Stomata टेप-पील: गार्ड सेल नमूना तैयारी के लिए एक बेहतर विधि
Summary
इस प्रोटोकॉल समृद्ध stomatal गार्ड कोशिकाओं है कि शारीरिक और अंय जैविक अध्ययन के लिए उपयोगी है की तैयारी की एक विधि का वर्णन ।
Abstract
गार्ड कोशिकाओं के अध्ययन के पौधों के समग्र समारोह के लिए इस सेल प्रकार के विशिष्ट योगदान के ज्ञान के लिए आवश्यक है । हालांकि, यह अक्सर अलग और इस तरह उंहें अध्ययन अक्सर एक चुनौती प्रदान करता है मुश्किल है ।
यह अध्ययन एक stomatal गार्ड सेल संवर्धन विधि स्थापित करता है । प्रोटोकॉल स्कॉच टेप गार्ड कोशिकाओं को अलग और कोशिकाओं से प्रोटीन निकालने के लिए इस्तेमाल करता है । इस विधि की अखंडता और अलगाव के दौरान गार्ड सेल की उपज में सुधार और सेल सिग्नलिंग प्रक्रियाओं के अध्ययन के लिए एक विश्वसनीय नमूना प्रदान करता है और कैसे वे stomatal आंदोलन phenotypes को सहसंबंधी बनाना. इस विधि में, संयंत्र पत्तियों टेप के दो भागों के बीच विभाजित किया गया था और अलग छील abaxial पक्ष को दूर करने के लिए । इस प्रोटोकॉल Arabidopsis पत्ती ऊतक करने के लिए गार्ड कोशिकाओं को अलग करने के लिए लागू किया गया था । कोशिकाओं fluorescein diacetate (एफडीए) के साथ व्यवहार्यता का निर्धारण करने के लिए और abscisic एसिड (आबा) के साथ stomata आंदोलन का आकलन करने के लिए आबा के जवाब में इलाज किया गया. अंत में, इस प्रोटोकॉल समृद्ध stomatal गार्ड कोशिकाओं और अलग प्रोटीन की तैयारी के लिए उपयोगी साबित होता है । यहां प्राप्त कोशिकाओं और प्रोटीन की गुणवत्ता शारीरिक और अंय जैविक अध्ययन सक्षम करें ।
Introduction
Stomata समग्र शरीर क्रिया विज्ञान और पौधों की फिटनेस में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । इन छोटे संयंत्र विशिष्ट संरचनाओं दो विशेष एपिडर्मल गार्ड कोशिकाओं के रूप में जाना जाता कोशिकाओं द्वारा गठित कर रहे है और पत्तियों की abaxial सतह पर सबसे प्रचुर मात्रा में पाया जाता है । पौधे और वातावरण के बीच gasses के आदान-प्रदान के लिए Stomata आवश्यक हैं, साथ ही transpiration के माध्यम से पानी के नुकसान पर नियंत्रण भी किया जा सके । गार्ड कोशिकाओं अलग बाहरी (जैसे, प्रकाश, आर्द्रता, रोगज़नक़ संपर्क, कार्बन डाइऑक्साइड का स्तर) और आंतरिक (जैसे, अंतर्जात हार्मोन) उत्तेजनाओं1,2के एकीकरण के माध्यम से stomata एपर्चर विनियमित । पिछले 20 वर्षों में, इस सेल प्रकार के पौधों में सेल सिग्नलिंग प्रक्रियाओं के अध्ययन के लिए एक मॉडल प्रणाली बन गया है । इन कोशिकाओं को एक पत्ती में कुल कोशिकाओं का एक छोटा सा अंश बना; इस प्रकार, एक एकल सेल तरीके से उनके अद्वितीय सेलुलर, जैव रासायनिक और आणविक संपत्तियों की जांच करने के लिए, यह अन्य पत्ती कोशिका प्रकार से उन्हें अलग करने के लिए आवश्यक है. अतीत में, गार्ड सेल अध्ययन अक्सर गार्ड सेल protoplasts (जीसीपी)3,4,5की तैयारी शामिल है । यह आम तौर पर सेल की बड़ी मात्रा में उपयोग की आवश्यकता है दीवार अपमानजनक एंजाइमों और या सम्मिश्रण के माध्यम से यांत्रिक व्यवधान और महंगा और समय लेने वाली साबित हो गया है क्योंकि यह आम तौर पर कई घंटे लगते है एक जीसीपी नमूना तैयार करने के लिए अक्सर छोटी उपज के साथ बार । इससे भी महत्वपूर्ण बात, क्योंकि गार्ड कोशिकाओं stomata एपर्चर को विनियमित करने के लिए पूरा जोड़े के रूप में कार्य, जीसीपी के उपयोग के गार्ड सेल संकेत का अध्ययन करने के लिए एक कृत्रिम प्रणाली के रूप में देखा जा सकता है ।
यहां, हम एक विधि stomata जिसमें बरकरार रक्षक कोशिकाओं को समृद्ध कर रहे है और उत्तेजनाओं के लिए शारीरिक प्रतिक्रियाओं को बनाए रखने तैयार है विकसित किया है । यह विधि mesophyll सेल protoplasts6,7को अलग करने के लिए उपयोग किया गया था एक विधि से प्रेरित था । हमारे विधि में, stomata स्पष्ट स्कॉच टेप का उपयोग करने के लिए पहले फुटपाथ और रक्षक कोशिकाओं युक्त abaxial परत से पत्ती की adaxial परत से जुड़ी mesophyll कोशिकाओं के बहुमत को अलग करने के लिए तैयार कर रहे हैं । इस पत्ती के प्रत्येक पक्ष को टेप का एक टुकड़ा चिपका और उंहें छीलने के अलावा द्वारा किया जाता है । abaxial परत से कोशिकाओं को एक stomata खोलने बफर में प्रकाश के तहत पुनर्प्राप्त करने के लिए अनुमति दी जाती है । बाद में शेष फुटपाथ कोशिकाओं सेल दीवार अपमानजनक एंजाइमों की एक छोटी मात्रा का उपयोग कर हटा रहे हैं, गार्ड सेल है कि टेप पर समृद्ध कर रहे है पीछे छोड़ ।
