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Biology

Stomata 테이프-껍질: 가드 셀 샘플 준비에 대 한 개선된 방법

doi: 10.3791/57422 Published: July 15, 2018

Summary

이 프로토콜 생리 및 다른 생물학 학문을 위한 유용한 풍부한 stomatal 가드 셀 준비의 방법을 설명 합니다.

Abstract

가드 셀의 연구의 식물의 전반적인 기능에이 세포 유형은 특정 기부금의 지식에 근본적 이다. 그러나, 그것은 종종 어려운 분리 하 고 도전을 제공 따라서 종종 그들을 공부.

이 연구는 stomatal 가드 세포 농축 방법을 설정합니다. 프로토콜 가드 세포를 분리 하 고 세포에서 단백질을 추출에 스카치 테이프를 사용 합니다. 이 방법은 무결성과 가드 셀의 수익률 격리 중 향상과 세포 신호 프로세스와 어떻게 그들이 stomatal 운동 고기 연관의 연구에 대 한 신뢰할 수 있는 샘플을 제공 합니다. 이 방법에서는, 식물 잎 테이프의 두 부분 사이 분할 되었고 abaxial 쪽 제거를 떨어져 벗 겨. 이 프로토콜은 가드 셀을 애기 잎 조직에 적용 되었다. Fluorescein diacetate 생존 능력을 결정 하는 (FDA)와 abscisic 산 (ABA) stomata 운동 ABA에 대 한 응답에서을 평가 하는 세포 치료 했다. 결론적으로,이 프로토콜 증명 농축된 stomatal 가드 셀을 준비 하 고 단백질을 분리 하는 데 유용 합니다. 세포와 단백질의 품질 얻을 여기 생리 및 다른 생물학 연구.

Introduction

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Stomata 전반적인 생리학과 식물의 적합성에 중요 한 역할을 한다. 이 작은 식물 특정 구조 가드 셀으로 알려진 두 전문된 상피 세포에 의해 형성 되 고 잎의 abaxial 표면에 가장 풍부 하 게 발견 된다. Stomata가 식물 및 분위기,으로 물 증발을 통해 손실 컨트롤 사이 가스의 교환에 대 한 필요 합니다. 가드 셀 (예를 들어, 빛, 습도, 병원 체 접촉, 이산화탄소 수준) 다른 외부의 통합을 통해 stomata 조리개 조절 및 내부 (., 내 생 호르몬) 자극1,2. 지난 20 년 동안에이 세포 유형은 식물에서 프로세스 신호 공부 셀 모델 시스템 되고있다. 이러한 셀 리프; 총 셀의 작은 분수를 만들 따라서, 그들의 독특한 휴대 조사, 생 화 학적 및 분자 속성 단일 셀 방식으로, 그것은 다른 리프 셀 종류에서 그들을 격리 하는 데 필요한. 과거, 가드 셀 연구는 자주 참여 하고있다 가드 셀 protoplasts (GCP)3,,45의 준비. 이 일반적으로 많은 양의 세포 벽 타락 효소 및 또는 혼합을 통해 기계적 장애를 사용 해야 합니다 그리고 작은 수익률 시간 일반적으로 자주 GCP 샘플을 준비 하는 데 많은 시간이 소요 비용과 시간이 많이 소요 될 입증. 더 중요 한 것은, 가드 셀 stomata 조리개를 조절 하는 완전 한 쌍으로, 행동 하기 때문에 GCP 사용 하 여 가드 셀 신호를 공부 하 고 인공 시스템으로 볼 수 있습니다.

여기, 우리는 그대로 가드 셀 풍성 하 게 하 고 자극에 생리 적인 응답을 유지 stomata를 준비 하는 방법을 개발 했습니다. 이 메서드는 mesophyll 셀 protoplasts6,7를 분리 하는 데 사용 된 방법에 의해 영감을 했다. 우리의 방법에 stomata 투명 스카치 테이프를 먼저 mesophyll 세포의 대부분을 분리 포장과 가드 셀을 포함 하는 abaxial 계층에서 잎의 adaxial 레이어에 연결을 사용 하 여 준비가 되어 있습니다. 이 잎의 각 측에 테이프의 조각을 추가 하 고 그들을 떨어져 필 링을 하면 됩니다. Abaxial 계층에서 셀 광원 stomata 오프닝 버퍼에서 복구할 수 있습니다. 후 나머지 포장도 세포의 세포 벽 타락 효소, 테이프에 가드 셀을 풍성 하 게 뒤에 남겨두고 소량을 사용 하 여 제거 됩니다.

