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Biology

Stomata टेप-पील: गार्ड सेल नमूना तैयारी के लिए एक बेहतर विधि

doi: 10.3791/57422 Published: July 15, 2018

Summary

इस प्रोटोकॉल समृद्ध stomatal गार्ड कोशिकाओं है कि शारीरिक और अंय जैविक अध्ययन के लिए उपयोगी है की तैयारी की एक विधि का वर्णन ।

Abstract

गार्ड कोशिकाओं के अध्ययन के पौधों के समग्र समारोह के लिए इस सेल प्रकार के विशिष्ट योगदान के ज्ञान के लिए आवश्यक है । हालांकि, यह अक्सर अलग और इस तरह उंहें अध्ययन अक्सर एक चुनौती प्रदान करता है मुश्किल है ।

यह अध्ययन एक stomatal गार्ड सेल संवर्धन विधि स्थापित करता है । प्रोटोकॉल स्कॉच टेप गार्ड कोशिकाओं को अलग और कोशिकाओं से प्रोटीन निकालने के लिए इस्तेमाल करता है । इस विधि की अखंडता और अलगाव के दौरान गार्ड सेल की उपज में सुधार और सेल सिग्नलिंग प्रक्रियाओं के अध्ययन के लिए एक विश्वसनीय नमूना प्रदान करता है और कैसे वे stomatal आंदोलन phenotypes को सहसंबंधी बनाना. इस विधि में, संयंत्र पत्तियों टेप के दो भागों के बीच विभाजित किया गया था और अलग छील abaxial पक्ष को दूर करने के लिए । इस प्रोटोकॉल Arabidopsis पत्ती ऊतक करने के लिए गार्ड कोशिकाओं को अलग करने के लिए लागू किया गया था । कोशिकाओं fluorescein diacetate (एफडीए) के साथ व्यवहार्यता का निर्धारण करने के लिए और abscisic एसिड (आबा) के साथ stomata आंदोलन का आकलन करने के लिए आबा के जवाब में इलाज किया गया. अंत में, इस प्रोटोकॉल समृद्ध stomatal गार्ड कोशिकाओं और अलग प्रोटीन की तैयारी के लिए उपयोगी साबित होता है । यहां प्राप्त कोशिकाओं और प्रोटीन की गुणवत्ता शारीरिक और अंय जैविक अध्ययन सक्षम करें ।

Introduction

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Stomata समग्र शरीर क्रिया विज्ञान और पौधों की फिटनेस में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । इन छोटे संयंत्र विशिष्ट संरचनाओं दो विशेष एपिडर्मल गार्ड कोशिकाओं के रूप में जाना जाता कोशिकाओं द्वारा गठित कर रहे है और पत्तियों की abaxial सतह पर सबसे प्रचुर मात्रा में पाया जाता है । पौधे और वातावरण के बीच gasses के आदान-प्रदान के लिए Stomata आवश्यक हैं, साथ ही transpiration के माध्यम से पानी के नुकसान पर नियंत्रण भी किया जा सके । गार्ड कोशिकाओं अलग बाहरी (जैसे, प्रकाश, आर्द्रता, रोगज़नक़ संपर्क, कार्बन डाइऑक्साइड का स्तर) और आंतरिक (जैसे, अंतर्जात हार्मोन) उत्तेजनाओं1,2के एकीकरण के माध्यम से stomata एपर्चर विनियमित । पिछले 20 वर्षों में, इस सेल प्रकार के पौधों में सेल सिग्नलिंग प्रक्रियाओं के अध्ययन के लिए एक मॉडल प्रणाली बन गया है । इन कोशिकाओं को एक पत्ती में कुल कोशिकाओं का एक छोटा सा अंश बना; इस प्रकार, एक एकल सेल तरीके से उनके अद्वितीय सेलुलर, जैव रासायनिक और आणविक संपत्तियों की जांच करने के लिए, यह अन्य पत्ती कोशिका प्रकार से उन्हें अलग करने के लिए आवश्यक है. अतीत में, गार्ड सेल अध्ययन अक्सर गार्ड सेल protoplasts (जीसीपी)3,4,5की तैयारी शामिल है । यह आम तौर पर सेल की बड़ी मात्रा में उपयोग की आवश्यकता है दीवार अपमानजनक एंजाइमों और या सम्मिश्रण के माध्यम से यांत्रिक व्यवधान और महंगा और समय लेने वाली साबित हो गया है क्योंकि यह आम तौर पर कई घंटे लगते है एक जीसीपी नमूना तैयार करने के लिए अक्सर छोटी उपज के साथ बार । इससे भी महत्वपूर्ण बात, क्योंकि गार्ड कोशिकाओं stomata एपर्चर को विनियमित करने के लिए पूरा जोड़े के रूप में कार्य, जीसीपी के उपयोग के गार्ड सेल संकेत का अध्ययन करने के लिए एक कृत्रिम प्रणाली के रूप में देखा जा सकता है ।

