Summary
هنا يمكننا وصف بروتوكول لإنشاء واستزراع المستمدة من الإنسان والفأر ثلاثية الأبعاد (3D) المعدة أورجانويدس، والطريقة لنقل أورجانويدس ثلاثي الأبعاد إلى أحادي الطبقة 2-الأبعاد. كما يتم وصف استخدام أحادي الطبقة الظهارية المعدة مقايسة الصفر-الجرح رواية لدراسات التجديد.
Abstract
الدراسات في المختبر لإصلاح الجرح المعدة عادة ما ينطوي على استخدام خطوط خلايا سرطان المعدة في مقايسة الصفر-الجرح انتشار الهاتف الخلوي والهجرة. واحد الحد الحرج من هذه الاختبارات، غير أن على تشكيلة متجانسة من أنواع الهاتف الخلوي. الإصلاح هو عملية معقدة تتطلب التفاعل بين العديد من أنواع الخلايا. ولذلك، لدراسة ثقافة خالية من الأنواع الفرعية الخلوية، هو مصدر قلق يجب التغلب عليها إذا أردنا أن نفهم عملية الإصلاح. نموذج أورجانويد المعدة قد تخفف من هذه المسألة حيث المجموعة غير متجانسة من أنواع الخلايا ويعكس عن كثب ظهارة المعدة أو غيرها الأنسجة الأصلية في فيفو. تظاهر هنا هو الرواية، و في المختبر فحص الصفر-الجرح المستمدة من الإنسان أو نات بالماوس أورجانويدس 3 الأبعاد التي يمكن ثم نقل إلى أحادي الطبقة الظهارية المعدة أما أورجانويدس سليمة أو كتعليق خلية مفردة أورجانويدس. وهدف البروتوكول هو إنشاء مونولاييرس طلائي المعدة المستمدة من أورجانويد التي يمكن استخدامها في نظام رواية الصفر-الجرح مقايسة لدراسة تجديد المعدة.
Introduction
استخدام فحوصات الصفر-الجرح طريقة شائعة لدراسة إصلاح وتجديد1،2،،من34،،من56. يمكن استخدام المنهجية المقترحة للدراسة على وجه التحديد التجدد المعدة واستعمار الملوية البوابية . في الماضي، استخدمت خطوط خلايا سرطان المعدة كوسيلة لدراسة الإصابة جرثومة الملوية البوابية (H. pylori)1،2 وحتى الإصابة بسرطان المعدة مؤخرا كانت خطوط الخلايا مثل الخلايا AGS يفضل1 ،2،،من34. واحد الحد من الثقافات خلية سرطان المعدة هو فشلهم في الخص الخلوية تنوع ظهارة المعدة. في محاولة لمعالجة هذا القصور، أثبت هنا هو إنشاء ونقل الأولية المستمدة الإنسان والفأر 3 الأبعاد فونديك المعدة أورجانويدس (فجوس) لأحادي الطبقة الظهارية المعدة لفحوصات شفاء الجرح استناداً إلى أسلوب تم تعديل الأول ووصف شلايرمان وآخرون. 7 نثبت أن المعدة مونولاييرس طلائي المستمدة من المنفصمة 3D فجوس المعدة أو المستمدة من فجو الخلايا المفردة الاحتفاظ تكوين خلوي استقطاب الذي يمثل تعاونا وثيقا ظهارة المعدة المجراة في. نظراً لأن خطوط خلايا سرطان المعدة لا تثبت تكوين الخلية يعرض هذا الأسلوب، قد البروتوكول الحالي ميزة على أساليب بديلة الصفر-الجرح المقايسة. وقد تم تحسين هذه المنهجية مونولاييرس يمكن المنشأة من أورجانويدس كله أو من تعليق خلية واحدة من أورجانويدس منفصلان ومطلي باستخدام مصفوفة غشاء أو الكولاجين-طلاء بموجبها. والهدف العام من هذا البروتوكول إنشاء أورجانويد اشتقاق ثقافات أحادي الطبقة الظهارية المعدة مقايسة شفاء جرح رواية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
لتجنب التلوث، تنفيذ البروتوكول في مجملها داخل غطاء زراعة الأنسجة عقيمة. الأنسجة البشرية فونديك جمعت من المرضى الذين يخضعون للأكمام gastrectomy وفقا للبروتوكول المعتمد الكندي جامعة سينسيناتي (رقم بروتوكول مجلس الهجرة واللاجئين: 2015-4869).
وافق جميع الماوس الدراسات جامعة سينسيناتي مؤسسات الرعاية الحيوانية واستخدام اللجنة (إياكوك) الذي يحافظ على منشأة "الرابطة الأمريكية للتقييم" والاعتماد لمختبر الحيوان الرعاية (آآلاك).
1-إنشاء المستمدة من الإنسان 3D المعدة فونديك أورجانويدس
ملاحظة: يستند هذا البروتوكول على الأبحاث المنشورة سابقا في هذا المختبر8.
- تحضير الوسائط أورجانويد ثلاثي الأبعاد الذي يتألف من وسائل الإعلام R-سبوندين مكيفة تكييفاً Wnt و 20% 50%.
- تحضير الوسائط Wnt مكيفة، وثقافة الخلايا L في المتوسطة النمو Wnt (دولبيكو تعديل النسر المتوسطة (دميم)، 10% مصل بقرى الجنين (FBS)، 1% البنسلين/ستربتوميسين) لمدة 7 أيام، حصاد المتوسطة، والتصفية باستخدام عامل تصفية 0.22 ميكرومتر.
