forstå genom vedligeholdelse mekanismer. Da rekruttering og udvekslingen af proteiner på læsioner er meget dynamisk, kræver deres undersøgelse evnen til at generere DNA-skader på en hurtig og rumligt afgrænset måde. Her, beskrive vi procedurer for lokalt inducerer DNA-skader i humane celler ved hjælp af et almindeligt tilgængelige laser-scanning Konfokal mikroskop udstyret med en 405 nm laser linje. Ophobning af genom vedligeholdelse faktorer på laser striber kan vurderes ved immunofluorescens (IF) eller i realtid ved hjælp af proteiner markeret med fluorescerende journalister. Ved hjælp af fosforyleres Histon H2A. X (γ-H2A.X) og replikering Protein A (RPA) som markører, metoden giver nok opløsning til at diskriminere lokalt ansat faktorer fra dem, der spredes på tilstødende kromatin. Vi leverer yderligere ImageJ-baserede scripts til effektivt overvåge kinetik af protein relocalization i DNA skade websteder. Disse justeringer i høj grad forenkle studiet af DDR-dynamics.
Introduction
Celler er konstant udsat for endogene og eksogene kilder af DNA-skader, der truer deres genomisk integritet. DDR er et ensemble af signalering veje, der registrerer, signal og reparere DNA læsioner for at opretholde genom stabilitet. På DNA dobbelt-strenget pauser (DSBs), DDR sker hovedsageligt på to komplementære platforme: γ-H2A.X-mærket kromatin og en resektion enkeltstrenget DNA (ssDNA) region typisk belagt med ssDNA-bindende kompleks RPA1,2.
UV-laser mikro-bestråling af celler pre sensibiliseret med thymidine analoge 5-bromo-2' deoxyuridine (BrdU) eller bisbenzimide ethoxide trihydrochloride (BBET, Hoechst 33342) DNA farve skaber en blanding af DNA læsioner herunder enkelt-strenget pauser ( SSBs) og DSBs, som fremkalder en lokaliseret DDR på både kromatin og ssDNA platforme3,4. Tidligere arbejde viste, at rekruttering af genom vedligeholdelse faktorer til disse to forskellige platforme på DSB kan blive udsat for ved hjælp af høj energi UV-A lasere (335-365 nm) kombineret med IF2,5. Mikroskoper udstyret med disse lasere er dyre, da de kræver en høj energi laser og dedikeret UV-A fremsendende målene gør dem langt mindre udbredt i akademiske og farmaceutiske indstillinger end laser-scanning Konfokal mikroskoper med 405 nm laser linjer. Studiet af protein rekruttering og udvekslingen på mikro-bestrålet websteder er også udelukket af den besværlige manuelle billedanalyse forpligtet til at beskrive den dynamiske opførsel af genom vedligeholdelse faktorer.
Vi viser her, at før sensibilisering af celler med BrdU eller BBET nukleinsyre pletten efterfulgt af mikro-bestråling ved hjælp af en 405 nm laser på et fælles Konfokal mikroskop giver mulighed for overvågning af genom vedligeholdelse faktor dynamics på DNA læsioner. Ved hjælp af γ-H2A.X eller RPA komplekse underenheder som platform markører sammen med z-stacking til større dybdeskarphed og deconvolution for forbedret opløsning tillader eksperimentatoren at diskriminere faktorer, der rekrutteres lokalt til DSBs fra dem, der breder sig til store kromatin domæner omkring den oprindelige læsion. Denne sub klassificering i henhold til særskilte intra nukleare rum hjælper med at forfine de potentielle roller af uncharacterized proteiner rekrutteret til mikro-bestrålet websteder. Desuden, vi leverer praktisk protokoller og optimeret rørledninger for hurtigt at analysere dynamikken i genom vedligeholdelse faktorer ved hjælp af open source software Fiji (en ImageJ distribution)6,7,8. Disse justeringer til nuværende mikro-bestråling metoder flyveregler studiet af DDR i stort set ethvert laboratorium indstilling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. før sensibilisering af celler
- 24 timer før eksperimentet mikro-bestråling frø 40.000 U2OS celler pr. brønd i 1 x DMEM indeholdende 10% FBS i 8-godt kultur dias med 170 µm-tykke coverslip-lignende glas/polymer bunde til at sikre maksimal lystransmission 405 nm laser lys og fremragende billedbehandling inverteret Konfokal mikroskop med en laser-scanning. Hvis brug af en 8-godt microslide, skal du bruge 500 µL af medier eller løsninger pr. brønd for alle efterfølgende behandlinger og vaske trin i protokollen.
Bemærk: På grund af deres flade morfologi, god vedhængning og store kerner, U2OS celler lette påvisning af protein ansættelse på mikro-bestrålet steder men andre vedhængende celletyper kan bruges efter behov. Celler bør ideelt set være omkring 80% confluency på tidspunktet for mikro-bestråling til at øge antallet af bestrålede celler pr. eksperiment. Meget høj sammenløbet kan resultere i cellecyklus ændringer, der kan forurolige specifikke reparation veje som homologt rekombination, som finder sted under S og G2 faserne i cellecyklus9. - Der inkuberes natten over ved 37 ° C med 5% CO2celler, og derefter pre bevidstgøre celler (trin 1.3) BrdU eller (trin 1.4) BBET (Hoechst 33342).