이 간단한 방법에서는, stomatal 가드 셀 실용적이 고 반응 수 신속 하 게 그리고 효율적으로 준비, 농축된 stomatal 가드 세포를 최소의 비용으로 50 껍질에서 1 시간 이내에 복용. 여기에 메서드 protoplasts 준비는 이전 방법 보다는 식물 세포에 더 적은 손상을 부과 했다. 또한, 재료는이 방법은 수율 바람직한 단백질 금액에서 수집. 가장 중요 한 것은, 잎 혼합 대상이 되지 않습니다, 긴 소화 시간과 가드 셀 그대로 유지 하기 때문에 연구의 결과 더 밀접 하 게 가드 셀의 자연적인 생물학의 관련이 있을 것입니다. 이 방법으로 분자 수준에서 변경 stomatal 움직임 실시간에서 상관 수 있다. 따라서,이 준비 메서드를 사용 하 여 연구에서 얻은 지식을 가드 셀 신호에 대 한 보다 포괄적인 이해에 대 한 중요 한 것입니다.

우리 모델; 식물 애기 thaliana 사용 그러나이 프로토콜을 소화 시간에 작은 수정 stomatal 가드 셀 브라 시카 napus 등 다른 식물 종에의 농축에 적용할 수 있습니다. 개념의 증거로 서 우리는이 방법을 통해 농축 stomatal 가드 세포는 가능한 fluorescein diacetate (FDA) 분석 결과 각각 식물 호르몬 abscisic 산 (ABA)를 이용 하 여 연구에 의해 표시 된 것 처럼 자극에 반응 증명 하고있다. 또한, 우리는 높은-품질 단백질이 가드 셀에서 고립 될 수 있다 증명 하고있다. 여기, 우리는이 과정의 상세한 프로토콜을 설명합니다.

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Protocol

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1. 성장 하는 식물

  1. Potting 혼합물에 씨를 출 아 할. 식물 성장 성장 챔버에 140 µmol 광자 m−2의 − 1 의 광도와 22 ° C 및 16 h 8 h 조명의 photoperiod 어두운 18 ° C에서 2 주 동안.
  2. 4"직경 남 비는 토양을 포함으로 개별적으로 비슷한 크기의 묘를 이식 하 고 성장 단계 1.1에서에서 설명 하는 추가 동일한 조건에서 3 주.
    참고: 습 한 토양을 유지 하는 일주일에 두 번 수돗물 식물 물.

2입니다. 풍부한 Stomata의 준비

  1. 메스와 개별 5 주 된 A. thaliana 식물의 잎을 제거 합니다.
  2. 원피스 abaxial (아래) 쪽으로 준수와 준수는 잎의 adaxial (위) 쪽으로 다른 조각 각 잎 투명 스카치 테이프의 두 가지를 연결 합니다. 5 잎에 테이프를 두고 s.
  3. 부드러운 껍질 떨어져 포장과 가드 세포 mesophyll 세포를 가진 adaxial 측 abaxial 측을 분리 각 손에 집게 손가락 및 엄지를 사용 하는 테이프의 두 가지.
  4. 장소 여 stomata의 60 mL에 나뭇잎의 abaxial 측면에서 껍질 40 m m × 12 m m 크기 페 트리 (50 m m KCl, 10mm MES-코, pH 6.2 1 m 코 조정) 버퍼링은 수집 된 요리.
    1. 모든 샘플 껍질 수집 될 때까지 위의 단계를 반복 합니다.
  5. 1.1 단계에 명시 된 빛 조건에서 성장 챔버에 껍질을 포함 하는 배양 접시를 놓습니다. Stomata를 완전히 여 2 h에 대 한 빛 아래 껍질을 남겨 주세요.
  6. 장소는 150 m m x 20 m m 소화 효소 혼합물 (0.7% cellulase R-10, 0.025% macerozyme R-10, 0.1% (w/v) polyvinylpyrrolidone-40, 및 0.25% (w/v) 소 혈 청 알 부 민 55% 기본 솔루션 (0.55 M sorbitol, 0.5 m m에서에서 세포 벽의 50 mL를 포함 하는 배양 접시에 껍질 CaCl2, 0.5 m m MgCl2, 0.5 m m 의약품, 10 µ M KH24, 5 mM 4 morpholineethanesulfonic 산 (MES) pH 5.7에서 1 m 코 조정).
  7. 20 분 50 rpm에서 배양 접시에 상호 통에 껍질을 흔들어.
  8. 껍질에서에서 제거 효소 솔루션 핀셋으로 후 20 분 물 50 mL를 포함 하는 150 m m x 20 m m 크기 페 트리 접시에 껍질을 전송 합니다.
  9. 15 대 한 껍질을 씻어 전송 피 펫을 사용 하 여, 모든 잔여 효소 솔루션을 제거 하는 물 10 mL로 두 번 s.
  10. 핀셋을 사용 하 여 단계 2.4에서에서 사용 되는 버퍼를 열고 신선한 stomata의 50 mL와 150 m m x 20 m m 크기 페 트리 접시에 껍질을 배치. 1 h 단계 복구 stomata 있도록 1.1에서에서 명시 된 조명 조건에 대 한 품 어.

