Summary
여기는 설정 하 고 2 차원 단층을 3D organoids의 전송에 대 한 인간 및 마우스 파생 된 3 차원 (3D) 위 organoids, 그리고 방법을 경작 하는 프로토콜에 설명 합니다. 재생 연구에 대 한 분석 결과 처음 상처를 소설로 위 상피 단층의 사용은 또한 기술 된다.
Abstract
위 상처 복구의 생체 외에서 연구는 일반적으로 세포질 확산 및 마이그레이션의 스크래치 상처 분석 결과에서 위 암 세포 라인의 사용을 포함 한다. 그러나 이러한 분석의 한 가지 중요 한 한계는, 그들의 균질 성 다양 한 세포 종류입니다. 복구는 여러 종류의 세포 상호 작용을 요구 하는 복잡 한 프로세스입니다. 따라서, 세포 하위, 없는 문화 공부를 우리가 복구 프로세스를 이해 하 고 있다면 극복 되어야 하는 관심사 이다. 위 organoid 모델에 의하여 세포 유형의 이기종 컬렉션 밀접 하 게 위 상피 또는 다른 기본 조직 비보의 반영이 문제를 완화 수 있습니다. 여기는 소설, 스크래치 상처 시험 생체 외에서 인간에서 파생 된 증명 또는 마우스 3 차원 organoids 다음으로 옮겨질 수 위 상피 단층 중 그대로 organoids 또는의 단일 세포 현 탁 액으로는 해리 organoids입니다. 프로토콜의 목적은 organoid 파생 된 위 상피 monolayers 위 재생 연구 소설 스크래치 상처 분석 결과 시스템에서 사용할 수 있는 설정입니다.
Introduction
처음 상처 분석 실험의 사용 수리 및 재생1,2,,34,,56공부에 대 한 인기 있는 방법입니다. 특별히 위 중생과 헬리코박터 파일로리 식민지 연구 제안 된 방법론을 사용할 수 있습니다. 과거에는, 위 암 세포 선 헬리코박터 파일로리 (헬리코박터) 감염1,2 를 공부 하는 수단으로 사용 되었습니다 했으며 최근 위 암까지 AGS 셀 등 셀 라인 선호1 ,2,,34. 위 암 세포 배양의 한계가 정리 위 상피의 세포 다양성에 그들의 실패 이다. 이 한계를 해결 하려고 하 시연 설립 및 기본 인간 및 마우스 파생 3 차원 fundic 위 organoids (FGOs)의 이동은 여기 먼저 수정 된 방법에 따라 상처 치유 분석 실험에 대 한 위 상피 단층을 Schlaermann 외에의해 설명. 7 위 상피 monolayers에서 파생 된 전단 3D 위 FGOs 또는 단일 셀 FGO 파생 된 유지 밀접 하 게 위 상피의 나타내는 편광된 세포 구성 시연 vivo에서. 위 암 셀 라인 팬 들은이 기술을 표시 셀 구성의 정보를 입증 하지 않습니다, 그는 현재 프로토콜 대체 스크래치 상처 분석 방법에 비해 장점이 있다. 이 방법론은 해리 organoids에서 단일 세포 현 탁 액 또는 전체 organoids에서 설립 하 고 지하실 멤브레인 매트릭스를 사용 하 여 도금 또는 콜라겐 코팅 monolayers 수 면 최적화 되었습니다. 이 프로토콜의 전반적인 목표는 organoid 파생 된 위 상피 단층 문화 소설 상처 치유 분석 결과 대 한 설정입니다.
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Protocol
오염 방지, 살 균 조직 문화 후드 내에서 전체 프로토콜을 수행 합니다. 승인 된 신시내티 대학 IRB 프로토콜에 따라 소매 위절제술을 받은 환자에서 인간의 fundic 조직 수집 (IRB 프로토콜 번호: 2015-4869).
모든 마우스 연구는 신시내티 대학 제도 동물 보호와 사용 위원회 (IACUC) 평가의 미국 협회 및 인증의 실험실 동물 배려 (AAALAC) 시설 유지 관리에 의해 승인 되었다.
1. 인간 파생 3D 위 Fundic Organoids 구축
참고:이 프로토콜은 이전이 랩8에 발표 된 연구에 근거한 다.
- 50 %Wnt 조절 하 고 20 %R-spondin 조절 미디어 구성 된 3D organoid 미디어를 준비 합니다.
- 단련 하는 Wnt 미디어 준비, Wnt 성장 매체에 L 셀 문화 (Dulbecco 독수리 매체 (DMEM), 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 1% 수정의 페니실린/스) 7 일, 수확, 매체 및 0.22 μ m 필터를 사용 하 여 필터링.
- R-spondin 조건 미디어를 준비 합니다. R-spondin 성장 매체에서 수정된 HEK 293T R-spondin 은닉 세포 라인을 성장 (Dulbecco 독수리 매체 (DMEM), 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 1% 수정의 페니실린/스). 2 시간 후 첨부 파일에 매체에서에서 변경 이러한 셀 OPTIMEM 성장 매체, 1% 페니실린/스. 7 일 동안 세포 문화. R-spondin 조절 미디어 수확 그리고 0.22 μ m 필터를 사용 하 여 필터링 합니다.