Bemærk: For at observere levende ansættelse af en protein af interesse (POI) til DNA læsioner, transfect eller transduce plasmid DNA transporterer en fusion mellem en fluorescerende proteiner og en POI 24 timer efter celle såning. 24 h post-transfection/transduktion, pre bevidstgøre og mikro-bestråle cellerne for at overvåge ansættelse af POI på DNA skader websteder i realtid. - For at øge antallet af DSBs genereret af redegørelsen til 405 nm laser, tilføje 10 µM af BrdU medier til 24 timer før mikro-bestråling. Mikro-bestråling, ved hjælp af en mikropipette skylles celler to gange med medium uden phenol rød at sikre maksimal eksponering af celler til 405 nm laser.
- Alternativt, behandle celler i 15 min. med BBET på 10 µg/mL i de passende medium i en-cellekultur inkubator ved 37 ° C. Efter behandlingen skylles to gange med medium uden phenol rød før mikro-bestråling.
2. mikro-bestråling af celler
- Vælg en egnet laser-scanning Konfokal mikroskop.
Bemærk: Eksperimenter præsenteres her blev udført på et mikroskop system udstyret med et 50 mW 405 nm laser linje og en 63 X 1,4 numerisk blænde olie mål. For at generere DSBs, celler blev mikro-bestrålet på 1 X scan zoom på 1.024 x 1.024 pixel/felt (0,21 µm/pixel på 63 X forstørrelse) og i envejs tilstand på 8 µs/pixel. Laser power bruges var 25% og 80% for BBET - og BrdU-pre-lysfølsomme celler, henholdsvis. For at hjælpe brugere med at konfigurere deres system, blev laser power efter mål på præsenteres systemet målt ved hjælp af en energimåler ifølge producentens anvisninger. Målingerne svarer til 2,6 mW og 7,0 mW for BBET - og BrdU-pre-lysfølsomme celler, henholdsvis. -
Tænde mikroskopet og miljømæssige kammer.
- Angive salen til 37 ° C med 5% CO2 , før prøverne er placeret i scenen rugemaskinen at undgå unødvendig stress på cellerne og sikre ensartede DDR kinetik på tværs af eksperimenter.
-
Vælg felterne med godt distribueret celler, justere fokus, og registrere deres holdning for at lette billede erhvervelse efter hvis protokollen. Erhverve mindst ét billede, der vil tjene som en pre skader referencepunkt til at overvåge kinetik af protein ansættelse efter mikro-bestråling.
Bemærk: Inddelte kultur fartøjer kan også bruges til at lette lokaliseringen af mikro-bestrålede celler på efterfølgende trin.- Hvis eksperimenter ved hjælp af BBET-mærket celler, den Fokusér på celler ved hjælp af 405 nm laser på den laveste laser power nok til at visualisere cellerne for at undgå uberettigede DNA skader.
- Undgå at bruge widefield fluorescens for at justere fokus på BBET-farvede celler som UV-lys udsendes af lampen vil fremkalde DNA skader på belyste steder.
- Hvis du bruger BrdU-mærket celler, justere fokus ved hjælp af differential interferens kontrast (DIC) eller fasekontrast billeddannelse ved at kigge på sub atomare egenskaber såsom nucleoli.
- Hvis brug af celler, der udtrykker fluorescently mærket POI'er, skal du vælge en brændplanet med repræsentative fluorescens intensitet.
Bemærk: Undgå celler, der udtrykker meget høje niveauer af POI som stærk overekspression kan resultere i kunstig lokalisering. Derudover vælge celler, der udtrykker POI på sammenlignelige niveauer (udvalg af stabil kloner anbefales kraftigt at minimere variationer i POI udtryk og rekruttering niveauer).
- Hvis eksperimenter ved hjælp af BBET-mærket celler, den Fokusér på celler ved hjælp af 405 nm laser på den laveste laser power nok til at visualisere cellerne for at undgå uberettigede DNA skader.
- Konfigurere mikroskop for mikro-bestråling trin ved hjælp af fluorescens-opsving efter photobleaching (FRAP) _module af systemet.
Bemærk: De vigtigste parametre til at overveje, når oprettelse mikroskop system for mikro-bestråling eksperimenter er: 405 nm laser, antallet af gentagelser (dvs. antallet af gange laseren vil gå over de samme koordinater), udgangseffekt antallet af pixels/felt (på 63 X Forstørrelse og 1.024 x 1.024 opløsning, 1 pixel = 0,21 µm), og hviletiden pr. pixel. Alle disse faktorer påvirker mængden energi, at cellerne erfaring og dermed mængden og typen af DNA skade genererede (Se diskussion yderligere dosis optimering oplysninger). - Bruger modulet FRAP mikroskop system, mikro-bestråle cellerne.
Bemærk: På de fleste systemer, mikro-bestråling af flere celler kan udføres i et enkelt felt som pletter eller linjer/rektangler (typisk 1-2 µm bred). Når du udfører live-imaging af fluorescently mærket proteiner umiddelbart efter skade, begrænse mikro-bestråling til et lille antal celler pr. felt, fordi den tid, det tager at mikro-bestråle hver celle vil resultere i en forsinket induktion af DDR. Dette er især vigtigt, når du overvåger proteiner, der rekrutteres meget hurtigt til DNA læsioner. -
Efter mikro-bestråling, sætte tilbage multi godt dias eller plader i en inkubator ved 37 ° C med 5% CO2 for den nødvendige varighed inden forarbejdning prøver for hvis (afsnit 5) eller fortsætte straks med live imaging (afsnit 3).