3. Abscisic 산 (ABA) 치료 및 Stomata 움직임 분석 결과

  1. 150 m m x 20 m m 크기 페 트리 접시에 15 분 stomatal 개통 버퍼의 50 mL 또는 stomatal 개통 버퍼의 적절 한 치료 시간이 10 µ M ABA의 최종 농도 50 mL 30 ° C에서 풍부한 stomata 껍질을 품 어.
  2. 5, 15, 30 분 동안 50 rpm에서 통에 껍질을 놓습니다. 각 시간 간격 후 핀셋으로 껍질을 제거 하 고 단계 3.3 이미징 단계를 따릅니다.
  3. 가벼운 현미경으로 ABA 치료 후 stomata ABA 치료 전과 다양 한 시간 점에서 이미지를 받아.
    1. 껍질을가지고 고 유리 현미경 슬라이드 위에 놓습니다.
    2. 슬라이드를 현미경 스테이지에 놓고 무대를 조정 하는 껍질의 이미지를 시각화할 수 있습니다.
    3. 벌금을 조정 하 고 가드 셀의 깨끗 한 이미지를 현미경에 집중 코스.
    4. 40 X 확대에서 여러 stomata의 여러 이미지를 가져가 라.
  4. 60 stomatal apertures ImageJ8를 사용 하 여 측정 합니다.
  5. 표준 오류 및 p-값 < 0.05 60 stomatal 조리개 측정의 의미를 계산 합니다.

4. 단백질 추출 및 SDS 페이지 분리

  1. 15 대 한 껍질을 갈아 냉장된 박격포 및 방 앗 공이 사용 하 여 껍질을 충당 하기 위해 충분 한 액체 질소에 s.
  2. 50 껍질 당 포화 트리 스 페 놀 (pH 8.8)의 3 개 mL를 추가 및 3 mL 단백질 추출 버퍼 (자당 0.9 M, 0.1 M Tris HCl, 0.01 M EDTA, 0.4 %2-Mercaptoethanol, 1mm 프로 테아 제와 인산 가수분해 효소 억제 물의 10 µ L) 박격포를 피 펫을 다음 5 addi의 껍질을 갈아 증기 두건에서 tional 분입니다.
  3. 추출은 피 펫을 사용 하 여 전송 하 고는 오크에 금속 핀셋을 사용 하 여 껍질 원심 관 50 rpm에서 1 h 4 ° c.에 대 한 통에 선동
  4. 오크 릿지 원심 분리기 튜브에서 껍질을 제거 하 고 원심 10 분 동안 5000 x g에서 추출. 다음 전송 최고 페 놀 단계는 피 펫을 사용 하 여 새로운 깨끗 한 마이크로 원심 튜브.
  5. 침전은 페 놀 100% 메탄올에 얼음 처럼 차가운 0.1 M 염화 아세테이트의 5 볼륨을 추가 하 여 단백질을 추출. 짧게 소용돌이 하룻밤-20 ° c.에 품 어
  6. 20 분 동안 4 ° C에서 20000 x g에서 centrifuge, 천천히는 튜브 붓는 여는 상쾌한 가만히 따르다 고 튜브에 단백질 펠 릿을 유지 합니다.
  7. 메탄올에 0.1 M 염화 아세테이트로 두 번 단백질 펠 릿을 세척 그리고 두 번 80% 아세톤과 함께 한 번 100% 찬 아세톤.
    참고: 세척 단백질의 튜브에 지정 된 시 약의 10 mL를 추가 하 여 수행 됩니다. 5 분, 10 분 동안 4 ° C에서 15000 x g에서 원심 분리 뒤 50 rpm에서 통에 교 반 하십시오. 그런 다음 튜브만 단백질 펠 릿을 유지 시 약을 붓는 다.
  8. 펠 릿을 100% 찬 아세톤의 1 mL을 추가 하 고 다시 천천히 위아래로 pipetting으로 일시 중단.
  9. 2 mL 마이크로 원심 관에 피 펫을 통해 단백질 정지를 전송 후 5 분 동안 4 ° C에서 20000 x g에서 원심.
  10. 튜브에서 decanting 하 여 아세톤을 제거 하 고 10 분 동안 증기 두건에서 펠 릿 건조.
  11. 마이크로 원심 튜브 해산 버퍼 (8 M 요소, 0.5 %SDS, pH 8.5에서 30 mM Tris HCl)의 200 µ L에서에서 단백질 분해와 20000 x g 20 분 및 수집 새로운 튜브에 상쾌한 15 ° c에서 30 분 원심 분리기에 대 한 소용돌이.
  12. 다음 단백질 정량화 프로토콜9단백질 농도 계량.
  13. 단백질 분리에 대 한 단백질 견본을 사용 하 여 젤 전기 이동 법 프로토콜10다음으로.

