Stomata Tape-Peel: En bedre metode for vakt celle utvalg forberedelse
Summary
Denne protokollen beskriver en metode for å forberede beriket øverst celler som er nyttig for fysiologiske og andre biologiske studier.
Abstract
Studiet av celler er avgjørende for kunnskap om de spesielle bidragene av denne cellen til funksjonen samlet planter. Men det er vanskelig å isolere og dermed studere dem ofte gir en utfordring.
Denne studien etablerer en lys langsgående vakt celle berikelse metode. Protokollen utnytter teip for å isolere celler og ekstra proteiner fra cellene. Denne metoden forbedrer integritet og avkastning på vakt cellen under isolasjon og gir et pålitelig utvalg for studier av cellen signalnettverk prosesser og hvordan de relateres til øverst bevegelse fenotyper. I denne metoden anlegget bladene delt mellom to deler av tape og skrelles fra hverandre for å fjerne den abaxial siden. Denne protokollen ble brukt Arabidopsis blad vev å isolere celler. Cellene ble behandlet med fluorescein diacetate (FDA) for å bestemme levedyktigheten og abscisic syre (ABA) å vurdere stomata bevegelse svar på ABA. Avslutningsvis beviser denne protokollen nyttig for utarbeidelse beriket øverst celler og isolere proteiner. Kvaliteten på celler og proteiner fått her aktivere fysiologiske og andre biologiske studier.
Introduction
Stomata spiller en viktig rolle i den generelle fysiologi og fitness av planter. Disse små anlegg spesifikke strukturer er dannet av to spesialiserte epidermal celler kjent som celler og er funnet mest rikelig på abaxial overflaten av bladene. Stomata er nødvendig for utveksling av gasser mellom anlegget og atmosfæren, samt kontroll av vanntap gjennom transpirasjon. Celler regulere stomata blenderåpning gjennom integrering av annen ekstern (f.eks, lys, fuktighet, patogen kontakt, karbondioksid nivået) og interne (f.eks., endogen hormoner) stimuli1,2. I de siste 20 årene blitt dette celle type et modellsystem for studere celle signalisering prosesser i planter. Disse cellene utgjør en liten brøkdel av de totale cellene i et blad; Dermed, for å undersøke deres unike mobilnettet, biokjemiske og molekylære egenskaper i en enkeltcelle måte, er det nødvendig å isolere dem fra andre blad celletyper. I siste, har vakt celle studier ofte involvert utarbeidelse av vakt celle protoplasts (GCP)3,4,5. Dette vanligvis krever bruk av store mengder celleveggen nedverdigende enzymer og eller mekanisk avbrudd via blanding og har vist seg å være kostbart og tidkrevende som det vanligvis tar mange timer å forberede et GCP utvalg, ofte tider med liten avkastning. Enda viktigere, fordi celler som fullstendig par å regulere stomata blenderåpning, ses bruk av GCP som en kunstig system å studere vakt celle signalisering.
Her har vi utviklet en metode for å forberede stomata som intakt celler er beriket og vedlikeholde fysiologiske responser på stimuli. Denne metoden ble inspirert av en metode som ble brukt til å isolere mesophyll celle protoplasts6,7. I vår metode forberedt stomata med teip først skille fleste mesophyll cellene knyttet til adaxial laget av bladet fra det abaxial laget som inneholder fortau og celler. Dette gjøres ved påføring et stykke tape på hver side av bladet og flassing dem fra hverandre. Cellene fra abaxial laget kan gjenopprette under lys i en stomata-åpning buffer. Senere fjernes resterende fortauet cellene med en liten mengde cellevegg nedverdigende enzymer, etterlot vakt cellen som er beriket på båndet.
I denne enkle metoden øverst celler som både levedyktig og forståelsesfull kan raskt og være effektivt forberedt, tar mindre enn en time å få beriket øverst celler fra 50 skreller med minimal kostnad. Metoden her legger mindre skade anlegget celler enn tidligere metoder hvor protoplasts er forberedt. I tillegg samlet materiale fra denne metoden avkastning ønskelig protein beløp. Viktigst, fordi bladet ikke er utsatt for blending eller lengre fordøyelsen ganger og celler forblir intakt, vil resultatene av studier nærmere være relevant for en vakt celle naturlig biologi. Med denne metoden kan øverst bevegelser være korrelert i sanntid med endringer på molekylært nivå. Dermed vil kunnskapen fra studier med denne forberedelse metoden være viktig for en mer omfattende forståelse av vakt celle signalisering.