यहां, हम एक विधि stomata जिसमें बरकरार रक्षक कोशिकाओं को समृद्ध कर रहे है और उत्तेजनाओं के लिए शारीरिक प्रतिक्रियाओं को बनाए रखने तैयार है विकसित किया है । यह विधि mesophyll सेल protoplasts6,7को अलग करने के लिए उपयोग किया गया था एक विधि से प्रेरित था । हमारे विधि में, stomata स्पष्ट स्कॉच टेप का उपयोग करने के लिए पहले फुटपाथ और रक्षक कोशिकाओं युक्त abaxial परत से पत्ती की adaxial परत से जुड़ी mesophyll कोशिकाओं के बहुमत को अलग करने के लिए तैयार कर रहे हैं । इस पत्ती के प्रत्येक पक्ष को टेप का एक टुकड़ा चिपका और उंहें छीलने के अलावा द्वारा किया जाता है । abaxial परत से कोशिकाओं को एक stomata खोलने बफर में प्रकाश के तहत पुनर्प्राप्त करने के लिए अनुमति दी जाती है । बाद में शेष फुटपाथ कोशिकाओं सेल दीवार अपमानजनक एंजाइमों की एक छोटी मात्रा का उपयोग कर हटा रहे हैं, गार्ड सेल है कि टेप पर समृद्ध कर रहे है पीछे छोड़ ।

इस सरल विधि में, stomatal गार्ड कोशिकाओं है कि दोनों व्यवहार्य और उत्तरदायी जल्दी और कुशलता से तैयार किया जा सकता है, कम लागत के साथ ५० छिलके से समृद्ध stomatal गार्ड कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए एक घंटे से भी अधिक ले । यहां विधि पिछले तरीकों जहां protoplasts तैयार कर रहे है की तुलना में संयंत्र कोशिकाओं को कम नुकसान लगाता है । इसके अलावा, इस विधि से एकत्र सामग्री वांछनीय प्रोटीन मात्रा उपज । सबसे महत्वपूर्ण बात, क्योंकि पत्ती सम्मिश्रण या लंबी पाचन बार और गार्ड कोशिकाओं के अधीन नहीं है बरकरार रहेगा, अध्ययन के परिणाम और अधिक बारीकी से एक गार्ड है सेल प्राकृतिक जीव विज्ञान के लिए प्रासंगिक हो जाएगा । इस विधि के साथ, stomatal आंदोलनों आणविक स्तर पर परिवर्तन के साथ वास्तविक समय में संबद्ध किया जा सकता है । इस प्रकार, ज्ञान इस तैयारी विधि का उपयोग कर अध्ययन से प्राप्त गार्ड सेल संकेत के एक अधिक व्यापक समझ के लिए महत्वपूर्ण होगा ।

हम एक मॉडल के रूप में संयंत्र Arabidopsis थालियाना इस्तेमाल किया; हालांकि इस प्रोटोकॉल पाचन समय में छोटे संशोधनों के साथ Brassica napus के रूप में अंय संयंत्र प्रजातियों में stomatal गार्ड कोशिकाओं के संवर्धन के लिए लागू किया जा सकता है । अवधारणा का एक सबूत के रूप में, हमने दिखाया है कि stomatal गार्ड कोशिकाओं को इस पद्धति के माध्यम से समृद्ध कर रहे है व्यवहार्य है और fluorescein diacetate (एफडीए) परख और संयंत्र हार्मोन abscisic एसिड (आबा), क्रमशः का उपयोग अध्ययन द्वारा दिखाए गए के रूप में उत्तेजनाओं को उत्तरदायी । इसके अलावा, हम प्रदर्शन किया है कि उच्च गुणवत्ता वाले प्रोटीन इन गार्ड कोशिकाओं से अलग किया जा सकता है । यहां, हम इस प्रक्रिया का एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन ।