- تحضير الوسائط R-سبوندين مكيفة. تنمو خط خلية المبيضي HEK-293T R-سبوندين معدلة في المتوسطة النمو R-سبوندين (دولبيكو تعديل النسر المتوسطة (دميم)، 10% مصل بقرى الجنين (FBS)، 1% البنسلين/ستربتوميسين). عند الإلحاق بعد ح 2، تغيير المتوسطة من هذه الخلايا للنمو أوبتيميم المتوسط، 1% البنسلين/ستربتوميسين. ثقافة الخلايا لمدة 7 أيام. ثم الحصاد وسائط الإعلام R-سبوندين مكيفة والتصفية باستخدام عامل تصفية 0.22 ميكرومتر.
ملاحظة: قد سبق نشرة هذا البروتوكول وبروتوكول أكثر تفصيلاً تشير إلى 6،،من78.
- ذوبان الجليد المصفوفة الغشاء المخفضة، وخالية من الفينول الأحمر عامل النمو ح 16 على الجليد في 4 درجات مئوية. جمع الأنسجة في الجليد الباردة Ca2 +/Mg2 +-الحرة دببس في حاوية بلاستيكية كبيرة. تخزين على الجليد حتى بداية خطوة 1.4.
ملاحظة: يتم جمع الأنسجة من المرضى الذين يخضعون جاستريكتومي كم. - استخدام الملقط، يغسل النسيج بقوة في كوب عقيمة التي تحتوي على 100 مل Ca2 +/Mg2 +-الحرة الفوسفات مخزنة المالحة (دببس دولبيكو). أغسل لحوالي 30 ثانية أو حتى إزالة الأنقاض والدم. استخدام شاش معقم، مسح المقبل، بعيداً من الطبقة المخاطية من الظهارة.
- استخدام الملقط الكبير، بشدة فهم طبقة العضلات من الأنسجة ومع القوة، كشط بعيداً ظهارة استخدام ملقط مرقئ منحنى كبيرة. جمع شظايا الظهارية كشط إلى طبق بتري معقم، البوليستيرين.
- فرم الأنسجة الظهارية في حوالي 2.0 x 2.0 مم2 الحجم الأجزاء باستخدام شفرات الحلاقة لتحسين هضم الأنسجة. تغسل الأجزاء الأنسجة مع Ca2 +/Mg2 + -الحرة دببس وتستكمل مع المضادات الحيوية (Ca2 +/Mg2 + -الحرة دببس، 1% البنسلين/ستربتوميسين، 0.25 مغ/مل الامفوتريسين ب 10 ملغ/مل الجنتاميسين، 50 ملغ/مل كاناميسين)، حتى الغسيل بالدم. أداء يغسل متعددة إذا لزم الأمر. تجاهل إيقاف الغسيل بواسطة تصفية الغسيل من خلال شاش معقم عناية داخل دورق نفايات.
- جمع غسلها الشظايا في زجاج 125 مل جولة قارورة السفلي مع شريط إثارة 25 مم وحضانة المعالجون مسبقاً وسائل الإعلام (الإعلام القاعدية وتستكمل مع 2 مم ل الجلوتامين، 1% البنسلين/ستربتوميسين، 10 مم "حبيس المخزن المؤقت"، 1 ملغ/مل كولاجيناز نوع 1، 2 ملغ/مل خلية ثقافة الصف ألبومين المصل البقري). ختم قارورة أسفل جولة مع سيتا المطاط.
- إدراج إبرة العمود الفقري ز 20 سيتا وتوصيله بدبابة الأوكسجين مع الخراطيم المطاطية. لتصفية أي ملوثات، إدراج المناديل الورقية في الأنبوب لإنشاء عامل تصفية. بدوره على تدفق الأكسجين منخفضة. إدراج الإبر تدفق 10-15 في سيتا لتجنب تمزق سيتا.
- تأمين المجموعة تصل إلى موقف خاتم استخدام المشابك ووضعه في حمام مائي معايرة إلى 37 درجة مئوية مع صفيحة ضجة لمدة 30-45 دقيقة. بعد قد تم تفرخ الأنسجة لمدة 15 دقيقة، إزالة 50 ميليلتر الوسائط الاحتضان والاختيار بصريا الغدد معزولة. إذا كانت الغدد ليست كثيفة أو قد لا يفصل بين الأنسجة، إجازة 5-10 لكل دقيقة إضافية.
- فور انتهاء الحاضنات، إضافة 50 مل قبل ساخنة DMEM/F12 لاحتضان الوسائط باستخدام ماصة مصلية عقيمة أو بسكب الخليط الحضانة مباشرة.
- تصفية الخليط الغدة من خلال شاش معقم في أربعة أنابيب مخروطية 50 مل. الحفاظ على فيلتراتي على الجليد لمدة 15 دقيقة للسماح الغدد المستخرجة تسوية إلى الجزء السفلي من الأنبوبة المخروطية. احرص على عدم الإزعاج في الغدد تمت تسويتها، وإزالة وتجاهل قبالة رأس 40 مل من استخدام طافية ماصة مصلية. ريسوسبيند 10 مل المتبقية في 10 مل دببس وتستكمل مع المضادات الحيوية.
- توزيع الخليط بالتساوي في أنابيب الاختبار ثقافة الخلية 5 مل. الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في ز x 65 في 4 درجات مئوية وإزالة المادة طافية بعناية باستخدام ماصة. ريسوسبيند بيليه الغدة في مصفوفة المذابة الغشاء باستخدام ماصة أو تلميح ماصة واسعة 200 ميليلتر. المزيج حتى متجانسة.