Vi brukte planten Arabidopsis thaliana som modell; men denne protokollen gjelder anriking av øverst celler i andre plantearter som Brassica napus med små modifikasjoner i fordøyelsen tid. Som et bevis på konseptet, har vi vist at øverst celler beriket via denne metoden er levedyktig og responsive til stimuli som vist av fluorescein diacetate (FDA) analyse og studier utnytte plantehormonet abscisic syre (ABA), henholdsvis. I tillegg har vi vist at høy kvalitet proteiner kan isoleres fra disse celler. Her beskriver vi detaljerte protokollen denne prosessen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det er viktig å sikre at utarbeidelse av prøver som brukes i studien er den mest passende for biologiske spørsmål celler er et modellsystem for å studere signal signaltransduksjon mekanismer i planter. Til tross for økende interessen celler i anlegget forskning samfunnet, det finnes ingen universell metode deg øverst celler som ville tillate både øverst bevegelse og fysiologi og molekylære endringene bli studert i en system. Utfordringen å isolere dem kan tilskrives i stor grad deres liten størrelse, lave ove…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Daniel Chen fra Digital Video produksjon Team av Buchholz High School hjelp med redigering av video. Denne forskningen på øverst celler, Proteomikk og metabolomics i Chen lab har blitt støttet av tilskudd fra oss National Science Foundation (0818051, 1158000 og 1412547). Wenwen Kong støttes av Kina stipend rådet. Dr. Qiuying Pang støttes av Kina stipend råd og National Natural Science Foundation i Kina (31570396).
Materials
| Stainless Steel Surgical Scalpel | Feather | NC9999403 | |
| Scotch Tape (3M) | ULINE | S-9781 | |
| Petri Dish | Sigma-Aldrich | BR455701 | |
| Cellulase (Onozuka R-10) | Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd. | 21560003-3 | |
| Macerozyme R-10 | Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd. | 21560003-4 | |
| DM6000B Microscope | Leica Microsystems | ||
| Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktails | Thermo Fisher Scientific | PI78443 | |
| Oak Ridge High-Speed PPCO Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 3119-0030 | |
| EZQ Protein Quantitation Kit | Thermo Fisher Scientific | R33200 | |
| Fluorescein Diacetate (FDA) | Thermo Fisher Scientific | F1303 | |
| Abscisic Acid | Sigma-Aldrich | A4906 | |
| Metro Mix 500 | BWI Companies | TX-500 | |
| Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 161-0737 | |
| Bio-Safe Comassie (G-250) | Bio-Rad | 161-0786 | |
| Microcentrifuge Tube (2mL) | USA Scientific, Inc. | 1620-2700 | |
| ImageJ software | National Institute of Health | ||
| Tweezers | Sigma-Aldrich | F4017-1EA | |
| 12% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel | Bio-Rad | 456-1043 | |
| Microscope slides | Fisherbrand | 12-550-A3 |
References
- Acharya, B., Assmann, S. Hormone interactions in stomatal function. Plant Molecular Biology. 69 (4), 451-462 (2009).
- Schroeder, J. I., Allen, G. J., Hugouvieux, V., Kwak, J. M., Waner, D. Guard cell signal transduction. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 52, 627-658 (2001).
- Obulareddy, N., Panchal, S., Melotto, M. Guard Cell Purification and RNA Isolation Suitable for High-Throughput Transcriptional Analysis of Cell-Type Responses to Biotic Stresses. Molecular Plant-Microbe Interactions. 26 (8), 844-849 (2013).
- Pandey, S., Wang, X. Q., Coursol, S. A., Assmann, S. M. Preparation and applications of Arabidopsis thaliana guard cell protoplasts. New Phytologist. 153 (3), 517-526 (2002).
- Schroeder, J. I., Raschke, K., Neher, E. Voltage Dependence Of K+ Channels In Guard-Cell Protoplasts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (12), 4108-4112 (1987).
- Wu, F. H., et al. Tape-Arabidopsis Sandwich – a simpler Arabidopsis protoplast isolation method. Plant Methods. 5, 10 (2009).
- Svozil, J., Gruissem, W., Baerenfaller, K. Proteasome targeting of proteins in Arabidopsis leaf mesophyll, epidermal and vascular tissues. Frontiers in Plant Science. 6, (2015).
- Schneider, C., Rasband, W., Eliceiri, K. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Agnew, B., Murray, D., Patton, W. A rapid solid-phase fluorescence-based protein assay for quantitation of protein electrophoresis samples containing detergents, chaotropes, dyes, and reducing agents. Electrophoresis. 25 (15), 2478-2485 (2004).
- He, F. Laemmli-SDS-PAGE. Bio-protocol. Bio101 (80), (2011).
- Thompson, A., et al. Tandem mass tags: A novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS (vol 75, pg 1895). Analytical Chemistry. 78 (12), 4235-4235 (2006).
- Wiese, S., Reidegeld, K. A., Meyer, H. E., Warscheid, B. Protein labeling by iTRAQ: A new tool for quantitative mass spectrometry in proteome research. Proteomics. 7 (3), 340-350 (2007).