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Representative Results

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대표 이미지 전에 애기 가드 셀의 전후 mesophyll와 표 피 세포의 소화 그림 1에 표시 됩니다. 효소 활동 및 세포 막의 무결성 (그림 1B1 D)를 측정 하는 FDA를 사용 하 여 mesophyll와 표 피 세포의 제거 전후 가드 세포 생존 능력을 관찰할 수 있습니다. 그림 2 는 stomatal 운동의 애기 ABA 치료에 대 한 응답에서을 보여 줍니다. Stomatal 조리개 ABA 치료의 30 분 후 50% 이상 감소합니다. 그림 2A stomata 운동의 시간 코스입니다. 다양 한 시간 점에서 사진 가벼운 현미경으로 찍은 사진. Stomatal 조리개 ImageJ로 측정 되었다 고 결과 80 조리개 측정 ± 표준 오류에 60에서 평균으로 제시 했다. 각 시간 점에서 stomata 조리개의 대표 이미지는 그림 2B에 표시 됩니다. 단백질 검출, 분리 및 관계 되는 풍부는 SDS 페이지 (그림 3)에 의해 관찰 된다. 4 생물 복제 단백질 추출이이 방법에서의 재현성을 강조 하기 위해 포함 되어 있습니다.

Figure 1
그림 1 . Fluorescein diacetate 생존 얼룩 가드 셀의 mesophyll와 표 피 세포의 제거 전후. 밝은 분야에서 (소화)는 (A) 껍질 (B) 껍질 (소화) FDA와 스테인드. (C) 껍질 (소화) 아래 밝은 필드 (D) 껍질 (소화)와 FDA와 스테인드. 모든 그림은 40 X 확대 촬영 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2 . 응답으로 ABA stomatal 운동의 애기. 표 피 제거, 사전 2 h의 오프닝 버퍼 (50 m m KCl, 10mm MES-코, pH 6.2)와 빛 아래 incubated 하 고 다음 물과 5, 10 µ M ABA 치료를 incubated 상피 세포와 완전히 확장 된 잎에서 벗 겨 했다 10 및 30 분 (A) Stomatal 움직임의 시간 과정입니다. (B) 각 시간에서 stomata의 대표 이미지 포인트. 데이터는 3 개의 독립적인 실험의 ± SE를 수단으로 표시 됩니다. 분산 분석 (ANOVA) 평균 차이 분석 preformed 했다. 다른 문자는 p에서 크게 다른 평균 값을 나타냅니다 < 0.05. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3 . 페 놀 기반 단백질 추출 방법을 사용 하 여 풍부한 가드 세포에서 단백질의 SDS 페이지 분리. 같은 양의 (40 µ g) 단백질 12.5 %polyacrylamide 젤을 사용 하 여 해결 되었고 CBB와 시각. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

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가드 셀 모델 시스템 식물에서 신호 전달 메커니즘 연구 이며 연구에 사용 하는 샘플의 준비는 생물학 질문에 가장 적합 한 보장 하는 것이 중요 하다. 식물 연구 지역 사회 내에서 가드 셀에 증가 관심에도 불구 하 고 보편적인 메서드는 stomatal 운동 및 생리학 있도록 stomatal 가드 셀을 준비 하는 방법에 대 한 공부 분자 변화 뿐만 아니라 시스템입니다. 그들을 도전 많은 부분에서 그들의 작은 크기, 낮은 풍요와 그것을 더 많거나 적은 전체 잎에서 그들을 제거 어렵게 만들 수 있는 독특한 구조를 지정할 수 있습니다.