ملاحظة: من الأهمية بمكان للقيام بهذه الخطوة على الجليد وتجنب البلمرة مصفوفة الغشاء بينما خلط. بالإضافة إلى ذلك، من المهم فحص كثافة الغدة بصريا بأخذ العينات على 50 ميليلتر. وتبلغ الكثافة المثلى كونفلوينسي ~ 70%. - وبعد ذلك، لوحة الغدد في 50 ميليلتر من الغشاء مصفوفة باستخدام ماصة واسعة ذات الرؤوس. تجنب إصدار أي فقاعات أثناء الطلاء.
- للسماح لمصفوفة الغشاء بلمرة، واحتضان لمدة 10-15 دقيقة عند 37 درجة مئوية. إذا كان الطلاء في لوحة ثقافة 12-جيدا، أضف 1 مل من هفجو وسائل الإعلام (تم التعديل النسر المتوسطة/F12 المتوسطة "دولبيكو متقدمة" وتستكمل مع مم 2 لتر-الجلوتامين، 1% البنسلين/ستربتوميسين، الامفوتريسين ب 0.25 مغ/مل 10 ملغ/مل الجنتاميسين، 50 ملغ/مل كاناميسين، 10 مم حبيس المخزن المؤقت، 1 مم ن-أكتييلسيستيني، 1 x 1 x B27، 50% مكيفة Wnt المتوسطة، 20% R-سبوندين-مكيفة المتوسطة وتستكمل مع 100 نانوغرام/مليلتر العظام مثبط البروتين مورفوجينيتيك، 1 نانومتر جاسترين، 50 نانوغرام/مل "عامل نمو البشرة"، 200 نانوغرام/مليلتر عامل النمو تنتجها الخلايا الليفية 10، 10 N2، مم نيكوتيناميد، و 10 ميكرون روك Y-27632 المانع) كل بئر. إذا لم يكن استخدام لوحة ثقافة 12-جيدا إضافة وسائط كافية تغرق فقاعة مصفوفة الغشاء.
- ثقافة الخلايا عند 37 درجة مئوية في 5% CO2 خلية هوميديفيد ثقافة حاضنة. تغيير وسائل الإعلام كل 4-5 أيام.
2. إنشاء المستمدة من الماوس 3D المعدة فونديك أورجانويدس
ملاحظة: هذا البروتوكول قد نشرت سابقا 6. ذوبان الغشاء مصفوفة على الجليد وإعداد جميع الكواشف قبل بداية.
- التضحية الفئران باستخدام أسلوب وافقت عليها مؤسسة البحث حيث يتم إجراء البحوث. إزالة المعدة من الماوس وتشريح وفقا للبروتوكولات المنشورة سابقا 6. أغسل في 20 مل الجليد الباردة Ca2 +/Mg2 +-الحرة دببس.
ملاحظة: يتم استخدام الفئران C57BL/6، الذين تتراوح أعمارهم بين 8-10 أسابيع، للثقافات فونديك أورجانويد المعدة. وقد euthanized الفئران باستنشاق غاز ثاني أكسيد الكربون تليها اليدوي التفكك عنق الرحم قبل إزالة المعدة. - تجريد طبقة العضلات من المعدة وأي الأوعية الدموية مرئية كما سبق ونشرت 6.
- فصل في النظارة من التجويف فاستخدام شفرة حلاقة عقيمة. قص النظارة باستخدام مقص الجراحية الصغيرة إلى شظايا حوالي 2.0 x 2.0 مم. استخدام الملقط، جمع الشظايا في أنبوب مخروطي 15 مل يحتوي على المخزن المؤقت لحضانة يدتا (Ca2 +/Mg2 +-الحرة دببس، 5 ملم يدتا) واحتضان في 4 درجات مئوية عن ح 2 مع الانفعال لطيف.
- في غطاء عقيمة، ترك الأنبوبة المخروطية والشظايا على الجليد لحوالي 5 دقيقة استخدام ماصة لإزالة المخزن المؤقت حضانة قدر ممكن ترك الشظايا التي يمسها. إضافة 5 مل تهز المخزن المؤقت (ز 1 د-السوربيتول، السكروز ز 1.47 في 100 مل Ca2 +/Mg2 +-الحرة دببس) واهتز باليد بقوة بمقدار 2 تسمح بشظايا كبيرة لتسوية ومع التسرع واستخدام ماصة 1000 ف، وإزالة الأجزاء الصغيرة التي لا يزال يتعين تسوية في الطبقة العليا.
- تدور شظايا تمت إزالتها لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية في 65 س ز.
- مع تجنب فقاعات الهواء، إزالة المادة طافية، ريسوسبيند في مصفوفة الغشاء ويخلط حتى يصبح متجانساً.
- استخدام ماصة نصيحة واسعة لوحة المصفوفة الغشاء في 50 ميليلتر كل بئر واحتضان ثم في 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
- إضافة ما يكفي من وسائط النمو مفجو (متقدم دولبيكو تعديل النسر المتوسطة/F12 المتوسطة وتستكمل مع 2 مم ل الجلوتامين، 1% البنسلين/ستربتوميسين، 10 مم "هيبيس المخزن المؤقت"، 1 مم ن-أكتييلسيستيني، 1 x N2، 1 x B27، 50% مكيفة Wnt المتوسطة، 20% R-سبوندين-مكيفة تستكمل مع مثبطات البروتين morphogenetic العظام نانوغرام/مليلتر 100 10 نانومتر جاسترين، 50ng/mL "عامل نمو البشرة"، عامل النمو تنتجها الخلايا الليفية نانوغرام/مل 10 10 و 10 ميكرون روك Y-27632 المانع متوسطة) إلى غمر الفقاعة.