참고:이 프로토콜 이전 게시 되었습니다 및 자세한 프로토콜 6,,78를 참조 하십시오.
- 성장 인자 감소, 페 놀 레드 무료 지하실 멤브레인 매트릭스 4 ° c.에 얼음에 16 h에 대 한 해 동 에는 얼음 차가운 캘리포니아2 +/Mg2 +조직 수집-큰 플라스틱 용기에 DBPS 무료. 시작 단계 1.4까지 얼음에 저장 합니다.
참고: 조직 소매 위절제술을 받은 환자에서 수집 됩니다. - 집게를 사용 하 여 세척 살 균 비 커 100ml Ca2 +/Mg2 +포함 하에서 적극적으로 조직-Dulbecco의 인산 염 버퍼 염 분 (DPBS) 무료. 세척 약 30 s 또는 파편과 혈액 제거 되었습니다 때까지. 다음, 멸 균 거 즈를 사용 하 여, 상피에서 점액 레이어를 멀리 닦으십시오.
- 조직의 힘과 근육 층을 파악, 멀리는 곡선된 hemostatic 포 셉을 사용 하 여 상피를 긁어 단단히 포 셉을 사용 하 여. 살 균, 폴리스 티 렌 페 트리 접시에 긁힌 것된 상피 파편을 수집 합니다.
- 상피 조직 조직 소화를 최적화 하기 위해 면도기를 사용 하 여 약 2.0 x 2.0 m m2 크기의 조각으로 말하다. 캘리포니아2 +/Mg2 + 조직 파편을 씻고-DBPS 항생제로 보충 무료 (캘리포니아2 +/Mg2 + -무료 DPBS, 1% 페니실린/스, 0.25 mg/mL 암포 B 10 mg/mL Gentamicin, 50 mg/mL 대) 때까지 세척은 혈액의 무료입니다. 필요한 경우 여러 세척을 수행 합니다. 신중 하 게 폐기물 비 커에 씻어 멸 균 거 즈를 통해 필터링 하 여 세척을 삭제 합니다.
- 수집 25 m m 저 어 바와 미리 데워 부 화 미디어 플라스 크 하단 라운드 125 mL 유리에 파편을 씻어 (2 m L-글루타민, 1% 보충 기초 미디어 페니실린/스, 10 mM HEPES 버퍼, 1 mg/mL 콜라 타입 1, 2 mg/mL 세포 배양 학년 소 혈 청 알 부 민). 고무 격 막과 둥근 바닥 플라스 크를 밀봉 하십시오.
- septa에 20 G 척수 바늘을 삽입 하 고 고무 뿌리고와 산소 탱크에 연결. 어떤 오염 물질을 필터링 하려면 필터를 만드는 튜브에 휴지를 삽입 합니다. 낮은에 산소 유출 켭니다. 격 막의 파열을 피하기 위해 septa에 10-15 유출 바늘을 삽입 합니다.
- 클램프를 사용 하 여 링 스탠드에 최대 집합을 장악 하 고 37 ° c 30-45 분 동안 저 어 플레이트 보정 물 욕조에 배치. 후 조직 15 분 동안 배양 되어, 천연된 샘에 대 한 시각적으로 부 화 미디어의 50 µ L을 제거 합니다. 선 밀도 또는 하지 않은 경우 추가 5-10 분 동안 떠나 조직 으로부터 분리.
- 50 mL을 추가, 부 화 직후 살 균 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 부 화 미디어 또는 외피 혼합물에 직접 붓는 의해 미리 DMEM/F12를가 열.
- 4 50 mL 원뿔 튜브로 멸 균 거 즈를 통해 선 혼합물을 필터링 합니다. 추출 된 땀 샘 원뿔 튜브의 하단에 정착 수 있도록 15 분 동안 얼음에 여과 액을 유지 합니다. 수 정착된 동맥 방해, 제거 하 고 상단 표면에 뜨는 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 40 mL을 삭제 하지 않도록 주의 하십시오. 항생제로 보충 하는 DPBS의 10 mL에 나머지 10 mL를 resuspend.
- 5 mL 셀 문화 시험관으로 혼합물을 균등 하 게 배포 합니다. 4 ° C에서 65 x g에 5 분 동안 centrifuge 고 상쾌한 한 피 펫을 사용 하 여 신중 하 게 제거 합니다. 피 펫 또는 200 µ L 넓은 피 펫 팁을 사용 하 여 해 동된 지하실 멤브레인 매트릭스에 선 펠 릿 resuspend 동 질 때까지 섞는다.
참고: 얼음에이 단계를 수행 하 고 혼합 하는 동안 지하실 멤브레인 행렬의 합을 피하기 위하여 결정적 이다. 또한, 그것은 시각적으로 선 밀도 50 µ L에 대 한 샘플링 검사 하는 것이 중요입니다. 최적의 밀도 ~ 70 %confluency입니다. - 다음으로, 지하실 멤브레인 매트릭스 넓은 스쳐 피 펫을 사용 하 여 50 µ L에 선 접시. 도금 하는 동안 모든 거품을 생성 하지 마십시오.