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Protocol

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1. बढ़ते पौधे

  1. पॉटी मिश्रण में बीज अंकुरित । १४० µmol फोटॉनों एम− 2 एस − 1 की हल्की तीव्रता के साथ एक विकास कक्ष में पौधे उगाना और 22 डिग्री सेल्सियस पर 8 एच लाइट का photoperiod और 2 सप्ताह के लिए 18 डिग्री सेल्सियस पर 16 एच डार्क ।
  2. प्रत्यारोपण समान आकार के अंकुरों में व्यक्तिगत रूप से 4 "व्यास मिट्टी युक्त बर्तन में और एक अतिरिक्त 3 सप्ताह के लिए विकसित एक ही परिस्थितियों में १.१ कदम में वर्णित है ।
    नोट: मिट्टी को नम रखने के लिए सप्ताह में दो बार नल के पानी के साथ पानी के पौधे लगाएं ।

2. समृद्ध Stomata की तैयारी

  1. 5 सप्ताह पुराने एक स्केलपेल के साथ एक थालियाना पौधों व्यक्ति की पत्तियों को हटा दें ।
  2. स्पष्ट स्कॉच टेप के दो टुकड़े करने के लिए एक पत्ती देते हैं, एक abaxial का पालन टुकड़ा के साथ (कम) पक्ष और अंय adaxial का पालन टुकड़ा (ऊपरी) पत्ती के पक्ष । 5 एस के लिए पत्ती पर टेप छोड़ दें ।
  3. कोमल छील अलग प्रत्येक हाथ पर तर्जनी उंगली और अंगूठे का उपयोग करने के लिए फुटपाथ और गार्ड कोशिकाओं और mesophyll कोशिकाओं के साथ adaxial पक्ष के साथ abaxial ओर अलग टेप के दो टुकड़े ।
  4. stomata खोलने बफर के ६० मिलीलीटर में पत्तियों के abaxial ओर से छिलके प्लेस (५० mm KCl, 10 मिमी एमईएस-koh, 1 M KOH के साथ ६.२ पीएच करने के लिए समायोजित) ४० मिमी × 12 मिमी आकार पेट्री व्यंजन में के रूप में वे एकत्र कर रहे हैं ।
    1. उपरोक्त चरणों को दोहराएँ जब तक सभी नमूना छिलके एकत्र कर रहे हैं.
  5. कदम १.१ में कहा प्रकाश शर्तों के तहत विकास चैंबर में छिलके युक्त पेट्री व्यंजन रखें । छिलकों को लाइट के नीचे 2 ज के लिए पूरी तरह खुला stomata छोड़ दें ।
  6. एक १५० मिमी x 20 मिमी पेट्री डिश सेल दीवार की ५० मिलीलीटर से युक्त में छिलके की जगह एंजाइम मिश्रण डाइजेस्ट (०.७% cellulase आर-10, ०.०२५% macerozyme R-10, ०.१% (w/v) polyvinylpyrrolidone-४०, और ०.२५% (w/v) गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन में ५५% मूल समाधान (०.५५ M सोर्बिटोल, ०.५ mm CaCl2, ०.५ मिमी MgCl2, ०.५ मिमी ascorbic एसिड की, 10 µ मीटर KH2पीओ4, 5 मिमी 4-morpholineethanesulfonic एसिड (एमईएस) पीएच ५.७ में 1 एम KOH) के साथ समायोजित ।
  7. 20 मिनट के लिए ५० rpm पर एक पेट्री डिश में एक पारस्परिक शेखर पर छिलके शेक ।
  8. 20 मिनट के बाद चिमटी के साथ एंजाइम समाधान से छील निकालें एक १५० मिमी x 20 मिमी आकार पेट्री पकवान पानी की ५० मिलीलीटर युक्त के छिलकों हस्तांतरण ।
  9. एक हस्तांतरण पिपेट का उपयोग करना, 15 एस के लिए छील पानी की 10 मिलीलीटर के साथ दो बार किसी भी अवशिष्ट एंजाइम समाधान को दूर करने के लिए ।
  10. एक १५० मिमी x 20 मिमी आकार पेट्री पकवान ताजा stomata खोलने बफर के ५० मिलीलीटर के रूप में चरण २.४ में इस्तेमाल के रूप में छील जगह के लिए चिमटी का प्रयोग करें । प्रकाश की स्थिति में 1 एच के लिए मशीन चरण १.१ में कहा stomata को ठीक करने की अनुमति ।