- ثقافة الخلايا عند 37 درجة مئوية، 5% CO2 خلية هوميديفيد ثقافة حاضنة. تغيير وسائل الإعلام كل 4-5 أيام.
3-الكولاجين طلاء لنقل 2D
ملاحظة: تنفيذ جميع الإجراءات في غطاء زراعة الأنسجة عقيمة ما لم يحدد خلاف ذلك. يبدأ الكولاجين طلاء 24 ساعة قبل نقل أورجانويدس 3D لأحادي الطبقة. الحفاظ على الكولاجين ذيل الفئران على الجليد ومحمية من الضوء. لوحات الكولاجين المغلفة جيدة لمدة تصل إلى أسبوعين. إذا لم تكن تستخدم لوحات المغلفة فورا، التفاف اللوحة في بارافيلم ومخزن في 4 درجات مئوية حتى حاجة.
- يضعف الكولاجين ذيل الفئران إلى 50 ميكروغرام/مل باستخدام حمض الخليك مم 20.
- وتغطي بما فيه الكفاية على سطح البئر مع الكولاجين المخفف. لبئر واحدة في لوحة 12-جيدا قياسية، معطف مع حوالي 1 مل الكولاجين. تترك ليلة كاملة في درجة حرارة الغرفة في غطاء عقيمة.
- أغسل مرتين مع 1 مل Ca2 +/Mg2 +-الحرة دببس كل بئر وترك كشفت عن ح 2 في درجة حرارة الغرفة في غطاء عقيمة.
4-الغشاء مصفوفة الطلاء لنقل 2D
ملاحظة: تنفيذ جميع الإجراءات في غطاء زراعة الأنسجة عقيمة ما لم يحدد خلاف ذلك. يبدأ الغشاء مصفوفة الطلاء ح 2 قبل نقل أورجانويدس 3D لأحادي الطبقة. الاحتفاظ بالمصفوفة الغشاء على الجليد. لوحات المغلفة استخدامها فورا ولا يمكن تخزينها لفترة ممتدة من الوقت.
- تمييع المصفوفة الغشاء في أنبوب مخروطي 15 مل مع مياه الصف ثقافة خلية في 01:10 نسبة. تمييع على الجليد.
- استخدام ماصة إضافة 100 ميليلتر من مصفوفة الغشاء المخفف لكل بئر من صفيحة 12-جيدا القياسية. باستخدام مكشطة خلية، توزيع متساو المصفوفة الغشاء المخفف في جميع أنحاء البئر لمعطف حتى.
- احتضان في 37 درجة مئوية ح 1.
- إزالة المياه المتبقية باستخدام ماصة وجاف في درجة حرارة الغرفة ح 1 قبل نقل أورجانويدس ثلاثي الأبعاد.
5-نقل m/هفجوس 3D إلى 2D "مونولاييرس الخلايا الظهارية المعدة"
- بعد 3D الماوس أو الإنسان-المستمدة من فجوس قد تم مثقف لمدة 6-7 أيام، وتبدأ بنقل أورجانويدس 3D لأحادي الطبقة 2D.
ملاحظة: لكل بئر أحادي الطبقة المطلوبة من المستحسن استخدام 300 أورجانويدس سليمة أو الخلايا المفردة المتأتية من أورجانويدس 300. من المتوقع في ثقافة قوية للحصول على حوالي 150 أورجانويد/جيدا داخل لوحة 12 ثقافة جيدا. - تأكد من لوحات المغلفة قبل نقل.
ملاحظة: لوحات مصفوفة مغلفة غشاء الطابق السفلي طبقة هلام شفاف، ومع ذلك، لن يكون لوحات الكولاجين مغلفة أي إشارة واضحة للطلاء. - إزاحة فقاعة مصفوفة 3D غشاء الطابق السفلي من اللوحة بشكل مباشر بيبيتينج 1 مل العقيمة Ca2 +/Mg2 +-الحرة دببس في وسط الفقاعة.
- استخدام ماصة، جمع الغشاء أورجانويد ومصفوفة الخليط في أنابيب الاختبار ثقافة الخلية. جمع بنسبة 2 فقاعات مصفوفة الغشاء كل أنبوب. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 40 × ز و 4 درجة مئوية.
- باستخدام نظام الشفط، وإزالة المادة طافية وكثير مصفوفة الغشاء ممكن. ريسوسبيند في 4 مل من Ca2 +/Mg2 +-الحرة دببس، وإزالة المادة طافية، وكرر 2-3 مرات. بروتوكول نقل أورجانويد كله، انتقل إلى الخطوة 5.10. تابع إلى الخطوة 5، 7 لبروتوكول تعليق خلية مفردة.
- قبل الحارة الخلية المفرزة الحل إلى 37 درجة مئوية وإضافة 1 مل لكل أنبوبة الاختبار. المزيج بلطف بعكس أنابيب أو بيبيتينج صعودا وهبوطاً مع ماصة. احتضان لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية.
- إضافة 2 مل من Ca2 +/Mg2 +-حرة دببس مباشرة إلى كل أنبوبة الاختبار.
- استخدام إبرة ز 26 والمحاقن الخليط 2-3 مرات. التحقق بصريا للخلايا المفردة. المحاقن 1-2 مرات أكثر إذا كان لا يزال هناك أورجانويدس أو مجموعات من الخلايا.