- 37 ° c.에 10-15 분 동안 품 어 유해를 지하실 멤브레인 매트릭스를 허용 하려면 12 잘 문화 접시에 도금 하는 경우 추가 hFGO 미디어의 1 mL (고급 Dulbecco의 수정된이 글 매체/F12 매체 보충 2 mM L-글루타민, 1% 페니실린/스, 0.25 mg/mL 암포 B 10 mg/mL Gentamicin, 50 mg/mL 대, 10 mM HEPES 버퍼, 1 m m n-Acteylcystine, 1 x N2, B27, Wnt 조절 매체 50%, 20% R spondin 조절 매체 100 ng/mL으로 보충 1 뼈 morphogenetic 단백질 억제제, 1 nM gastrin, 50 ng/mL 표 피 성장 인자, 200 ng/mL 섬유 아 세포 성장 인자 10, 10 니코틴, 및 10 µ M Y-27632 바위 억제제) 잘 당. 그렇지 않으면 12-잘 문화 접시를 사용 하 여 추가 지하실 멤브레인 매트릭스 거품 잠수함 충분 한 미디어.
- 5% CO2 습도 셀 문화 인큐베이터에서 37 ° C에서 세포 문화. 모든 4-5 일 미디어를 변경 합니다.
2. 마우스 파생 3D 위 Fundic Organoids 구축
참고:이 프로토콜은 이전에 게시 6되었습니다. 얼음 지하실 멤브레인 매트릭스를 해 동 하 고 시작 하기 전에 모든 시 약 준비.
- 연구 수행 되 고 있는 연구 기관에 의해 승인 메서드를 사용 하는 쥐를 희생. 마우스에서 위를 제거 하 고 이전에 게시 프로토콜 6따라 해 부. 20 mL 얼음 차가운 캘리포니아2 +/Mg2 +세척-DBPS 무료.
참고: C57BL/6 마우스, 세 8-10 주 fundic 위 organoid 문화에 대 한 사용 됩니다. 쥐 위 제거 하기 전에 수동 경부 전위 뒤 이산화탄소의 흡입에 의해 안락사 되었다. - 위장에서 근육 층을 제거 하 고 모든 보이는 혈관 이전 6출판.
- 동굴에서 살 균 면도날을 사용 하 여 forestomach는 저를 구분 합니다. 작은 수술가 위를 사용 하 여 파편 약 2.0 x 2.0 m m. 집게를 사용 하 여에 컷된 저 EDTA 인큐베이션 버퍼를 포함 하는 15 mL 원뿔 튜브에 파편을 수집 (캘리포니아2 +/Mg2 +-무료 DPBS, 5 mM EDTA)와 함께 2 h 4 ° C에서 품 어 부드러운 동요입니다.
- 살 균 후드, 원뿔 관 두고 그대로 조각 가능한 많은 외피 버퍼를 제거 하는 피 펫을 사용 하는 약 5 분에 대 한 얼음 조각. 추가 버퍼를 떨고 5 mL (1 g D-솔 비 톨, 100 ml Ca2 +/Mg2 +1.47 g 자당-DPBS 무료) 2 분 허용 정착 하 고 서둘러, 1000 p 피 펫을 사용 하 여 제거 아직 정착 해야 작은 조각 큰 조각 힘으로 손으로 흔들어 상위 계층.
- 65 x g에서 4 ° C에서 5 분 동안 제거 조각 회전.
- 공기 거품을 피하 면 서,는 상쾌한을 제거 하 고 지하실 멤브레인 매트릭스에 resuspend 때까지 균질 성 혼합.
- 넓은 팁 피 펫을 사용 하 여 잘 당 50 µ L에서 지하실 멤브레인 매트릭스 접시와 다음 20 분 동안 37 ° C에서 품 어.
- 충분 한 mFGO 성장 매체 추가 (고급 Dulbecco의 수정이 글 매체/F12 매체 2 mM L-글루타민, 1% 페니실린/스, 10mm 보충 HEPES 버퍼, 1 m m n-Acteylcystine, 1 x N2, 1 x B27, 50 %Wnt 조절 매체, 20% R spondin 조절 매체와 100 ng/mL 뼈 morphogenetic 단백질 억제제, 10 nM gastrin, 50ng/mL 표 피 성장 인자, 10 ng/mL 섬유 아 세포 성장 인자 10, 10 µ M Y-27632 바위 억제제 보충) 거품 잠수함.
- 37 ° C, 5% CO2 습도 셀 문화 인큐베이터에서 세포 문화. 모든 4-5 일 미디어를 변경 합니다.
3. 콜라겐 코팅 2D 전송
참고: 별도로 지정 하지 않는 한 무 균 조직 문화 후드에 모든 절차를 수행 합니다. 콜라겐은 단층을 3D organoids를 전송 하기 전에 24 시간 코팅을 시작 합니다. 얼음에 쥐 꼬리 콜라겐을 유지 하 고 빛 으로부터 차폐 된. 콜라겐 코팅 접시는 최대 2 주에 대 한 좋은. 코팅된 접시를 즉시 사용 하지, 경우 랩 parafilm 및 필요한 때까지 4 ° C에서 저장소 접시.