- Som et første skridt, lave cellerne inden for få minutter og op til et par timer efter bestråling for IF-protokollen. POI, kan rekruttering kinetik variere. Typisk, proteiner, der er kromatin-associerede på DSBs og SSBs vil lokalisere meget hurtigt til læsion og undertiden fjernes inden 5 min. Nogle faktorer som dem, der samler på ssDNA vil blive ansat på senere tidspunkter, når resektion maskiner har været engageret og forblive der i timer (Se figur 1 og reference4).
3. live-billeddannelse af Fluorescently mærket proteiner
- Udføre time-lapse billeddannelse af de mikro-bestrålede celler. For proteiner, der rekrutteres meget hurtigt til læsioner, et par sekunder pr. ramme vil være ideel, men for proteiner, Lokaliser til det beskadigede område senere (fx, resektion faktorer), erhvervelsen kan være udført hver 1-2 min, indtil et plateau nås.
Bemærk: Minimere laser power for image erhvervelse at undgå blegning så meget som muligt og sikre, at protein ansættelse på skade steder ikke nå mætning, som ville udelukke signal kvantificering og efterfølgende analyseres (Se dataanalyse Afsnit 4). På ordningen præsenteres imaging blev gjort med en 63 X / 1.4 olie objektive brug af en 8 µs/pixel hviletid, 1.024 x 1.024 opløsning, 1 X zoom, og gennemsnit af 2. Bemærk, at disse parametre muligvis skal være optimeret til andre systemer og/eller forskellige eksperimenter. - Mikro-bestråle cellerne i flere felter indtil kinetik målinger fås for 15-30 celler. Gentag forsøg på mindst 3 gange i biologiske replikater at sikre nøjagtighed og reproducerbarhed af rekruttering kinetik.
Bemærk: Når tilpasse denne protokol til en specifik Konfokal system, kan det være nyttigt at starte ved at overvåge rekruttering kinetik af en kendt fluorescently mærket genom vedligeholdelsesfaktor (f.eks., 53BP1-normal god landbrugspraksis, RPA32-normal god landbrugspraksis, osv.). Ved hjælp af live-imaging til at optimere mikro-bestråling betingelser vil tillade brugeren at teste flere parametre hurtigt.
4. rekruttering kinetik analyse
- Installere Microirradiation analyse plugin10 i Fiji billede analyse software11.
-
Åbn de erhvervede billeder i Fiji. Vælg "The skader Analyzer" fra menuen pull-down plugins i Microirradiation analyse suite. Følg anvisningerne for at definere en baggrund region af interesse (ROI) (typisk 3 x 3 µm), og ikke-bestrålede og bestrålede ROIs i hver mikro-bestrålet celle.
- Brug ROIs af samme størrelse at minimere potentielle afvigelser i betyde signal intensiteter. For erhvervede billeder, også omfatte mindst én før bestråling ramme, som vil blive brugt som en baseline til at overvåge ansættelse på mikro-bestrålet websteder.
- Når alle ROI data er blevet indsamlet over fuld time-lapse serien, gemme filen skabt af den plugin, som indeholder resultaterne som en csv (kommasepareret fil) eller txt (tabulatorsepareret fil). Denne fil indeholder målinger af den gennemsnitlige intensitet for hvert tidspunkt og hver ROI (betyde intensitet baggrund, mener intensitet ikke bestrålet, og betyde intensitet bestrålede).
Bemærk: Plugin automatisk trækker baggrund intensitet (jegb) fra intensiteten af de bestrålede ROIs (jegs) og ikke-bestrålede ROIs (jegn). Det beregner også forholdet mellem begge værdier (Se nedenstående formel) for at korrigere for photobleaching (Irradiated/ikke-bestrålede).
Plugin beregner også en normalisering mellem det første tidspunkt (værdi sat til 1) og alle de andre tidspunkter for hver kerne (ratio i forhold til første gang punkt). Yderligere oplysninger kan findes på plugin hjemmeside10.
-
Udføre analyse ved hjælp af plugin for alle mikro-bestrålede celler (mindst 15 – 30 celler) og graf den gennemsnitlige relative berigelse på mikro-bestrålede områder over tid. Beregne standard fejl af middelværdien for hver data peger og plot dem.
- Bekræfte forskelle i rekruttering kinetik mellem to eksperimentelle betingelser ved at udføre Student's t-test for hvert datapunkt.
5. Hvis protokollen
-
Forberede hvis løsninger. Forberede pre/post-extraction løsning (iskold 1 x PBS indeholdende 0,25% Triton X-100), vask løsning (1 x PBS indeholdende 0,05% Tween-20), blokerer løsning (1 x PBS der indeholder 3% BSA og 0,05% Tween-20), og fiksation løsning (PARAFORMALDEHYD 3% + saccharose 2% i PBS 1 x) i konisk polypropylen rør.
Bemærk: For en enkelt 8-godt microslide, 10 mL pre/post-extraction opløsning, 50 mL af vask løsning, 10 mL blokerende opløsning og 5 mL af fiksering løsning er påkrævet.- Forberede fiksering løsning.