3. Abscisic अम्ल (आबा) उपचार और Stomata आंदोलन की परख

  1. एक १५० मिमी x 20 मिमी आकार पेट्री डिश में । stomatal खोलने बफर के ५० मिलीलीटर में 15 मिनट के लिए या stomatal खोलने बफर के 10 µ एम आबा की उचित उपचार समय के लिए एक अंतिम एकाग्रता के साथ में 30 डिग्री सेल्सियस पर समृद्ध stomata छिलके की मशीन ।
  2. 5, 15 और 30 मिनट के लिए ५० rpm पर एक शेखर पर छिलके प्लेस । प्रत्येक समय अंतराल के बाद चिमटी के साथ एक छील हटाने और चरण ३.३ में इमेजिंग चरणों का पालन करें ।
  3. आबा उपचार से पहले stomata की छवियों और एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के साथ आबा उपचार के बाद विभिन्न समय बिंदुओं पर ले लो ।
    1. एक छील ले और यह एक गिलास माइक्रोस्कोप स्लाइड पर जगह है ।
    2. स्लाइड को माइक्रोस्कोप स्टेज पर रखें और स्टेज को एडजस्ट करें ताकि छिलके की इमेज को विजुअल किया जा सके ।
    3. रक्षक कोशिकाओं की एक स्पष्ट छवि पाने के लिए माइक्रोस्कोप पर ठीक और पाठ्यक्रम ध्यान समायोजित करें ।
    4. 40X आवर्धन पर एकाधिक stomata की कई छवियां ले लो ।
  4. उपाय ६० stomatal ImageJ8का उपयोग कर एपर्चर ।
  5. मानक त्रुटि और एक p-मान < ०.०५ के ६० stomatal एपर्चर माप पर महत्व की गणना करें ।