- 쥐 꼬리 콜라겐 20 m m 초 산을 사용 하 여 50 µ g/mL로 희석.
- 충분히 희석된 콜라겐과 우물의 표면 커버. 표준 12-잘 접시에 한 잘, 콜라겐의 약 1 mL와 함께 코트. 살 균 후드에 실 온에서 하룻밤 둡니다.
- 캘리포니아2 +/Mg2 +1 mL로 두 번 세척-DPBS 잘 당 고 떠나 살 균 후드에 실 온에서 2 h에 대 한 발견.
4. 지하실 멤브레인 매트릭스 코팅 2D 전송
참고: 별도로 지정 하지 않는 한 무 균 조직 문화 후드에 모든 절차를 수행 합니다. 지하실 막 매트릭스 2 h는 단층을 3D organoids를 전송 하기 전에 코팅을 시작 합니다. 얼음에 지하실 멤브레인 매트릭스를 유지. 코팅된 판 즉시 사용할 수 있으며 시간의 오랜된 기간 동안 저장할 수 없습니다.
- 지하실 막 매트릭스 셀 문화 학년 물 15 mL 원뿔 튜브에 1:10 희석 비율. 얼음에 희석.
- 표준 12-잘 접시의 각 잘 희석된 지하실 멤브레인 매트릭스의 100 µ L를 추가할는 피 펫을 사용 하 여. 셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여 균등 하 게도 코트 잘 걸쳐 희석된 지하실 멤브레인 매트릭스를 배포 합니다.
- 1 시간 동안 37 ° C에서 품 어.
- 피 펫을 사용 하 여 잔여 물을 제거 하 고 3D organoids를 전송 하기 전에 1 시간 실 온에서 건조.
5. 2D 위 상피 세포 Monolayers 3D m/hFGOs의 전송
- 후 3D 마우스-또는 인간-파생 된 FGOs에 6-7 일에 대 한 교양 있다, 2D 단층을 3D organoids의 전송을 시작 합니다.
참고: 필요한 단층의 각 잘이 좋습니다 300 그대로 organoids 또는 300 organoids에서 파생 된 단일 셀을 사용 하 여. 강력한 문화에서 그것 약 150 organoid/잘 12 잘 문화 배지 내의 얻을 예정 이다. - 접시는 전송 하기 전에 코팅 해야 합니다.
그러나 참고: 지하실 멤브레인 매트릭스 코팅 접시 반투명 젤 레이어,, 콜라겐 코팅 판 코팅의 어떤 명백한 표시 없는 것입니다. - 직접 pipetting 1 mL 균 캘리포니아2 +/Mg2 +여 접시에서 3D 지하실 멤브레인 매트릭스 거품을 꺼내-거품의 중심에 DBPS 무료.
- 피 펫을 사용 하 여, 셀 문화 테스트 튜브로 지하실 멤브레인 매트릭스, organoid 혼합물을 수집 합니다. 튜브 당 2 지하실 멤브레인 매트릭스 거품의 비율로 수집 합니다. 40 x g와 4 ° C에서 5 분 동안 원심 분리기
- 진공 시스템을 사용 하 여 제거는 상쾌한 그리고 최대한 많은 지하실 멤브레인 매트릭스. 캘리포니아2 +/Mg2 +4 ml에서 resuspend-무료 DBPS, 상쾌한를 제거 하 고 2-3 회 반복. 전체 organoid 전송 프로토콜에 대 한 5.10 단계로 진행 합니다. 5.7 단일 셀 서 스 펜 션 프로토콜에 대 한 단계를 계속 합니다.
- 37 ° C에 세포 분리 솔루션을 미리 따뜻한 고 각 시험관에 1 mL를 추가 합니다. 부드럽게 튜브를 반전 하거나 한 피 펫으로 아래로 pipetting으로 혼합. 37 ° c.에서 10 분 동안 품 어
- 캘리포니아2 +/Mg2 +의 2 개 mL를 추가-각 테스트 튜브에 직접 DBPS 무료.
- 26 G 바늘을 사용 하 고 주사기는 혼합 2-3 번. 시각적으로 하나의 셀에 대 한 확인 합니다. Organoids 또는 셀의 클러스터는 여전히 1-2 번 더 주사기.
- 4 ° c.에서 5 분 동안 40 x g에서 원심 분리기 2D FGO 미디어에 펠 릿을 resuspend (2D 마우스 FGO 성장 매체: 고급 Dulbecco의 수정된이 글 매체/F12 매체 보충 2 m L-글루타민, 10mm 페니실린/스, 10% 태아 종 아리 혈 청, 10 mM HEPES 버퍼, 1 x N2, 1 x B27, 10 nM gastrin, 50 ng/mL 표 피 성장 인자, 1 µ M TGF-β 억제제와 10 µ M Y-27632 바위 억제제 보충. 2D 인간의 FGO 성장 매체: 고급 Dulbecco의 수정된이 글 매체/F12 매체 보충 2 mM L-글루타민, 1% 페니실린/스, 10 mM HEPES 버퍼, 10% 태아 종 아리 혈 청, 10mm 니코틴, 1 x N2, 1 x B27, 50 mg/mL 대, 50 ng/mL 상피 성장으로 보충 요인, 그리고 10 µ M Y-27632 바위 억제제, 1 µ M TGF-β 억제제).