- أجهزة الطرد المركزي في 40 س ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. ريسوسبيند بيليه في 2D فجو وسائل الإعلام (الماوس 2D فجو النمو المتوسطة: تم التعديل النسر المتوسطة/F12 المتوسطة "دولبيكو متقدمة" وتستكمل مع مم 2 لتر-الجلوتامين، 10 مم البنسلين/ستربتوميسين، 10% مصل العجل الجنين، 10 مم "هيبيس المخزن المؤقت"، 1 x N2، 1 x B27، وتستكمل مع 10 نانومتر جاسترين 50 نانوغرام/مل "عامل نمو البشرة", 1 ميكرومتر TGF-β المانع و 10 ميكرون روك Y-27632 المانع. 2D المتوسطة النمو البشري في فجو: تعديل النسر المتوسطة/F12 المتوسطة متقدمة دولبيكو وتستكمل مع 2 مم ل الجلوتامين، 1% البنسلين/ستربتوميسين، 10 مم حبيس المخزن المؤقت، 10% "مصل العجل الجنين"، 10 مم نيكوتيناميد، 1 x N2، 1 x B27، وتستكمل مع 50 ملغم/مل كاناميسين، 50 نانوغرام/مل "نمو البشرة" عامل، و 10 ميكرون مثبط روك Y-27632، 1 ميكرومتر TGF-β المانع).
- لوحة تعليق على لوحات المغلفة. احتضان لوحات عند 37 درجة مئوية. استبدال وسائط كل 4 أيام أو في وقت سابق إذا كانت وسائل الإعلام يتحول إلى اللون الأصفر. أحادي الطبقة يتطلب حوالي 4 أيام للنموذج.
6-الصفر المقايسة الجرح باستخدام الخلايا الظهارية المعدة 2D مونولاييرس
- باستخدام شفرة حلاقة، الصفر أحادي الطبقة عندما وصلت الثقافة كونفلوينسي 100%.
- فيكس مونولاييرس استخدام فورمالدهايد 3.7% لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بيرميبيليزي مع 0.5% غير الأيونية المنظفات الصناعية/برنامج تلفزيوني لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- كتلة التالية مونولاييرس مع المصل حمار 2% ح 1 في درجة حرارة الغرفة واحتضان مع تمييع 1: 1000 من ح+، ك+-ATPase الابتدائي جسم بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية، يغسل مع 0.1% غير الأيونية المنظفات الصناعية/برنامج تلفزيوني واحتضان مع تمييع 1: 100 حمار جسم الثانوي الماوس المضادة 488 و 10μg/مل من نواة الخلية هويشت وصمة عار ح 1 في درجة حرارة الغرفة.
- لتحديد الخلايا حفرة المخاطية السطحية في ثقافات أحادي الطبقة 2D المعدة المستمدة من الإنسان، وصمة عار الخلايا التي تحتوي على 20 ميكروغرام/mL من المتقارن فيتك أوروبي أليكس (الدولية). صورة مونولاييرس في مجهر [كنفوكل].
- التقاط صور للجرح كل حاء القليلة الصفر سيتم إعادة ابيثيلياليزي بين 24-48 ح اعتماداً على نوعية أحادي الطبقة والتباين بين المرضى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
أورجانويدس مستمدة من الإحضار/جسم الإنسان أو النظارة من أنسجة المعدة الماوس (الشكل 1A). بعد كولاجيناز أو الهضم يدتا المستمدة من الإنسان أو الماوس أنسجة المعدة على التوالي، الغدد جزءا لا يتجزأ في مصفوفة الغشاء ومثقف لمدة 6-7 أيام (الشكل 1A). يوضح الشكل 1 باء تشكيل المستمدة من الإنسان المعدة أورجانويدس (هوفجوس) التي نقلت إلى أحادي الطبقة الظهارية المعدة (حاجم) ثم في الغشاء الدائرة المغلفة بمصفوفة الشرائح. وبعد 4 أيام ثقافة، استخدمت هوجيمس المتلاقية لفحوصات الجرح الصفر (الشكل 1B). الصور التي تم جمعها من تحليل انقضاء وقت هوجيم وأظهر إغلاق الجرح داخل الثقافة على مدى فترة 24 ساعة (الشكل 2).
وعثر هوجيمس للتعبير عن الأنساب الخلية الرئيسية الموجودة في أنسجة المعدة الأصلية. تلطيخ الفلورة كشفت عن التعبير عن ه أحادي الطبقة كادهيرين-الإيجابية التي تألفت من الجداري (الشكل 3، ج) وسطح الأغشية المخاطية (الشكل 3، د) استقطاب الخلايا. وأكد تحليل PCR باستخدام الحمض النووي الريبي التي تم جمعها من هذه مونولاييرس التعبير عن خلايا الأغشية المخاطية السطحية والجدارية، بالإضافة إلى خلايا العنق كبير والأغشية المخاطية (3E الشكل). هوجيمس المتلاقية أعرب أيضا عن بعض الخلايا المتكاثرة (3F الشكل). وكشف تحليل هذه الأنساب الخلية الرئيسية داخل مقايسة الجرح الصفر التعبير المطرد من الرقبة الجدارية، رئيس، والأغشية المخاطية خلايا الأغشية المخاطية السطحية على مدى 24 ساعة الفترة الزمنية (الشكل 4 أ، ب). جماعياً، تثبت هذه البيانات باستخدام هوجيمس كنظام ثقافة جديدة لدراسة تجديد المعدة في المختبر.