इस सरल विधि में, stomatal गार्ड कोशिकाओं है कि दोनों व्यवहार्य और उत्तरदायी जल्दी और कुशलता से तैयार किया जा सकता है, कम लागत के साथ ५० छिलके से समृद्ध stomatal गार्ड कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए एक घंटे से भी अधिक ले । यहां विधि पिछले तरीकों जहां protoplasts तैयार कर रहे है की तुलना में संयंत्र कोशिकाओं को कम नुकसान लगाता है । इसके अलावा, इस विधि से एकत्र सामग्री वांछनीय प्रोटीन मात्रा उपज । सबसे महत्वपूर्ण बात, क्योंकि पत्ती सम्मिश्रण या लंबी पाचन बार और गार्ड कोशिकाओं के अधीन नहीं है बरकरार रहेगा, अध्ययन के परिणाम और अधिक बारीकी से एक गार्ड है सेल प्राकृतिक जीव विज्ञान के लिए प्रासंगिक हो जाएगा । इस विधि के साथ, stomatal आंदोलनों आणविक स्तर पर परिवर्तन के साथ वास्तविक समय में संबद्ध किया जा सकता है । इस प्रकार, ज्ञान इस तैयारी विधि का उपयोग कर अध्ययन से प्राप्त गार्ड सेल संकेत के एक अधिक व्यापक समझ के लिए महत्वपूर्ण होगा ।
हम एक मॉडल के रूप में संयंत्र Arabidopsis थालियाना इस्तेमाल किया; हालांकि इस प्रोटोकॉल पाचन समय में छोटे संशोधनों के साथ Brassica napus के रूप में अंय संयंत्र प्रजातियों में stomatal गार्ड कोशिकाओं के संवर्धन के लिए लागू किया जा सकता है । अवधारणा का एक सबूत के रूप में, हमने दिखाया है कि stomatal गार्ड कोशिकाओं को इस पद्धति के माध्यम से समृद्ध कर रहे है व्यवहार्य है और fluorescein diacetate (एफडीए) परख और संयंत्र हार्मोन abscisic एसिड (आबा), क्रमशः का उपयोग अध्ययन द्वारा दिखाए गए के रूप में उत्तेजनाओं को उत्तरदायी । इसके अलावा, हम प्रदर्शन किया है कि उच्च गुणवत्ता वाले प्रोटीन इन गार्ड कोशिकाओं से अलग किया जा सकता है । यहां, हम इस प्रक्रिया का एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन ।
Protocol
Representative Results
Discussion
गार्ड कोशिकाओं पौधों में सिग्नल transduction तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल प्रणाली है और यह सुनिश्चित करने के लिए कि अध्ययन में इस्तेमाल किया नमूनों की तैयारी जैविक सवालों का जवाब देने के लिए सबसे उपयुक?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम वीडियो संपादन में सहायता के लिए Buchholz हाई स्कूल के डिजिटल वीडियो उत्पादन टीम से डैनियल चेन धंयवाद । चेन लैब में stomatal गार्ड कोशिकाओं, प्रोटियोमिक् और metabolomics पर इस शोध को यूएस नेशनल साइंस फाउंडेशन (०८१८०५१, ११५८००० और १४१२५४७) से अनुदान का समर्थन मिला है । Wenwen कांग चीन छात्रवृत्ति परिषद द्वारा समर्थित है । Dr. Qiuying वेदना चीन छात्रवृत्ति परिषद और राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन द्वारा समर्थित है चीन (३१५७०३९६) ।
Materials
| Stainless Steel Surgical Scalpel | Feather | NC9999403 | |
| Scotch Tape (3M) | ULINE | S-9781 | |
| Petri Dish | Sigma-Aldrich | BR455701 | |
| Cellulase (Onozuka R-10) | Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd. | 21560003-3 | |
| Macerozyme R-10 | Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd. | 21560003-4 | |
| DM6000B Microscope | Leica Microsystems | ||
| Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktails | Thermo Fisher Scientific | PI78443 | |
| Oak Ridge High-Speed PPCO Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 3119-0030 | |
| EZQ Protein Quantitation Kit | Thermo Fisher Scientific | R33200 | |
| Fluorescein Diacetate (FDA) | Thermo Fisher Scientific | F1303 | |
| Abscisic Acid | Sigma-Aldrich | A4906 | |
| Metro Mix 500 | BWI Companies | TX-500 | |
| Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 161-0737 | |
| Bio-Safe Comassie (G-250) | Bio-Rad | 161-0786 | |
| Microcentrifuge Tube (2mL) | USA Scientific, Inc. | 1620-2700 | |
| ImageJ software | National Institute of Health | ||
| Tweezers | Sigma-Aldrich | F4017-1EA | |
| 12% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel | Bio-Rad | 456-1043 | |
| Microscope slides | Fisherbrand | 12-550-A3 |
References
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