- 코팅된 판에 물의 resuspension 플레이트입니다. 37 ° c.에 번호판을 품 어 교체 미디어 매 4 일 또는 이전 미디어 노란색. 단층 형태로 약 4 일이 필요합니다.
6. 스크래치 상처 분석 결과 2D 위 상피 세포 Monolayers를 사용 하 여
- 문화에는 100 %confluency 도달 했습니다 때 면도날을 사용 하는 단층 스크래치.
- 실 온에서 15 분 동안 3.7% 포름알데히드를 사용 하 여 monolayers를 수정 합니다. 실 온에서 20 분 동안 0.5% 비 이온 세제/PBS와 permeabilize.
- 다음 실 온에서 1 h에 대 한 혈 청 2% 당나귀와 monolayers를 차단 하 고 H+, K+의 1:1000 희석을 품 어-ATPase 1 차적인 항 체 하룻밤 4 ° C에서 0.1% 비 이온 세제/PBS로 세척 및 당나귀의 1: 100 희석으로 품 어 반대로 마우스 488 이차 항 체 및 10μg/mL Hoechst 세포 핵의 실 온에서 1 시간을 위한 얼룩.
- 2D 인간 파생 위 단층 문화에 표면 점액 핏 셀을 확인 하려면 셀 20 μ g /mL Ulex europaeus (UEAI) FITC 켤레의 얼룩. 이미지는 confocal 현미경에 monolayers.
- 상처 마다 몇 h. 스크래치 것입니다 다시는 단층의 품질에 따라 24-48 h와 환자 사이 사이 epithelialize의 이미지를 가져가 라.
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Representative Results
Organoids는 인간의 코 퍼스/본문 또는 마우스 위 조직 (그림 1A)의 저에서 파생 되었다. 콜라 또는 인간 또는 마우스 파생 된 위장 조직의 EDTA 소화 후 각각 샘 지하실 멤브레인 매트릭스에 포함 되며 6-7 일 (그림 1A)에 대 한 교양. 그림 1B 인간 파생 위 organoids (huFGOs) 다음 위 상피 단층 (huGEM)로 지하실 멤브레인 매트릭스 코팅 챔버 슬라이드에 전송 되었습니다의 형성을 보여 줍니다. 4 일 후 문화, confluent huGEMs 스크래치 상처 분석 실험 (그림 1B)에 사용 되었다. 이미지는 24 시간 (그림 2)의 기간 동안 문화 안에 상처 폐쇄를 보여준 huGEM의 시간 경과 분석에서 수집.
HuGEMs 주요 세포 계보를 표현 하는 네이티브 위 조직에 발견 발견 했다. 면역 형광 염색 법 공개 (그림 3B, C) 정수 리와 표면 점액 (그림 3B, D)로 구성 되어 편광된 전자 cadherin 긍정적인 단층의 식 세포. 이 monolayers에서 수집 하는 RNA를 사용 하 여 PCR 분석 수석 및 점액 목 셀 (그림 3E) 뿐만 아니라 정수 리 및 표면 점액 세포의 식을 확인 했다. Confluent huGEMs는 또한 몇 가지 proliferating 셀을 (그림 3 층)을 표현 했다. 스크래치 상처 분석 결과 내에서 이러한 주요 세포 계보의 분석 24 시간 기간 (그림 4A, B), 정수 리, 점액 목 표면 점액 세포의 지속적인된 표현을 밝혔다. 샨 다, 이러한 데이터 위 재생에서 생체 외에서새로운 문화 시스템으로 huGEMs 사용 하 여 보여 줍니다.