4. प्रोटीन निष्कर्षण और एसडीएस-पृष्ठ जुदाई

  1. पर्याप्त तरल नाइट्रोजन में 15 एस के लिए छिलके पीस एक ठंडा मोर्टार और मूसल का उपयोग कर छील कवर ।
  2. प्रति ५० छील, Tris संतृप्त phenol (पीएच ८.८) और 3 मिलीलीटर प्रोटीन निष्कर्षण बफर के 3 मिलीलीटर जोड़ें (०.९ एम सुक्रोज, ०.१ मीटर Tris-एचसीएल, ०.०१ मीटर EDTA, ०.४% 2-Mercaptoethanol, 10 µ एल ऑफ 1 एमएम का टीज़र और फॉस्फेट अवरोधक) के साथ एक पिपेट के लिए मोर्टार और फिर छिलकों को पीस कर 5 addi के लिए एक धुएं डाकू में tional मिनट ।
  3. स्थानांतरण एक पिपेट का उपयोग कर और छील धातु चिमटी का उपयोग कर एक Oakridge केंद्रापसारक ट्यूब और एक शेखर पर 1 के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ५० rpm पर आंदोलन ।
  4. Oakridge केंद्रापसारक ट्यूब से छिलके निकालें और 10 मिनट के लिए ५,००० x g पर निकालने के लिए केंद्रापसारक । फिर एक नया स्वच्छ माइक्रो-केंद्रापसारक ट्यूब एक पिपेट का उपयोग करने के लिए शीर्ष phenolic चरण हस्तांतरण ।
  5. phenol निकाले गए प्रोटीन को १००% मेथनॉल में बर्फ-शीत ०.१ मीटर अमोनियम एसीटेट के 5 खंडों को जोड़कर हाला । भंवर संक्षेप में और-20 डिग्री सेल्सियस पर रात भर गर्मी ।
  6. 20 मिनट के लिए 4 ° c पर २०,००० x g पर केंद्रापसारक, धीरे से यह ट्यूब से बाहर डालने और ट्यूब में प्रोटीन गोली बनाए रखने के द्वारा supernatant खिचड़ी भाषा ।
  7. मेथनॉल में ०.१ मीटर अमोनियम एसीटेट के साथ दो बार प्रोटीन गोली धो लें, और फिर दो बार ८०% एसीटोन के साथ और एक बार १००% ठंडे एसीटोन के साथ ।
    नोट: धोया प्रोटीन की ट्यूब के लिए निर्दिष्ट एजेंट के 10 मिलीलीटर जोड़कर किया जाता है । 5 मिनट के लिए ५० rpm पर एक शेखर पर आंदोलन, 4 ° c पर 10 मिनट के लिए १५,००० x g पर केंद्रापसारक द्वारा पीछा किया । तो फिर से बाहर करने के लिए केवल प्रोटीन गोली बनाए रखने ट्यूब के एजेंट डालो ।
  8. जोड़ें 1 १००% ठंडा गोली को एसीटोन और फिर से धीरे से निलंबित ऊपर और नीचे pipetting ।
  9. पिपेट के माध्यम से एक 2 मिलीलीटर माइक्रो-केंद्रापसारक ट्यूब के लिए स्थानांतरण प्रोटीन सस्पेंशन तो 5 मिनट के लिए 4 ° c पर २०,००० x g पर केंद्रापसारक ।
  10. यह ट्यूब से खिचड़ी भाषा और 10 मिनट के लिए धुएं डाकू में गोली सूखी द्वारा एसीटोन निकालें ।
  11. विघटन बफर के २०० µ l के साथ एक माइक्रो-केंद्रापसारक ट्यूब में प्रोटीन भंग (8 एम यूरिया, ०.५% एसडीएस, 30 मिमी Tris-पीएच ८.५ पर एचसीएल) और 30 मिनट के लिए भंवर 15 डिग्री सेल्सियस पर २०,००० x जी में 20 मिनट के लिए और एक नया ट्यूब में supernatant इकट्ठा ।
  12. प्रोटीन ठहराव प्रोटोकॉल9के बाद प्रोटीन एकाग्रता को बढ़ाता है ।
  13. जेल ट्रो द्वारा प्रोटीन जुदाई के लिए प्रोटीन के नमूनों का प्रयोग करें10प्रोटोकॉल का पालन ।

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Representative Results

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mesophyll और एपिडर्मल कोशिकाओं के पाचन से पहले और बाद Arabidopsis गार्ड कोशिकाओं की एक प्रतिनिधि छवि चित्रा 1में दिखाया गया है । गार्ड सेल व्यवहार्यता से पहले और mesophyll और एपिडर्मल कोशिकाओं को हटाने के बाद एफडीए का उपयोग करने एंजाइमी गतिविधि और कोशिका झिल्ली अखंडता (आंकड़ा 1b और 1 d) को मापने के लिए मनाया जा सकता है । आकृति 2 आबा के इलाज के जवाब में Arabidopsis के stomatal आंदोलन को दर्शाता है । Stomatal एपर्चर आबा के साथ उपचार के 30 मिनट के बाद अधिक से अधिक ५० प्रतिशत घटाता है । चित्रा 2a stomata आंदोलन का एक समय पाठ्यक्रम है । विभिंन समय बिंदुओं पर, चित्र एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के साथ लिया गया था । Stomatal एपर्चर ImageJ और परिणामों के साथ मापा गया था ६० से ८० एपर्चर माप ± मानक त्रुटियों के औसत के रूप में प्रस्तुत किया गया । हर समय बिंदु पर stomata एपर्चर की एक प्रतिनिधि छवि चित्रा बीमें दिखाया गया है । प्रोटीन का पता लगाने, जुदाई और सापेक्ष बहुतायत एसडीएस द्वारा मनाया जाता है-पृष्ठ (चित्रा 3) । चार जैविक प्रतिकृति इस विधि से प्रोटीन निष्कर्षण के reproducibility पर जोर शामिल हैं ।