이 프로토콜 개발된 테이프-껍질 메서드를 사용 하 여 그들을 분리 하는 이러한 장애물을 극복 하는 방법에 대 한 방법의 제공 한다. 이 프로토콜에 표시 하는 방법 그대로 stomatal 가드 세포, 생리 적으로 자극에 응답 상태를 유지 하기 위한 방법을 제공 합니다. 이 샘플의 준비는 탠덤 질량 태그 (TMT) 또는 대 한 Isobaric 태그를 이용 하 여 양적 proteomic 연구 등 깊이 있는 proteomic 연구에 대 한 시작 물자로 역할을 수 있는 가드 세포 단백질의 추출 가능 하 게 상대 및 절대 정량 (iTRAQ)11,12. 또한,이 방법은 수 약간 수정 되며 작은 분자 대사 산물 가드 셀에서 발견 등의 연구를 가능 하 게 하도록 최적화. 여기 실험 활용 phytohormone ABA 애기, stomatal 운동 위한 elicitor 다른 치료를 적절 하 게 사용할 수 있습니다. 이 메서드는 또한 다른 식물 종에.

실험 설계와이 프로토콜에 사용 되는 재료의 특성, 몇 가지 중요 한 단계가 있습니다. 필 링 떨어져 잎 (단계 2.2)의 abaxial 및 adaxial 측면, 하는 동안 그것은 주저 없이 하 고는 abaxial 레이어 균일 제거 후 테이프의 두 조각에 동등한 부드러운 압력을 적용 하 여 이루어집니다 중요 하다. 그것은 다른 최적의 소화 시간을 있을 수 있습니다 그들은 연구에서 식물 종에 대 한 개별 필 링 기술과 소화 시간을 최적화 해야 합니다. 효소 소화 (단계 2.8-2.10), 하는 동안 껍질 밀접 하 게 감시와 있어야 3-5 분 마다 확인 합니다. 약간의 차이 껍질의 층에 더 빨리 또는 더 느리게 소화 시간 귀 착될 것 이다 때문에 이것이 중요 합니다. ABA 또는 다른 자극 (3.1 단계)와 껍질을 치료 하면 껍질 해야 될 동등 하 게 간격, 부동 하 고 그들은 결코 중복 되도록 부드럽게 흔들어. 껍질 함께 붙어 얻을 또는 중복 솔루션과 접촉의 부족으로 인해 다른 결과 얻을 수 있습니다.

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Disclosures

관심 없음 충돌 선언.

Acknowledgments

우리는 다니엘 첸에서 디지털 영상 제작 팀의 벅 홀 고등학교 동영상 편집에 감사 합니다. Stomatal 가드 셀 proteomics, metabolomics 첸 실험실에서에이 연구는 미국 국립 과학 재단 (0818051, 1158000 및 1412547)에서 교부 금에 의해 지원 되었습니다. Wenwen 홍콩 중국 장학금 위원회에 의해 지원 됩니다. 박사 Qiuying Pang 중국 장학금 위원회 국가 자연 과학 재단의 중국 (31570396)에 의해 지원 됩니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Stainless Steel Surgical Scalpel Feather   NC9999403
Scotch Tape (3M) ULINE S-9781
Petri Dish Sigma-Aldrich BR455701
Cellulase (Onozuka R-10)  Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd. 21560003-3
Macerozyme R-10 Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd. 21560003-4
DM6000B Microscope  Leica Microsystems
Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktails Thermo Fisher Scientific   PI78443
Oak Ridge High-Speed PPCO Centrifuge Tubes Thermo Fisher Scientific 3119-0030
EZQ Protein Quantitation Kit Thermo Fisher Scientific R33200
Fluorescein Diacetate (FDA) Thermo Fisher Scientific F1303
Abscisic Acid Sigma-Aldrich A4906
Metro Mix 500 BWI Companies  TX-500
Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 161-0737
Bio-Safe Comassie (G-250) Bio-Rad 161-0786
Microcentrifuge Tube (2mL) USA Scientific, Inc. 1620-2700
ImageJ software National Institute of Health
Tweezers  Sigma-Aldrich F4017-1EA
12% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel Bio-Rad 456-1043
Microscope slides Fisherbrand 12-550-A3

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References

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Lawrence II, S., Pang, Q., Kong, W., Chen, S. Stomata Tape-Peel: An Improved Method for Guard Cell Sample Preparation. J. Vis. Exp. (137), e57422, doi:10.3791/57422 (2018).More

Lawrence II, S., Pang, Q., Kong, W., Chen, S. Stomata Tape-Peel: An Improved Method for Guard Cell Sample Preparation. J. Vis. Exp. (137), e57422, doi:10.3791/57422 (2018).

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