- Under en kemisk hætte, bland 400 mL dobbeltdestilleret vand (ddH2O) med 15 g af PARAFORMALDEHYD og 30 µL af 10 N NaOH i en 1 liter erlenmeyerkolben.
- Luk container og varme ved 65 ° C på en magnetomrører varmeplade, mens omrøring for at solubilize PARAFORMALDEHYD helt.
- Ved hjælp af en 25-mL pipette, tilsættes 50 mL 10 X PBS, rør og filter ved hjælp af et 0,45 µm filter.
- Der tilsættes 10 g saccharose og til 500 mL med ddH2O.
- Alikvot løsning i 15 mL konisk rør; opbevares ved-20 ° C indtil brug.
- Forberede kerner farvning løsning ved fortynding af en stamopløsning af 1 mg/mL af 4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) 1:1,000 i 1 x PBS.
- Forberede fiksering løsning.
- Med en mikropipette, forsigtigt fjerne medier fra brøndene multi godt mikroskopi dias eller plader og straks vaske med 500 µL af hvis vask løsning ved at ændre løsning to gange uden ventetid.
Bemærk: Hvis oplysningerne her blev opnået med celler dyrket i 8-godt mikroskopi dias, der blev vasket og inkuberes i 500 µL af alle løsninger. Diskenheder skal justeres afhængigt af celle kultur beholdere af eksperimentatorer. Derudover udføre hvis protokollen med ekstrem omhu som celler kan nemt løsne sig fra glas/polymer bunden. Brug en mikropipette til alle ændringer af løsning til at minimere celletab. - Ruger på isen for 5 min med 500 µL af iskold, hvis pre/post-extraction løsning og swirl forsigtigt i hånden for 15 – 30 s til at udføre før udvinding trin der fjerner mest cytoplasmatisk og nucleoplasmic proteiner og maksimerer signalet fra kromatin / DNA-associerede faktorer.
- Vaskes to gange med 500 µL af hvis vask løsning.
- Inkuber i 15 min. ved stuetemperatur i 500 µL af hvis fiksering løsning. Alternativt, brug en pre-made PARAFORMALDEHYD løsning (3-4%) af trinnet fiksering.
- Vaskes to gange med 500 µL af hvis vask løsning.
- Der inkuberes i isbad i 5 min i 500 µL af iskold hvis pre/post-extraction løsning og slyng skub forsigtigt i hånden til at udføre permeabilization trin.
- Vaskes to gange med 500 µL af hvis vask løsning.
- Inkuber mindst 30 min. ved stuetemperatur med 500 µL af hvis blokerende løsning.
- Fjern blokering løsning ved hjælp af en mikropipette og inkuberes natten over i en fugtig kammer ved 4 ° C med 250 µL primære antistoffer fortyndet i blokerende løsning.
Bemærk: Det er god praksis at udføre inkubering med primære antistoffer sekventielt at undgå potentielle artefakter af co lokalisering. Når passende kontrol er udført, samtidig Inkuber primære antistoffer for at fremskynde processen. - Vask fire gange for 5 min med 500 µL af hvis vask løsning med blid agitation (60 rpms på en rotator).
- Inkuber i 1 time ved 37 ° C med 250 µL af sekundære antistoffer fortyndet i blokerende løsning i en fugtig kammer.
Bemærk: Beskytte prøverne fra lys ved tilsætning af fluorescently mærket sekundære antistoffer. - Vask fire gange hver i 5 min i 500 µL af hvis vask løsning med blid agitation.
- Inkuber ved stuetemperatur i 5 min i 500 µL 1 x PBS indeholdende 1 µg/mL DAPI at plette kerner.
- Vaskes to gange med 500 µL 1 x PBS og forlade celler i 500 µL 1 x PBS løsning til billedbehandling.
- Bruger inddelte dias eller registrerede fase positioner, finde de mikro-bestrålede celler ved hjælp af en vel karakteriseret DNA skader markør (fx, γ-H2A.X, RPA32, osv.).
- Image multi godt kultur dias eller plader i alle relevante kanaler ved hjælp af passende indstillinger på en laser-scanning Konfokal mikroskop.
Bemærk: På ordningen præsenteres imaging blev gjort med en 63 X / 1.4 olie objektive brug af en 8 µs/pixel hviletid, 1.024 x 1.024 opløsning, 1 X zoom, og gennemsnit af 2. Bemærk, at disse parametre muligvis skal være optimeret til andre systemer og/eller forskellige eksperimenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter mikro-bestråling, celler er tilladt at inddrive for en bestemt periode afhængigt af arten af genom vedligeholdelse proteiner1,12. DSBs vil blive behandlet af nukleaser, mest udførligt under S og G2 faser i cellecyklus, til at oprette et begrænset område af ssDNA, som er hurtigt belagt af RPA og andre genom vedligeholdelse faktorer9. Denne ssDNA region er omgivet af kromatin, som er grundigt ændret under DDR til at regulere rekruttering og udvekslingen af andre DDR faktorer13. Protein rekruttering til mikro-bestrålede områder kan overvåges af hvis (figur 1A). Typisk, kromatin-associerede faktorer (f.eks., γ-H2A.X, 53BP1, etc.) er påviselige tidligere (1-5 min.) tid point end ssDNA-bundet proteiner, fordi nukleasen-medieret resektion af DSB ender er nødvendige for at generere RPA-ssDNA-platform (≥10 min). For at lette billedanalyse og offentliggørelse, vi har udtænkt en Fiji script (The Outliner)-10 , som automatisk skitserer cellekerner ved hjælp af en DNA dye-associerede kanal (fxDAPI), hvilket gør det lettere at skelne mikro-bestråling striber og enkelte celler ved at forlade ud intetsigende DNA farvning fra de endelige billeder samtidig bevare nukleare definition (figur 1B).