Figure 1
चित्रा 1 . Fluorescein diacetate व्यवहार्यता गार्ड कोशिकाओं के दाग से पहले और mesophyll और एपिडर्मल कोशिकाओं को हटाने के बाद । (क) चमकीले मैदान के नीचे छिलके (अजीर्ण). (ख) छिलकों (अपच) और एफडीए के साथ दाग । (C) छिलके (पच) चमकीले मैदान के नीचे ( D) छिलके (पच) और एफडीए के साथ दाग. सभी चित्र 40X आवर्धन पर ले जाया गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 . के जवाब में Arabidopsis के Stomatal आंदोलन आबा. एपिडर्मिस पूरी तरह से विस्तारित पत्तियों से खुली थीं, एपिडर्मल कोशिकाओं के साथ हटा दिया, और पूर्व खोलने बफर के साथ प्रकाश के तहत मशीन (५० mm KCl, 10 मिमी एमईएस-KOH, पीएच ६.२) के लिए 2 ज, और फिर पानी के साथ या 10 µ एम आबा उपचार के साथ मशीन के लिए 5, 10 और 30 min. (A) stomatal आंदोलन का टाइम कोर्स । (ख) प्रत्येक समय बिंदु पर stomata की प्रतिनिधि छवि । डेटा के रूप में तीन स्वतंत्र प्रयोगों के मतलब ± एसई दिखाया जाता है । प्रसरण (ANOVA) का विश्लेषण माध्य अंतर का विश्लेषण करने के लिए किया गया था । भिंन अक्षर p < 0.05 पर काफ़ी अलग अर्थ मान इंगित करते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 . एसडीएस-phenol आधारित प्रोटीन निष्कर्षण विधि का उपयोग कर समृद्ध गार्ड कोशिकाओं से प्रोटीन के पृष्ठ जुदाई । प्रोटीन की बराबर मात्रा (४० µ g) १२.५% polyacrylamide जेल का उपयोग कर हल किया गया था और CBB के साथ visualized । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

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गार्ड कोशिकाओं पौधों में सिग्नल transduction तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल प्रणाली है और यह सुनिश्चित करने के लिए कि अध्ययन में इस्तेमाल किया नमूनों की तैयारी जैविक सवालों का जवाब देने के लिए सबसे उपयुक्त है महत्वपूर्ण है । संयंत्र अनुसंधान समुदाय के भीतर गार्ड कोशिकाओं में बढ़ती रुचि के बावजूद, वहां कैसे stomatal गार्ड कोशिकाओं है कि दोनों stomatal आंदोलन और फिजियोलॉजी के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एक में अध्ययन किया जा आणविक परिवर्तन की अनुमति होगी तैयार करने पर कोई सार्वभौमिक विधि है सिस्टम. उंहें अलग करने के लिए चुनौती बड़े हिस्से में उनके छोटे आकार, कम बहुतायत और अद्वितीय संरचना है, जो इसे और अधिक या कम करने के लिए उंहें पूरी पत्तियों से दूर मुश्किल बना सकते है जिंमेदार ठहराया जा सकता है ।

इस प्रोटोकॉल कैसे इन बाधाओं को दूर करने पर एक विधि प्रदान करता है, उंहें अलग एक विकसित टेप-छील विधि का उपयोग कर । विधि इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत बरकरार stomatal गार्ड कोशिकाओं है, जो शारीरिक उत्तेजनाओं के लिए उत्तरदायी बने अलग करने के लिए एक रास्ता प्रदान करता है । इन नमूनों की तैयारी यह गार्ड सेल प्रोटीन है कि में गहराई से proteomic अध्ययन के लिए प्रारंभिक सामग्री के रूप में सेवा सकता है की निकासी के लिए संभव बनाता है, जैसे मात्रात्मक proteomic अध्ययन के लिए मिलकर जन टैग (टीएमटी) और या Isobaric टैग का उपयोग सापेक्ष और निरपेक्ष quantitation (iTRAQ)11,12. इसके अलावा, इस विधि को थोड़ा संशोधित किया जा सकता है और छोटे अणुओं के अध्ययन संभव बनाने के लिए अनुकूलित, जैसे रक्षक कोशिकाओं में पाया चयापचयों. प्रयोग यहां Arabidopsis में stomatal आंदोलन के लिए एक के रूप में phytohormone आबा का उपयोग किया, लेकिन अंय उपचार तदनुसार इस्तेमाल किया जा सकता है । यह विधि भी अंय प्रजातियों के पौधे के लिए अनुकूल है ।