رقم 1: توليد المستمدة من الإنسان المعدة أورجانويدس (هوفجو) والأولية مونولاييرس طلائي المعدة (حاجم). (أ) الصور التمثيلية للبشرية المعدة المعدة الأنسجة والماوس تستخدم لتوليد الغدد للثقافة أورجانويد. المجال المحدد يشير إلى منطقة فونديك المعدة الماوس. (ب) توليد المستمدة من الإنسان المعدة أورجانويدس (هوفجوس) التي يتم استخدامها لثقافة مونولاييرس طلائي المعدة المستمدة من الإنسان (هوجيمس). صورة الممثل حاجم بعد الصفر عرض منطقة الجرحى. شريط المقياس = 500 ميكرومتر الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: مقايسة الصفر-الجرح- جمع صور الممثل من تجربة مرور وقت باستخدام هوجيم 0, 8 و 16 و 24 ساعة بعد الصفر الجرح. شريط المقياس = 500 ميكرومتر الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: التعبير عن الأنساب الخلية الرئيسية في الثقافات هوجيم. الفلورة تلطيخ حاجم الثقافات مما يدل على التعبير عن كادهيرين (A) ﻫ (Ecad، الأحمر)، السطحية خلايا الأغشية المخاطية (الدولية) الأخضر ونوى (هويشت، الأزرق)، وكادهيرين (ب) ﻫ (Ecad، أحمر) والخلايا الجداري (هونج كونج، الأخضر) ونوى ( هويشت، الأزرق). وترد في (ج) و (د)قنوات منفصلة. (ه) أجرى RT-PCR باستخدام الحمض النووي الريبي المستخرج من هوجيمس للتعبير عن ح+ك+-أتباسي (ATP4a)، بيبسينوجين ج (PgC)، MUC5AC، و MUC6. (و) بروليفيراتينج الخلايا ضمن ثقافة حاجم يحدده امتصاص إيدو (أحمر). مقياس بار (أ-د) = 50 ميكرومتر، مقياس بار (F) = 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: التغييرات في الخلية النسب التعبير في مقايسة الصفر-الجرح- تلوين الفلورة حاجم الثقافات مما يدل على التعبير عن ه كادهيرين (Ecad، الأحمر) أو خلايا الأغشية المخاطية السطحية (الدولية) الأخضر أو خلايا الجداري (هونج كونج، الأخضر) ونوى (هويشت، الأزرق) باستخدام الشرائح التي تم جمعها من حاجم الثقافات 0, 8 و 16 و 24 ساعة بعد الصفر-الجرح. بكجرد = تلوين الخلفية لمصفوفة الغشاء على الشرائح. شريط مقياس المحور س من 0-400 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| ماوس 3D وسائل الإعلام | حل الأسهم | تركيز العمل |
| ناسيتيلسيستيني | مسحوق | 1 مم |
| جاسترين | 10 ميكرومتر | 10 نانومتر |
| لو | 500 ميكروغرام/مل | 50 نانوغرام/مليلتر |
| رأس | 100 ميكروغرام/مل | 100 نانوغرام/مليلتر |
| FGF10 | 100 ميكروغرام/مل | 100 نانوغرام/مليلتر |
| يكمد | 10 ملم | 10 ميكرومتر |
| B27 | 50 x | س 1 |
| N2 | 100 x | س 1 |
| القلم/بكتيريا | م 1 | 10 ملم |
| حبيس | م 1 | 10 ملم |
| جلوتاماكس | 200 ملم | 2 مم |
| WNT | 50% v/v | |
| R-سبوندين | 10% v/v |
الجدول 1: مكونات وسائط 3D الماوس.
| الماوس 2D وسائل الإعلام | حل الأسهم | تركيز العمل |
| المنحدر القاري | 100 ٪ | 10 ٪ |
| يكمبد | 10 ملم | 10 ميكرومتر |
| جاسترين | 10 ميكرومتر | 10 نانومتر |
| لو | 500 ميكروغرام/مل | 50 نانوغرام/مليلتر |
| B27 | 50 x | س 1 |
| N2 | 100 x | س 1 |
| القلم/بكتيريا | م 1 | 10 ملم |
| هيبيس | م 1 | 10 ملم |
| جلوتاماكس | 200 ملم | 2 مم |
| مثبط TGF-β | 10 ملم | 1 ميكرومتر |
الجدول 2: مكونات الماوس 2D وسائل الإعلام.
| وسائط ثلاثية الأبعاد البشرية | حل الأسهم | تركيز العمل |
| نيكوتيناميد | مسحوق | 10 ملم |
| ناسيتيلسيستيني | مسحوق | 1 مم |
| جاسترين | 10 ميكرومتر | 1 نانومتر |
| لو | 500 ميكروغرام/مل | 50 نانوغرام/مليلتر |
| رأس | 100 ميكروغرام/مل | 100 نانوغرام/مليلتر |
| FGF10 | 100 ميكروغرام/مل | 200 نانوغرام/مليلتر |
| يكمد | 10 ملم | 10 ميكرومتر |
| B27 | 50 x | س 1 |
| N2 | 100 x | س 1 |
| القلم/بكتيريا | م 1 | 10 ملم |
| حبيس | م 1 | 10 ملم |
| جلوتاماكس | 200 ملم | 2 مم |
| كاناميسين | م 1 | 10 ملم |
| الامفوتريسين B/مع الجنتامايسين | 125 ميكروغرام/مل | 1 مم |
| WNT | 50% v/v | |
| R-سبوندين | 10% v/v |
الجدول 3: مكونات وسائط ثلاثية الأبعاد البشرية.