Γ-H2A.X og RPA komplekse underenheder fungere som markører for kromatin - og ssDNA-associerede faktorer, henholdsvis. RPA-ssDNA vises som punktformet foci omgivet af store fluorescerende kromatin striber dekoreret af γ-H2A.X antistof (figur 1 c). Co lokalisering med disse markører kan bruges til at præcist at definere placeringen af genom vedligeholdelse faktorer på DNA læsioner. For eksempel, lokaliserer 53BP1, en kromatin-forbundet protein, som styrer DSB reparation pathway valg, samarbejde godt med γ-H2A.X signal13. Omvendt, PRP19, en E3 ubiquitin ligase, funktioner på RPA-ssDNA til fremme af ATR aktivering og DNA reparation er ansat som punktformet foci, der nøje svarer til RPA32 fordeling14,15,16,17 (Fig. 1 d). Bemærk, nogle faktorer kan også blive ansat på kromatin støder op til de oprindelige læsioner men spredt sig ikke til store områder omkring DSBs som γ-H2A.X og 53BP1. I sådanne tilfælde, disse faktorer ville fremstå som punktformet foci men ville ikke perfekt Co lokalisere med ssDNA-bundet protein.
For levende celle imaging, celler, der udtrykker en POI, mærket med en fluorescerende markør kan være mikro-bestrålet og afbildet i realtid detaljerede for at få meget rekruttering kinetik (figur 2A-C). Flere forskellige proteiner kan observeres samtidig, forudsat at deres fluorescerende etiketter spektralt kan adskilles fra hinanden. For at lette analyse af tidsrækker, har vi lavet to Fiji scripts, der tillader bruger til at producere filmfiler indeholdende tidsserier oplysninger (Movie Maker, se film i figur 2 c som Online supplerende materiale) og kvantificere protein ansættelse på mikro-bestrålet websteder (skader Analyzer)10. I stedet for tidskrævende manuelle billede datasikring normalt kræves til at beskrive opførslen af et protein, guider scriptet skader Analyzer brugeren gennem strømlinede trin, som kontrollerer signal berigelse på mikro-bestrålet websteder, mens automatisk korrigere for celle bevægelse, tid billede drift, baggrund signal og blegning overhovedet point for forsøget. Genereret dataene kan derefter nemt samles i et regnearksprogram og afbildet som nødvendige (figur 2D).
Figur 1: Lokalisering af genom vedligeholdelse faktorer til kromatin og RPA-ssDNA platforme på mikro-bestråling-induceret læsioner. (A) Laser mikro-bestråling i pre overfølsomme over celler fører til produktion af DNA dobbelt-strenget pauser, som er resektion af endo - og exo-nukleaser til at generere ssDNA. SsDNA sub rum kan visualiseres som punktformet foci ved hjælp af antistoffer mod replikering Protein A eller andre ssDNA-lokaliseret faktorer. Derimod vises proteiner eller ændringer, der breder sig til store kromatin domæner som store striber på webstedet mikro-bestrålet svarer til det mønster, der observeres med antistoffer rettet mod fosforyleres Histon variant H2A. X (Γ-H2A.X). (B) celler pre sensibiliseret med BBET eller BrdU var mikro-bestrålet, pre-uddraget, fast og farvede for de angivne proteiner. 12-bit billeder blev indsamlet på 1 X zoom og behandlet ved hjælp af scriptet Outliner Fiji. (C) Z-stabling af BBET eller BrdU pre overfølsomme over celler giver løsningen af ssDNA - og kromatin-associerede faktorer (maksimal intensitet Z-projektionen er vist). (D) ved hjælp af denne metode, 53BP1 og PRP19 kan klassificeres som kromatin - og ssDNA-associerede genom vedligeholdelse faktorer, henholdsvis. Skalere barer = 10 µm; billeder i D er alle på den samme skala. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Live-imaging af RPA komplekse rekruttering til websteder af DNA-skader. (A) stabil eller forbigående Transfektion af plasmider kodning kandidat proteiner markeret med fluorescerende reportere efterfulgt af mikro-bestråling af transfekteret celler giver mulighed for overvågning af protein rekruttering til DNA læsioner i realtid. (B) celler var transfekteret med en pDEST47-RPA32-NGL plasmid og mængden 24 timer senere. Protein udtryk blev bekræftet af immunoblotting. (C) celler transfekteret med pDEST-SFB EGFP eller pDEST47 RPA32-NGL plasmider pre sensibiliseret med BrdU var mikro-bestrålet og afbildet på 12-bit på 1 X zoome en gang pr. minut efter bestråling. Timing er i minutter efter bestråling. 00:00 tiden punkt billede blev taget før mikro-bestråling. Film-filer er oprettet ved hjælp af Movie Maker Fiji script og klippunkter er vist. Skalere barer = 10 µm. (D) rekruttering af RPA32-NGL til mikro-bestråling striber var kvantitativt overvåges ved hjælp af scriptet skader Analyzer Fiji. Outputdataene var afbildet ved hjælp af Microsoft Excel. Den sorte linje er den gennemsnitlige berigelse-fold af RPA32-normal god landbrugspraksis på mikro-bestrålet sites i forhold til før bestråling signal og fejllinjer repræsenterer standardafvigelsen på middelværdien af 15 uafhængigt mikro-bestrålede celler. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Movie 1: Micro-bestråling time-lapse af SFB-normal god landbrugspraksis udtrykker celler. Celler forbigående transfekteret med en pDEST-SFB normal god landbrugspraksis plasmid var pre overfølsomme over 24 timer med BrdU, mikro-bestrålet, og afbildet en gang i minuttet i 29 min. venligst klik her for at downloade denne film.