그림 1: 인간 파생 위 organoids (huFGO) 및 기본 위 상피 monolayers (huGEM)의 세대. (A) 인간의 위 조직 및 마우스 위장의 대표 이미지 organoid 문화에 대 한 땀 샘을 생성 하는 데 사용. 개설한 지역을 마우스 위 fundic 영역을 나타냅니다. (B) 인간 파생 위 organoids (huFGOs) 인간 파생 된 위 상피 monolayers (huGEMs)의 문화에 사용 되는의 세대. 부상된 영역을 보여주는 스크래치 후 huGEM의 대표 이미지. 눈금 막대 500 μ m = 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 스크래치 상처 분석 결과. 처음 상처 후 0, 8, 16, 및 24 시간 대표 이미지가 huGEM를 사용 하 여 시간 경과 실험에서 수집. 눈금 막대 500 μ m = 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: huGEM 문화에서 주요 세포 계보의 식. 면역 형광 염색 huGEM 문화 (A) 전자 cadherin (Ecad, 레드)의 식을 보여주는 표면 점액 세포 (UEAI, 녹색) 및 핵 (Hoechst, 블루) 및 (B) 전자 cadherin (Ecad, 빨간색), 정수 리 세포 (홍콩, 녹색) 및 핵 ( Hoechst, 블루)입니다. 별도 채널 (C) 와 (D)에 표시 됩니다. (E) RT-PCR++K H의 식에 대 한 huGEMs에서 추출한 RNA를 사용 하 여 수행 되었다-ATPase (ATP4a), pepsinogen C (PgC) MUC5AC, 및 MUC6. (F) Proliferating 세포를 huGEM에서 듀 (레드) 통풍 관에 의해 결정 됩니다. (A-D) 바 규모 50 μ m, 규모 = 바 (F) = 100 μ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 스크래치 상처 분석 결과에서 셀 리니지 식의 변화. 면역 형광 검사 huGEM 문화 E cadherin (Ecad, 레드)의 식을 보여주는 얼룩 또는 huGEM 0, 8, 16, 및 24 시간 게시물에서 수집 하는 슬라이드를 사용 하 여 표면 점액 세포 (UEAI, 녹색) 또는 정수 리 세포 (홍콩, 녹색)와 핵 (Hoechst, 블루) 스크래치-상처. Bkgrd = 배경 슬라이드에 지하실 멤브레인 매트릭스의 얼룩. XY 축 눈금 막대 0-400 μ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 마우스 3D 미디어 | 재고 솔루션 | 작업 농도 |
| nAcetylcysteine | 분말 | 1mm |
| Gastrin | 10 Μ M | 10 nM |
| EGF | 500 µ g/mL | 50 ng/mL |
| 머리 | 100 µ g/mL | 100 ng/mL |
| FGF10 | 100 µ g/mL | 100 ng/mL |
| YCMD | 10 m m | 10 Μ M |
| B27 | 50 x | 1 x |
| N2 | 100 x | 1 x |
| 펜/Strep | 1 M | 10 m m |
| HEPES | 1 M | 10 m m |
| Glutamax | 200 mM | 2 mM |
| WNT | 50 %v / v | |
| R-Spondin | 10 %v / v |
표 1: 마우스 3D 미디어 구성 요소입니다.
| 마우스 2D 미디어 | 재고 솔루션 | 작업 농도 |
| FCS | 100% | 10% |
| YCMPD | 10 m m | 10 Μ M |
| Gastrin | 10 Μ M | 10 nM |
| EGF | 500 µ g/mL | 50 ng/mL |
| B27 | 50 x | 1 x |
| N2 | 100 x | 1 x |
| 펜/Strep | 2입니다. | 10 m m |
| HEPES | 2입니다. | 10 m m |
| Glutamax | 200 mM | 2 mM |
| TGF-β 억제제 | 10 m m | 1 Μ M |
표 2: 마우스 2D 미디어 구성 요소입니다.
| 인간의 3D 미디어 | 재고 솔루션 | 작업 농도 |
| 니코틴 | 분말 | 10 m m |
| nAcetylcysteine | 분말 | 1mm |
| Gastrin | 10 Μ M | 1 nM |
| EGF | 500 µ g/mL | 50 ng/mL |
| 머리 | 100 µ g/mL | 100 ng/mL |
| FGF10 | 100 µ g/mL | 200 ng/mL |
| YCMD | 10 m m | 10 Μ M |
| B27 | 50 x | 1 x |
| N2 | 100 x | 1 x |
| 펜/Strep | 1 M | 10 m m |
| HEPES | 1 M | 10 m m |
| Glutamax | 200 mM | 2 mM |
| 대 | 1 M | 10 m m |
| 암포 B/Gentamycin | 125 µ g/mL | 1mm |
| WNT | 50 %v / v | |
| R-Spondin | 10 %v / v |
표 3: 인간의 3D 미디어 구성 요소입니다.
| 인간의 2D 미디어 | 재고 솔루션 | 작업 농도 |
| FCS | 100% | 10% |
| YCMPD | 10 m m | 10 Μ M |
| Gastrin | 10 Μ M | 1 nM |
| EGF | 500 µ g/mL | 50 ng/mL |
| B27 | 50 x | 1 x |
| N2 | 100 x | 1 x |
| 펜/Strep | 1 M | 10 m m |
| HEPES | 1 M | 10 m m |
| Glutamax | 200 mM | 2 mM |
| TGF-β 억제제 | 10 m m | 1 Μ M |
| 니코틴 | 분말 | 10 m m |
| 대 | 1 M | 10 m m |
표 4: 인간의 2D 미디어 구성 요소입니다.
