Spaltöffnungen Tape-Peel: Ein verbessertes Verfahren zur Wache Zelle Probenvorbereitung
Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode des Vorbereitens angereicherten Stomata Schließzellen, die nützlich für physiologische und andere biologische Studien.
Abstract
Das Studium der Schließzellen ist wichtig, das Wissen um die spezifischen Beiträge dieser Zelle Art die Gesamtfunktion der Pflanzen. Allerdings ist es oft schwierig, zu isolieren und damit oft zu studieren, stellt eine Herausforderung dar.
Diese Studie legt eine Stomata Guard Zelle Bereicherung Methode. Das Protokoll nutzt Tesafilm um die Schließzellen isolieren und Proteine aus den Zellen zu extrahieren. Diese Methode verbessert die Integrität und den Ertrag der Guard Zelle während der Isolierung und bietet eine zuverlässige Probe für die Untersuchung der Signalisierung Zellprozesse und wie sie mit Stomata Bewegung Phänotypen korrelieren. Bei dieser Methode wurden die Blätter der Pflanze zwischen beiden Teilen der Band partitioniert und geschält auseinander um der abaxial Seite zu entfernen. Dieses Protokoll wurde an Arabidopsis Blattgewebe Schließzellen isolieren angewendet. Die Zellen wurden mit Fluorescein Diacetat (FDA) Lebensfähigkeit zu bestimmen und Abscisic Säure (ABA) einzuschätzen Spaltöffnungen Bewegung als Reaktion auf ABA behandelt. Dieses Protokoll ist zusammenfassend erweist sich als nützlich für die Vorbereitung angereicherten Stomata Schließzellen und Proteine zu isolieren. Die Qualität der Zellen und Proteine erhalten Sie hier aktivieren physiologische und andere biologische Studien.
Introduction
Spaltöffnungen spielen eine wichtige Rolle in der allgemeinen Physiologie und Fitness Pflanzen. Diese kleine Pflanze bestimmte Strukturen von zwei spezialisierten epidermalen Zellen bekannt als Schließzellen gebildet werden und befinden sich meist reichlich auf der abaxial Oberfläche der Blätter. Spaltöffnungen sind notwendig für den Austausch der Gase zwischen der Anlage und der Atmosphäre sowie die Kontrolle der Wasserverlust durch Transpiration. Schließzellen regulieren Stomata Blende durch die Integration von verschiedenen externen (z.B., Licht, Feuchtigkeit, Erreger Kontakt, Kohlendioxid-Konzentration) und internen (zB., endogenen Hormonen) Reize1,2. In den letzten 20 Jahren ist dieser Zellentyp Modellsystem für Studium Zelle signalisieren Prozesse in Pflanzen geworden. Diese Zellen bilden einen kleinen Bruchteil der gesamten Zellen in ein Blatt; so muss um ihre einzigartige Mobilfunk zu untersuchen, biochemischen und molekularbiologischen Eigenschaften in eine einzelne Zelle Art und Weise, um sie von anderen Zelltypen Blatt zu isolieren. In der Vergangenheit haben Wache Zelle Studien häufig die Vorbereitung der Guard Zelle Protoplasten (GCP)3,4,5beteiligt. Dies in der Regel erfordert die Verwendung von großen Mengen an Zellwand entwürdigende Enzyme und oder mechanische Störungen über mischen und hat bewiesen, kostspielig und zeitaufwendig sein, dauert in der Regel viele Stunden zur Vorbereitung einer GCP-Probe, oft mit wenig Ertrag Zeiten. Noch wichtiger ist, weil Schließzellen als komplette Paare, Spaltöffnungen Blende Regeln handeln, die Verwendung von GCP als ein künstliches System zu studieren, Guard Zelle Signalisierung ersichtlich.
Hier entwickelten wir eine Methode um Spaltöffnungen vorzubereiten, in denen intakt Schließzellen sind bereichert und physiologische Reaktionen auf Reize zu erhalten. Diese Methode wurde eine Methode, die verwendet wurde, um Mesophyll Zelle Protoplasten6,7zu isolieren. In unserer Methode sind Spaltöffnungen vorbereitet mit klarem Tesafilm, zunächst die Mehrheit der Mesophyll Zellen trennen die adaxial Schicht des Blattes aus der abaxial Schicht mit dem Pflaster und der Schließzellen beigefügt. Dies geschieht durch Anbringung ein Stück Klebeband auf beiden Seiten des Blattes und schälen sie auseinander. Die Zellen aus dem abaxial Layer dürfen unter Licht in einem Spaltöffnungen-Eröffnung-Puffer zu erholen. Später werden die verbleibenden Zellen Pflaster entfernt mit einer kleinen Menge der Zellwand entwürdigende Enzyme, Guard-Zelle, die angereichert werden, auf dem Band zu hinterlassen.