Movie 2: Micro-bestråling time-lapse af RPA32-NGL udtrykker celler. Celler forbigående transfekteret med en pDEST47 RPA32-NGL plasmid var pre overfølsomme over 24 timer med BrdU, mikro-bestrålet, og afbildet en gang i minuttet i 29 min. venligst klik her for at downloade denne film.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ved hjælp af de metoder, der er skitseret ovenfor, tillader 405 nm laser mikro-bestråling af celler pre sensibiliseret med BBET eller BrdU den lokaliserede generation af DNA læsioner herunder DSBs inden for kerner af vedhængende humane celler. Kinetik af DDR på disse DSBs er lig dem genereret med andre metoder i eukaryote celler9,18,19. DSB resektion på mikro-bestrålet websteder fører til ssDNA-generation, som kan følges ved hjælp af en RPA32-targeting antistof eller en RPA32-NGL fusion. Kromatin-associerede faktorer, på den anden side kan være placeret ved hjælp af γ-H2A.X som reference. Nogle kromatin-associerede faktorer kan ikke spredes fra den oprindelige DSB så meget som γ-H2A.X og vil fremstå som punktformet foci, der kan være forskellige fra ssDNA-bindende proteiner foci.
Når DSBs genereres, kan protein rekruttering og clearance fra skade websteder overvåges af hvis på faste celler. Udfører disse eksperimenter kræver kun en egnet hvis antistof mod POI. Hvis IF-kompatible antistoffer er ikke tilgængelig, plasmider kan blive manipuleret bærer gener af interesse i ramme med specifikke epitoper (f.eks.: FLAG, hans-tag) eller fluorescerende proteiner. Forbigående eller stabil Transfektion/transduktion af disse plasmider vedhængende celler kan derefter bruges til at bestemme, om en bestemt faktor aktivt rekrutteret til beskadiget DNA. Overekspression af proteiner kan medføre mis lokalisering og kunstigt kan øge deres rekruttering til mikro-bestrålet striber. For at opnå resultater, der er mere repræsentativ for endogene proteiner, kan CRISPR-Cas9 teknologi nu bruges rutinemæssigt til at mærke nogen gen af interesse med passende epitoper20,21.
Python scripts i mikro-bestråling analyse Fiji Plugin lette visualisering, præsentation, offentliggørelse og analyse af DDR proteiner kinetik. Denne analyse pakken er open source og funktioner uanset mikroskop platformen bruges til at udføre mikro-bestråling eksperimenter og image erhvervelse. Alt, der kræves er, at billeder taget mikroskopi platform gemmes som Bio-formater kompatibel filer22. Siden baggrund, drifting, og blegning rettelser udføres automatisk, analyse af protein niveauer på DNA skader websteder med de medfølgende scripts er ligetil og meget hurtigt sammenlignet med den typiske manuel signal kvantificering udføres med mikroskop billede erhvervelse software.
Som beskrevet i protokollen, brugere omhyggeligt skal konfigurere deres respektive laser-scanning Konfokal mikroskop systemer for at opnå en passende mængde af skader og fremkalde DSBs, der følger normale DDR kinetik. Ja, mængde og type af DNA læsioner genereret af mikro-bestråling afhænger på laser bølgelængde og dosis og på pre sensibilisering metoder. Brugernes savn hen til huske at selv om DSBs genereres af de betingelser, der er beskrevet her, 405 nm laser mikro-bestråling af photosensitized celler vil også generere en blanding af andre DNA læsioner, herunder cyclopyrimidine dimerer (CPDs), SSBs, og oxideret baser, der varierer mellem mikroskop systemer og indstillinger23,24,25. Således, en omhyggelig overvågning af læsioner på mikro-bestrålet websteder skal udføres for at opnå et samlet billede af de skader, der er genereret og den reaktion fremkaldt. Vigtigere, for at studere svar på DSBs, bør hver mikroskop system optimeres ved at overvåge kinetik af canonical DNA skader proteiner og posttranslationelle modifikationer på mikro-bestrålet websteder. For eksempel, γ-H2A.X og RPA komplekse subunits (RPA70, RPA32 eller RPA14) kan bruges hurtigt og bekvemt som de er ganske let at opdage ophobes på DSBs. Som en tommelfingerregel, γ-H2A.X signal skal visualiseres som striber på tidlige (5 min) og sent (op til 3-4 h) tid peger efter skade paa RPA bør begynde at akkumulere som punktformet foci ca 10-15 min post-micro-bestråling. Hvis en pan-nukleare γ-H2A.X signal er observeret, mængden af energi modtaget af celler er ikke-fysiologisk og vil resultere i hurtig celledød.