| 실험 문제 | 문제 해결 팁 |
| Monolayers는 organoids에서 양식에 실패 | 이 프로토콜에 대 한 1) 최적의 자란 조건 실험 요구 사이 다. 인간 및 마우스 monolayers organoids에서 파생 된 유리 또는 플라스틱 문화 요리를 사용 하 여 희석된 지하실 멤브레인 매트릭스를 사용 하 여 배양 한다. 그러나, 쥐 꼬리 콜라겐은 마우스의 단층 실험에 적합 또는 폴 리 에스테 르 막 요구 하는 인간의 기원 삽입. 2) 최적의 자란 상태를 실험 설정에 따라 다릅니다. 반면에 그대로 organoids 2D FGO 미디어와 교양 문화 단일 세포 현 탁 액을 사용 하 여 이상적으로 3D FGO 미디어와 교양. |
| Monolayers에서 파생 된 세 환자 (> 55 년) 또는 마우스 (> 18 개월) 성장 하 고 confluency에 도달 실패 | 세 쥐에서 수집 위 티슈를 사용 하 여 경우 (> 18 개월) 또는 환자 (> 55 세)는 단층의 생성에 사용 된 organoids의 밀도 organoids의 성장 효율 감소 배가 되어야 한다. |
| Organoids 동맥에서 양식에 실패 | (가능 하면 새로 구입한)는 신선한 것이 좋습니다 gastrin 사용할 수. 4 개월 마다 갓 다시 중단된 gastrin를 사용 합니다. |
| Organoids 연결 하 고 monolayers 형성 실패 | 지하실 막 매트릭스의 효율적인 제거 organoids monolayers에 대 한 문화 판 전송에 대 한 수확 후 달성 되었습니다 확인 하십시오. |
| 문화에서 파생 된 세 환자 (> 55 년) 또는 마우스 (> 18 개월) 실패 | 소화와 인큐베이션 기간 동안 5 분 간격으로 필요에 따라 외피의 뒤 초기 보육의 15-30 분은 충분 합니다. 그것은 55 세 이상의 환자 동맥 더 쉽게 해리 되 고 그러므로 더 적은 소화를 요구 할 수 있습니다 주목 해야한다. 마찬가지로 세 환자에서 파생 된 FGOs 원심 분리에 느린 성장 시간과 감도 증가 표시 있다. 최상의 결과 얻으려면 세 조직으로 작업할 때 모든 초과 원심 분리를 제한 하 고 적시에 미디어를 대체 합니다. |
표 5: 문제 해결 팁. 발생된 문제 및 최적의 설립과 인간의 문화에 대 한 권장된 해상도 또는 마우스 위 monolayers.
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Discussion
현재 프로토콜 세부 인간 및 마우스 파생 된 위 상피 monolayers 스크래치 상처 분석 실험을 위해 사용 될 수 있는 설립. 프로토콜 주민 줄기 세포 주 인간 (또는 마우스)에서 절연 조직의 개념에 의존 하 고는 수정 된 프로토콜 처음 발행 Schlaermann 외7. 특히, 우리는 합칠 확립 여기 프로토콜을 최적화 하 고 어떤 표현 주요 세포 계보 vivo에서위 상피 내에서 찾을 수 있는 위 상피 단층 편광. 위계 양 수리 조직 재 epithelialization, 재생, 및 확산9,,1011를 포함 하는 복잡 한 프로세스입니다. 특히, 우리 연구소는 위 상피의 재생 재생 위 샘 내 궤 양 여백에 spasmolytic polypeptide/개미 자리의 요소 (TFF) 2 표현 metaplasia (SPEM)의 출현으로 일치 보고 12,13. SPEM 부상으로 나온다 고 사라진다는 점 막의 정상적인 세포질 구성12반환 될 때 점액 세포 metaplasia14 에 수석 세포 계보의 transdifferentiation로 정의 됩니다. 따라서, 체 외에 시스템에서 이러한 메커니즘 연구, 문화 내에서 최고 셀 등 주요 세포 계보 있는지 필수적 이다.
스크래치 상처 분석의 사용의 수리 및 재생, 연구에 대 한 광범위 하 게 사용 되었습니다 그리고 최근까지 위 암 세포 선이 사용된1,2,,34했다. 위 암 세포 선을 사용 하 여 기본적인 기계 장치 계시는, 이러한 문화 변형 되 고 네이티브 위장 조직 세포 다양성 부족. HuGEMs 편광과 다양 한 세포질 구성 위 상피 비보를 밀접 하 게이 유지 하기 위해 표시 됩니다. 또한, 후에 문화는 최적의 조건에서 최대 한 달 동안 유지 될 수 있다 confluency huGEM 도달. 확장 된 문화 장기 실험 하실 수 있습니다. 따라서, 간주 될 수 있는 huGEMs의 미래 응용 프로그램 단층/면역 세포 공동 문화 및 헬리코박터 파일로리 병의 연구에 대 한 장기 실험 포함 됩니다.