| 2D البشرية في وسائل الإعلام | حل الأسهم | تركيز العمل |
| المنحدر القاري | 100 ٪ | 10 ٪ |
| يكمبد | 10 ملم | 10 ميكرومتر |
| جاسترين | 10 ميكرومتر | 1 نانومتر |
| لو | 500 ميكروغرام/مل | 50 نانوغرام/مليلتر |
| B27 | 50 x | س 1 |
| N2 | 100 x | س 1 |
| القلم/بكتيريا | م 1 | 10 ملم |
| حبيس | م 1 | 10 ملم |
| جلوتاماكس | 200 ملم | 2 مم |
| مثبط TGF-β | 10 ملم | 1 ميكرومتر |
| نيكوتيناميد | مسحوق | 10 ملم |
| كاناميسين | م 1 | 10 ملم |
الجدول 4: العناصر البشرية 2D وسائل الإعلام.
| مشكلة تجريبية | تلميح استكشاف الأخطاء وإصلاحها |
| تفشل مونولاييرس إلى شكل من أورجانويدس | 1) تختلف الظروف تثقيف المثلى لهذا البروتوكول بين الاحتياجات التجريبية. البشرية وينبغي مثقف مونولاييرس الماوس المستمدة من أورجانويدس باستخدام مصفوفة المخفف الغشاء عند استخدام الزجاج أو الأطباق البلاستيكية الثقافة. ومع ذلك، الكولاجين ذيل الجرذ الأمثل للتجارب أحادي الطبقة للماوس أو إدراج البشرية المنشأ التي تتطلب غشاء البوليستر. 2) تختلف ظروف تثقيف الأمثل اعتماداً على مجموعة تجريبية حتى. من الناحية المثالية تستزرع الثقافات استخدام تعليق خلية مفردة مع 3D فجو وسائل الإعلام حين أورجانويدس سليمة تستزرع مع 2D فجو وسائل الإعلام. |
| مونولاييرس المستمدة من الذين تتراوح أعمارهم بين المرضى (> 55 سنة) أو الفئران (> 18 شهرا) فشلت في أن تنمو وتصل إلى كونفلوينسي | في حالة استخدام أنسجة المعدة التي تم جمعها من الفئران الذين تتراوح أعمارهم بين (> 18 شهرا) أو المرضى (> 55 سنة) ينبغي مضاعفة كثافة أورجانويدس المستخدمة لتوليد أحادي الطبقة نظراً لأن كفاءة النمو أورجانويدس يتناقص. |
| تفشل أورجانويدس إلى نموذج من الغدد | من المستحسن أن الطازجة (المشتراة حديثا إذا أمكن) يمكن استخدام جاسترين. استخدام جاسترين طازجة إعادة تعليق كل 4 أشهر. |
| أورجانويدس فشل إرفاق وتشكيل مونولاييرس | تأكد من أنه تم تحقيق كفاءة إزالة الغشاء مصفوفة بعد الحصاد أورجانويدس لنقل الثقافة لوحات مونولاييرس. |
| الثقافات مستمدة من الذين تتراوح أعمارهم بين المرضى (> 55 سنة) أو الفئران (> 18 شهرا) تفشل | أثناء فترات الهضم، والحضانة، يكفي 15-30 دقيقة الحضانة الأولى تليها فترات 5 دقيقة للحضانة حسب الضرورة. تجدر الإشارة إلى أن المرضى أكبر من 55 سنة من العمر قد الغدد التي يتم فصلها بسهولة أكبر وبالتالي تتطلب أقل الهضم. وبالمثل، قد عرض فجوس المستمدة من المرضى الذين تتراوح أعمارهم بين وقت نمو أبطأ وزيادة الحساسية للطرد المركزي. للحصول على أفضل النتائج، يحد أي الطرد المركزي الزائد عند العمل مع النسيج الذين تتراوح أعمارهم بين، وتحل محل وسائل الإعلام في الوقت مناسب. |
الجدول 5: استكشاف الأخطاء وإصلاحها تلميحات. مواجهة القضايا والقرارات الموصى به لإنشاء الأمثل وثقافة الإنسان أو الماوس مونولاييرس المعدة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تفاصيل البروتوكول الحالي بإنشاء مونولاييرس طلائي المعدة المستمدة من الإنسان والفأرة التي يمكن استخدامها لفحوصات الصفر-الجرح. البروتوكول يعتمد على مفهوم الخلايا الجذعية المقيمين العزل من الإنسان الأولية (أو الماوس) الأنسجة، وهو بروتوكول تعديل نشرت لأول مرة شلايرمان وآخرون7. على وجه الخصوص، لدينا الأمثل البروتوكول هنا لإنشاء روافد واستقطاب أحادي الطبقة الظهارية المعدة التي تعرب عن الرئيسية الخلية الأنساب التي يمكن العثور عليها داخل ظهارة المعدة في الجسم الحي. إصلاح قرحة المعدة هي عملية معقدة تشمل الأنسجة إعادة ابيثيلياليزيشن والتجدد، وانتشار9،،من1011. على وجه الخصوص، وقد أفادت مختبرنا أن التجديد ظهارة المعدة يتزامن مع ظهور spasmolytic ببتيد/البرسيم عامل (النموذجي) 2-الإعراب عن حؤول (سبيم) في الهامش قرحة داخل غدد المعدة تجديد 12،13. سبيم يعرف ترانسديفيرينتييشن سلالة رئيس الخلية إلى14 حؤول خلايا الأغشية المخاطية التي تبرز مع الإصابة ويختفي عند إرجاع الغشاء المخاطي في تكوين الهاتف الخلوي العادي12. وهكذا، لدراسة هذه إليه في نظام في المختبر ، من الضروري أن الأنساب الخلية الرئيسية، مثل الخلايا كبير، وموجودة داخل الثقافة.