Der er visse begrænsninger, der skal overvejes, når du bruger en 405 nm laser til undersøgelse af specifikke DNA reparation veje. For eksempel, selv om BBET-405 nm kombination let producerer en kombination af SSBs og DSBs, det generere ikke 6-4 photoproducts (6-4 KKS) og kinetik for rekruttering af nukleotid excision reparation proteiner er derfor anderledes end de observeret ved hjælp af UV-C mikro-bestråling. Kinetik og omfanget af ansættelse af forskellige proteiner involveret i reaktion på DSBs kan også variere alt efter DNA skader metode, der er ved at blive anvendte23. På grund af disse variationer anbefales det, at brugere tilpasse deres systemer for at maksimere typen læsioner, der potentielt kan genkendes af deres POI'er. Selv om sådanne systemer er mindre bredt tilgængelige, ved hjælp af andre typer af lasere herunder UV-A (337-355 nm) eller femtosekund nær-infrarødt (800 nm) sammen med forskellige sensibilisering reagenser (f.eks.: tri-methyl psoralen) kan tillade brugere at generere mere specifikke DNA læsioner afhængigt af DNA reparation veje under undersøgelse24,26.
Når nye betingelser er ved at blive testet, er det praktisk at bruge fluorescently mærket veletablerede DNA reparation proteiner, at test-doser, bølgelængder og pre sensibilisator kombinationer og sikre at læsion af interesse genereres effektivt. For eksempel, PARP1 og XRCC1 kan fungere som markører for SSB og base-excision reparation, XPA er en god indikator for nukleotid excision reparation, og 53BP1 vil blive rekrutteret til DSBs og funktion i ikke-homologe ende-sammenføjning (referencer23,25 ,27,28). Antistoffer, der genkender ændringer forbundet med bestemte typer af DNA-skader kan også bruges til at kvantificere niveauerne af DNA adukter eller pauser. Det er således muligt at overvåge oxideret baser, cyclopyrimidine dimerer, 6-4 KKS, SSBs (ved hjælp af poly-ADP ribose antistof) og DSBs (γ-H2A.X og 53BP1) af hvis og fastlægge de parametre, der vil nå det højeste niveau af ønskede læsioner23, 27 , 29. med omhyggelig overvågning, skal brugerne kunne studere deres reparation pathway af interesse ved hjælp af mikro-bestråling.
Helt, brug af udbredt laser-scanning Konfokal mikroskoper udstyret med 405 nm laser linjer til at generere lokaliserede DSBs, kombineret med platform-specifikke DNA skader markører til sub klassificere genom vedligeholdelse faktorer og strømlinet data behandling ved hjælp af mikro-bestråling analyse Fiji plugin, bør gøre studiet af DDR faktorer dynamics mere tilgængelig end nogensinde før for både erfarne og nybegyndere efterforskere af feltet genom vedligeholdelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada [Discovery grant 5026 til A.M] og af en næste Generation af forskere stipendium fra Cancer Research Society [21531 til A.M]. Vi takke Jean-François Lucier for at levere fremragende kvalitetskontrol af Fiji Python scripts og rådgivning på statistisk analyse. Vi takker Dr. Stephanie A. Yazinski for hvis fiksering løsning opskrift. Vi takke Paul-Ludovic Karsenti for hjælp med laser power målinger.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Olympus FLUOVIEW FV3000 resonant laser scanning confocal microscope | Olympus | ||
| FluoView FV3000 software (version 2.1) | Olympus | ||
| 405 nm laser | Coherent | Radiation source | |
| Microscope incubator AIO-UNO-OLYUS-1 | Okolab | OKO-UNO-1 | |
| 60X /1.4 Objective | Olympus | Oil immersion objective | |
| 8-well culture slides on coverglass (X-well) | Sarstedt | 94.6190.802 | |
| U2OS osteosarcoma human cell line | ATCC | HTB-96 | Stable cell lines |
| 4’,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) | ThermoFisher | D1306 | Caution toxic |
| 5-bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) | Sigma-Aldrich | 59-14-3 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 30525-89-4 | Caution toxic |
| Bisbenzimide H 33342 (Hoechst 33342) | ThermoFisher | 62249 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | ThermoFisher | BP1600-100 | |
| Trypsin EDTA 0.1% | ThermoFisher | 15400-054 | |
| Triton X-100 | BioShop | TRX777.100 | |
| Tween-20 | ThermoFisher | BP337-500 | |
| Sucrose | BioShop | SUC507 | |
| JetPRIME transfection reagent | Polyplus | 114-07 | |
| ProLong Diamond Antifade mountant with DAPI | ThermoFisher | P36962 | |
| DMEM 1X, + phenol red | Wisent | 319-005-CL | |
| DMEM 1X, - phenol red | Wisent | 319-051-CL | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Wisent | 080-150 | |
| Mouse anti-RPA32 antibody | Abcam | ab2175 | 1:500 for IF |
| Rabbit anti-γ-H2A.X antibody | Cell Signaling | 9718S | 1:500 for IF |
| Rabbit Anti-53BP1 antibody | Cell Signaling | 4937S | 1:500 for IF |
| Rabbit Anti-PRP19 antibody | Abcam | ab27692 | 1:500 for IF |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 647 | Cell Signaling | 4414S | 1:250 for IF |
| Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 488 | Cell Signaling | 4408S | 1:250 for IF |
| Fiji image analysis open-source software | https://fiji.sc | ||
| 1918-K Power meter with a 918D-SL-0D3 sensor | Newport |
References
- Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA damage response: making it safe to play with knives. Molecular cell. 40 (2), 179-204 (2010).