प्रायोगिक डिजाइन और इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल सामग्री की प्रकृति के कारण, वहां कुछ महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं । जबकि छीलने के अलावा पत्ती के abaxial और adaxial पक्षों (२.२ कदम), यह महत्वपूर्ण है कि यह बिना किसी हिचकिचाहट के किया और टेप के दोनों टुकड़ों के बराबर कोमल दबाव लागू करने के द्वारा इतना है कि abaxial परत वर्दी है के बाद इसे हटा दिया है । यह महत्वपूर्ण है के लिए व्यक्तिगत छीलने तकनीक और अध्ययन में संयंत्र प्रजातियों के लिए पाचन समय का अनुकूलन के रूप में वे अलग इष्टतम पाचन बार हो सकता है । एंजाइम पाचन के दौरान (कदम 2.8-2.10), छील बारीकी से देखा जाना चाहिए और हर 3-5 मिनट की जांच की । यह महत्वपूर्ण है क्योंकि छिलके की परतों में मामूली अंतर तेज या धीमी पाचन बार में परिणाम होगा । जब आबा या अन्य उत्तेजनाओं (चरण ३.१) के साथ छिलकों का इलाज, छिलके समान रूप से रिक्तिपूर्ण, फ़्लोटिंग और धीरे मिलाना ताकि वे ओवरलैप कभी नहीं होना चाहिए । छिलके कि एक साथ अटक जाते है या समाधान के साथ संपर्क की कमी के कारण अलग परिणाम उपज हो सकता है ओवरलैप ।

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Disclosures

ब्याज का कोई विरोध नहीं घोषित ।

Acknowledgments

हम वीडियो संपादन में सहायता के लिए Buchholz हाई स्कूल के डिजिटल वीडियो उत्पादन टीम से डैनियल चेन धंयवाद । चेन लैब में stomatal गार्ड कोशिकाओं, प्रोटियोमिक् और metabolomics पर इस शोध को यूएस नेशनल साइंस फाउंडेशन (०८१८०५१, ११५८००० और १४१२५४७) से अनुदान का समर्थन मिला है । Wenwen कांग चीन छात्रवृत्ति परिषद द्वारा समर्थित है । Dr. Qiuying वेदना चीन छात्रवृत्ति परिषद और राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन द्वारा समर्थित है चीन (३१५७०३९६) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Stainless Steel Surgical Scalpel Feather   NC9999403
Scotch Tape (3M) ULINE S-9781
Petri Dish Sigma-Aldrich BR455701
Cellulase (Onozuka R-10)  Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd. 21560003-3
Macerozyme R-10 Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd. 21560003-4
DM6000B Microscope  Leica Microsystems
Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktails Thermo Fisher Scientific   PI78443
Oak Ridge High-Speed PPCO Centrifuge Tubes Thermo Fisher Scientific 3119-0030
EZQ Protein Quantitation Kit Thermo Fisher Scientific R33200
Fluorescein Diacetate (FDA) Thermo Fisher Scientific F1303
Abscisic Acid Sigma-Aldrich A4906
Metro Mix 500 BWI Companies  TX-500
Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 161-0737
Bio-Safe Comassie (G-250) Bio-Rad 161-0786
Microcentrifuge Tube (2mL) USA Scientific, Inc. 1620-2700
ImageJ software National Institute of Health
Tweezers  Sigma-Aldrich F4017-1EA
12% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel Bio-Rad 456-1043
Microscope slides Fisherbrand 12-550-A3

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Stomata टेप-पील: गार्ड सेल नमूना तैयारी के लिए एक बेहतर विधि
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Lawrence II, S., Pang, Q., Kong, W., Chen, S. Stomata Tape-Peel: An Improved Method for Guard Cell Sample Preparation. J. Vis. Exp. (137), e57422, doi:10.3791/57422 (2018).More

Lawrence II, S., Pang, Q., Kong, W., Chen, S. Stomata Tape-Peel: An Improved Method for Guard Cell Sample Preparation. J. Vis. Exp. (137), e57422, doi:10.3791/57422 (2018).

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