현재 프로토콜에 주의 하는 중요 한 기술적 측면을 확인 하 고 있습니다. 첫 번째 기술 포인트는 지하실 멤브레인의 구성 요소 선택 실험에 사용 되는 세포 문화 표면에 따라 달라 집니다. 최적의 단층 조건에 도달 되도록 그 콜라겐 monolayers 실험 폴 리 에스테 르 막 삽입과 함께 접시를 필요로 할 때 사용 됩니다 것이 좋습니다. 그러나, 유리 또는 플라스틱 문화 표면, 단층 실험에서 요구 하는 경우 희석된 지하실 멤브레인 매트릭스 코팅의 최적의 선택 이다. 둘째, confluent 단층을 도달 하는 데 필요한 organoids의 밀도 위 티슈를 수집 하는 환자의 나이 따라 조정 해야 합니다. 세 쥐에서 수집 하는 조직에 대 한 (> 18 개월) 또는 환자 (> 55 년), 개인 세 감소 성장 수 용량에 따른 단층에 전송 하는 경우 사용 organoid 밀도 증가 두 해야. 소화와 노인된 환자에서 파생 된 인간 직물의 외피, 동안 샘 수 있습니다 더 원심 분리 하 고 따라서: 가급적 부지런히, 대체 가능한, 2) 미디어 고 3) 소화 하는 동안 centrifuged 1) 5 분 후의 증분 소화와 15 ~ 30 분의 외피는 소화에의 가능성을 줄일 것 이다. 단일 셀 organoid 파생 정지에서 monolayers를 형성 하는 때 마지막으로, 3D FGO 미디어는 2D FGO 미디어 최고의 효율을 관찰 되었습니다 그대로 organoids에서 경작 하는 때 반면에 monolayers의 적절 한 형성 가장 적합 합니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 NIH (NIDDK) 5에 의해 지원 되었다 R01 DK083402-07 부여 (YZ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced Dulbecco's modified Eagle/F12 medium (basal media) | Life Technologies | 12634-010 | |
| GlutaMAX (L-glutamine) | Life Technologies | 25030-081 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Scientific | SV30010 | |
| Amphotericin B/Gentamicin | Thermo Scientific | R01510 | |
| Kanamycin | Thermo Fisher | RO1510 | |
| HEPES Buffer | Sigma Aldrich | H0887 | |
| n-Acetylcystine | Sigma Aldrich | A9165 | |
| N2 | Life Technologies | 17502-048 | |
| B27 | Life Technologies | 12587-010 | |
| BMP Inhibitor (Noggin) | Pepro Tech | 250-38 | |
| Gastrin | Tocris | 3006 | |
| EGF | Pepro Tech | 315-09 | |
| FGF10 | Pepro Tech | 100-26 | |
| Nicotinamide | Sigma Aldrich | N0636 | |
| Y-27632 ROCK Inhibitor | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| TGF-β Inhibitor | Tocris | 2939 | |
| Ca2+/Mg2+ -free DPBS | Fisher | 21-031CV | |
| Dulbecco's modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 12634-010 | |
| Fetal Bovine Serum | FBS | ||
| OPTIMEM | Invitrogen | ||
| 0.22µM filter | Fisher | 099-720-004 | |
| 37 °C Water Bath | |||
| Collagenase Type 1 | Worthington | LS004214 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9418 | |
| Kimwipes (tissue paper) | Fischer Scientific | 06-666C | |
| 125 mL round bottom flask | |||
| 1 in (25 mm) stir bar | |||
| Rubber Septa | |||
| Sterile Gauze | |||
| Stir Plate | |||
| Ring Stand | |||
| Ring Stand Clamps | |||
| Sterile petri dish | |||
| 18 G needles of 1.5 in length | Thermo Fisher | 305196 | |
| 20 G spinal needles of 3.5 in length | Thermo Fisher | 405182 | |
| 12-well cell culture treated plate | Midwest Scientific | 92012 | |
| Growth Factor Reduced, Phenol Red-free MatrigelTM (Basement membrane matrix) | Fisher | CB-40230C | |
| Sterile Razor Blades | |||
| Wide-tip tweezers | |||
| Curved Hemostatic Forceps | |||
| 200 µL wide pipette tips | Thermo Fisher | 02-707-134 | |
| 5 mL cell culture test tubes | Fisher | 14-956-3C | |
| Oxygen Tank with rubber hosing | |||
| 1 g D-Sorbitol | |||
| Sucrose | Fisher | SS-500 | |
| Dissecting microscope | |||
| Dissecting Tray | |||
| Rocking Table | |||
| Rat Tail Collagen Type 1 | Life Technologies | A10483-01 | |
| Cell culture grade glacial acetic acid | Fisher | A38-212 | |
| Cell culture grade water | Corning | 25-055-CV | |
| 2-well chamber slide | Thermo Fisher | 155380 | |
| 12-well Transwell (polyester membrane inserts) | Corning | 3460 | |
| Cell scraper | Corning | 353086 | |
| Accutase (cell detachment solution) | Stemcell Technologies | 7920 | |
| 263/8 G syringe | Thermo Fisher | 309625 | |
| Razor blade | |||
| L Cells | L cells, a Wnt3a producing cell line, were received as a gift from Dr. Hans Clevers (Hubrecht Institute for Developmental Biology and Stem Cell Research, Netherlands). | N/A | |
| HEK-293T Rspondin secreting cells | A modified HEK-293T R-spondin secreting cell line was obtained from Dr. Jeff Whitsett (Section of Neonatology, Perinatal and Pulmonary Biology, Cincinnati Children's Hospital Medical Centre and The University of Cincinnati College of Medicine, Cincinnati, USA ). | N/A | |
| HK-ATPase Primary Antibody | Invitrogen | SC-374094 | |
| E-Cadherinn | SantaCruz | sc-59778 | |
| UEA1 | Sigma Aldrich | L9006 | |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher | H3570 | |
| Alexafluor 488 secondary antibody (Donkey anti-mouse 488 secondary antibody) | ThermoFisher Scientific | R37114 |
References
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