- Bekker-Jensen, S., et al. Spatial organization of the mammalian genome surveillance machinery in response to DNA strand breaks. The Journal of Cell Biology. 173 (2), 195-206 (2006).
- Limoli, A. C. L., Ward, J. F., May, N. A New Method for Introducing Double-Strand Breaks into Cellular DNA. Radiation Research. 134 (2), 160-169 (1993).
- Polo, S. E., Jackson, S. P. Dynamics of DNA damage response proteins at DNA breaks: a focus on protein modifications. Genes & development. 25 (5), 409-433 (2011).
- Lukas, C., Falck, J., Bartkova, J., Bartek, J., Lukas, J. Distinct spatiotemporal dynamics of mammalian checkpoint regulators induced by DNA damage. Nature cell biology. 5 (3), 255-260 (2003).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Collins, T. J.
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Symington, L. S., Gautier, J. Double-strand break end resection and repair pathway choice. Annual review of genetics. 45, 247-271 (2011).
- Garneau, D., Maréchal, A. Microirradiation Analysis Fiji Plugin. , Available from: https://bitbucket.org/daniel_garneau/microirradiation_analysis/ (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Izhar, L., et al. A Systematic Analysis of Factors Localized to Damaged Chromatin Reveals PARP-Dependent Recruitment of Transcription Factors. Cell Reports. 11 (9), 1-15 (2015).
- Panier, S., Boulton, S. J. Double-strand break repair: 53BP1 comes into focus. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (1), 7-18 (2013).
- Maréchal, A., et al. PRP19 Transforms into a Sensor of RPA-ssDNA after DNA Damage and Drives ATR Activation via a Ubiquitin-Mediated Circuitry. Molecular Cell. 53 (2), 235-246 (2014).
- Dubois, J. -C., et al. A phosphorylation-and-ubiquitylation circuitry driving ATR activation and homologous recombination. Nucleic Acids Research. 45 (15), 8859-8872 (2017).
- Wan, L., Huang, J. The PSO4 Complex Associates with RPA and Modulates the Activation of ATR. The Journal of Biological Chemistry. 289 (10), 6619-6626 (2014).
- Abbas, M., Shanmugam, I., Bsaili, M., Hromas, R., Shaheen, M. The role of the human Psoralen 4 (hPso4) complex in replication stress and homologous recombination. The Journal of Biological Chemistry. 289 (20), 14009-14019 (2014).
- Chung, W. H., Zhu, Z., Papusha, A., Malkova, A., Ira, G. Defective resection at DNA double-strand breaks leads to de novo telomere formation and enhances gene targeting. PLoS Genetics. 6 (5), (2010).
- Hicks, W. W. M., Yamaguchi, M., Haber, J. E. Real-time analysis of double-strand DNA break repair by homologous recombination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (8), 3108-3115 (2011).
- Lackner, D. H., et al. A generic strategy for CRISPR-Cas9-mediated gene tagging. Nature Communications. 6, 10237 (2015).
- Ratz, M., Testa, I., Hell, S. W., Jakobs, S. CRISPR/Cas9-mediated endogenous protein tagging for RESOLFT super-resolution microscopy of living human cells. Scientific Reports. 5 (9592), (2015).
- Linkert, M., et al. Metadata matters: Access to image data in the real world. Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
- Dinant, C., et al. Activation of multiple DNA repair pathways by sub-nuclear damage induction methods. Journal of Cell Science. 120 (15), 2731-2740 (2007).
- Kong, X., et al. Comparative analysis of different laser systems to study cellular responses to DNA damage in mammalian cells. Nucleic Acids Research. 37 (9), e68 (2009).
- Holton, N. W., Andrews, J. F., Gassman, N. R. Application of Laser Micro-irradiation for Examination of Single and Double Strand Break Repair in Mammalian Cells. Journal of Visualized Experiments. (127), (2017).
- Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Indig, F. E., Seidman, M. M. Psoralen conjugates for visualization of genomic interstrand cross-links localized by laser photoactivation. Bioconjugate Chemistry. 18 (2), 431-437 (2007).
- Mortusewicz, O., Amé, J. C., Schreiber, V., Leonhardt, H. Feedback-regulated poly(ADP-ribosyl)ation by PARP-1 is required for rapid response to DNA damage in living cells. Nucleic Acids Research. 35 (22), 7665-7675 (2007).
- Kleiner, R. E., Verma, P., Molloy, K. R., Chait, B. T., Kapoor, T. M. Chemical proteomics reveals a γH2AX-53BP1 interaction in the DNA damage response. Nature Chemical Biology. 11 (10), 807-814 (2015).
- Soultanakis, R. P., et al. Fluorescence detection of 8-oxoguanine in nuclear and mitochondrial DNA of cultured cells using a recombinant Fab and confocal scanning laser microscopy. Free Radical Biology and Medicine. 28 (6), 987-998 (2000).