In dieser einfachen Methode Stomata Schließzellen, die tragfähig und reaktionsfähig sind schnell und effizient werden vorbereitet, dauert weniger als eine Stunde angereicherten Stomata Schließzellen von 50 Schalen mit minimalen Kosten zu erhalten. Die Methode hier erlegt weniger Schäden an den Pflanzenzellen als bisherige Methoden dem Protoplasten zubereitet werden. Darüber hinaus Materialien von dieser Methode Ertrag wünschenswert Protein Mengen gesammelt. Vor allem, weil das Blatt nicht mischen unterliegt oder langwierige Verdauung Zeiten und die Schließzellen intakt sind, die Ergebnisse der Studien genauer werden darauf ein Guard natürliche Zellbiologie relevant sein. Mit dieser Methode können die Stomata Bewegungen mit Veränderungen auf molekularer Ebene in Echtzeit korreliert werden. Erkenntnisse aus Studien mit dieser Vorbereitung Methode wäre so wichtig für ein umfassenderes Verständnis der Guard Zelle Signalisierung.
Wir verwendeten die Pflanze Arabidopsis Thaliana als Vorbild; jedoch kann dieses Protokoll zur Bereicherung der Stomata Schließzellen in andere Pflanzenarten wie Brassica Napus mit kleinen Änderungen in der Verdauung Zeit angewendet werden. Als ein Proof of Concept haben wir bewiesen, dass Stomata Schließzellen, angereichert mit dieser Methode lebensfähig und reagieren auf Reize wie Fluorescein Diacetat (FDA) Assay und Studien unter Verwendung der Pflanzenhormon Abscisic Acid (ABA), bzw. zeigen. Darüber hinaus haben wir bewiesen, dass qualitativ hochwertige Proteine von diesen Schließzellen isoliert werden können. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll dieses Prozesses.
Protocol
Representative Results
Discussion
Schließzellen sind ein Modellsystem zur Untersuchung von Signal Transduction Mechanismen in Pflanzen und es ist wichtig, um sicherzustellen, dass die Vorbereitung der Proben, die in der Studie verwendeten die am besten geeignete biologische Fragen zu beantworten. Trotz des zunehmenden Interesses an Schließzellen innerhalb der Pflanze Forschungsgemeinschaft, gibt es keine universelle Methode zum Stomata Schließzellen vorbereiten, die sowohl die Physiologie der Stomata Bewegung erlauben würde sowie der molekularen Ver?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Daniel Chen aus der Digital Video Produktion Team von Buchholz High School für die Unterstützung bei der Videobearbeitung. Diese Forschung auf Stomata Schließzellen, Proteomik und Metabolomik in der Chen-Labor wurde durch Zuschüsse aus den US National Science Foundation (0818051, 1158000 und 1412547) unterstützt. Wenwen Kong wird von der China Scholarship Council unterstützt. Dr. Qiuying Pang wird von der China Scholarship Council und der National Natural Science Foundation of China (31570396) unterstützt.
Materials
| Stainless Steel Surgical Scalpel | Feather | NC9999403 | |
| Scotch Tape (3M) | ULINE | S-9781 | |
| Petri Dish | Sigma-Aldrich | BR455701 | |
| Cellulase (Onozuka R-10) | Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd. | 21560003-3 | |
| Macerozyme R-10 | Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd. | 21560003-4 | |
| DM6000B Microscope | Leica Microsystems | ||
| Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktails | Thermo Fisher Scientific | PI78443 | |
| Oak Ridge High-Speed PPCO Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 3119-0030 | |
| EZQ Protein Quantitation Kit | Thermo Fisher Scientific | R33200 | |
| Fluorescein Diacetate (FDA) | Thermo Fisher Scientific | F1303 | |
| Abscisic Acid | Sigma-Aldrich | A4906 | |
| Metro Mix 500 | BWI Companies | TX-500 | |
| Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 161-0737 | |
| Bio-Safe Comassie (G-250) | Bio-Rad | 161-0786 | |
| Microcentrifuge Tube (2mL) | USA Scientific, Inc. | 1620-2700 | |
| ImageJ software | National Institute of Health | ||
| Tweezers | Sigma-Aldrich | F4017-1EA | |
| 12% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel | Bio-Rad | 456-1043 | |
| Microscope slides | Fisherbrand | 12-550-A3 |
References
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