استخدام فحوصات الصفر-الجرح قد استخدمت على نطاق واسع لدراسة الإصلاح والتجديد، وحتى وقت قريب، كانت خطوط خلايا سرطان المعدة المستخدمة1،2،،من34. بينما قد كشفت عن الآليات الأساسية باستخدام خطوط خلايا سرطان المعدة، يتم تحويل هذه الثقافات وتفتقر إلى تنوع الخلوية لانسجة المعدة الأصلية. وترد هوجيمس الاحتفاظ بتركيبة خلوية الاستقطاب ومتنوعة عن كثب ويجمل ظهارة المعدة في فيفو. بالإضافة إلى ذلك، بعد التوصل إلى حاجم كونفلوينسي يمكن الحفاظ على الثقافات لمدة تصل إلى شهر في الظروف المثلى. الثقافات موسعة تسمح لإجراء التجارب على المدى الطويل. وهكذا، تشمل التطبيقات المستقبلية هوجيمس التي قد تعتبر أحادي الطبقة/المناعة المشارك خلية ثقافات وتجارب طويلة الأمد لدراسة إمراضية جرثومة الملوية البوابية .
وهناك أهمية الجوانب التقنية ملاحظة في البروتوكول الحالي. النقطة التقنية الأولى هي أن اختيار مكونات الغشاء يختلف اعتماداً على سطح الثقافة الخلية التي ستستخدم لإجراء تجارب عليها. لضمان أن يتم التوصل إلى الظروف المثلى أحادي الطبقة، من المستحسن أن الكولاجين يستخدم عندما تتطلب تجارب مع مونولاييرس لوحات مع إدراج غشاء البوليستر. ومع ذلك، إذا تتطلب تجارب أحادي الطبقة الزجاجية أو الأسطح البلاستيكية الثقافة، هو مصفوفة المخفف الغشاء الخيار الأمثل لطلاء. ثانيا، يجب تعديل كثافة أورجانويدس المطلوب للوصول إلى من أحادي الطبقة المتلاقية تبعاً لعمر المريض التي يتم جمعها في أنسجة المعدة. للأنسجة التي تم جمعها من الفئران الذين تتراوح أعمارهم بين (> 18 شهرا) أو المرضى (> 55 سنة)، أورجانويد الكثافة المستخدمة ينبغي أن تكون زيادة مزدوجة عندما نقل إلى أحادي الطبقة سبب قدرة النمو انخفض في الأفراد الذين تتراوح أعمارهم بين. أثناء الهضم والحضانة للأنسجة البشرية المستمدة من المرضى المسنين، الغدد قد تكون أكثر عرضه للتفكك والطرد المركزي وبالتالي: 1) يجب تثفيل ماما كممكّن، 2) الإعلام محل اجتهاد، و 3) أثناء الهضم إينكوبيشنز من 15 إلى 30 دقيقة مع ديجيسشنز الإضافية لمدة 5 دقائق بعد ذلك ستقل احتمالات على الهضم. 3D فجو وسائل الإعلام أخيرا، عند تشكيل مونولاييرس من تعليق خلية مفردة مشتقة من أورجانويد، المثلى لتكوين مناسب من مونولاييرس بينما عند استزراع من أورجانويدس سليمة، 2D فجو وسائل الإعلام وقد لوحظ أن تحقق كفاءة أعلى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل "المعاهد الوطنية للصحة" (نيدك) 5 منح R01 DK083402-07 (YZ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced Dulbecco's modified Eagle/F12 medium (basal media) | Life Technologies | 12634-010 | |
| GlutaMAX (L-glutamine) | Life Technologies | 25030-081 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Scientific | SV30010 | |
| Amphotericin B/Gentamicin | Thermo Scientific | R01510 | |
| Kanamycin | Thermo Fisher | RO1510 | |
| HEPES Buffer | Sigma Aldrich | H0887 | |
| n-Acetylcystine | Sigma Aldrich | A9165 | |
| N2 | Life Technologies | 17502-048 | |
| B27 | Life Technologies | 12587-010 | |
| BMP Inhibitor (Noggin) | Pepro Tech | 250-38 | |
| Gastrin | Tocris | 3006 | |
| EGF | Pepro Tech | 315-09 | |
| FGF10 | Pepro Tech | 100-26 | |
| Nicotinamide | Sigma Aldrich | N0636 | |
| Y-27632 ROCK Inhibitor | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| TGF-β Inhibitor | Tocris | 2939 | |
| Ca2+/Mg2+ -free DPBS | Fisher | 21-031CV | |
| Dulbecco's modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 12634-010 | |
| Fetal Bovine Serum | FBS | ||
| OPTIMEM | Invitrogen | ||
| 0.22µM filter | Fisher | 099-720-004 | |
| 37 °C Water Bath | |||
| Collagenase Type 1 | Worthington | LS004214 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9418 | |
| Kimwipes (tissue paper) | Fischer Scientific | 06-666C | |
| 125 mL round bottom flask | |||
| 1 in (25 mm) stir bar | |||
| Rubber Septa | |||
| Sterile Gauze | |||
| Stir Plate | |||
| Ring Stand | |||
| Ring Stand Clamps | |||
| Sterile petri dish | |||
| 18 G needles of 1.5 in length | Thermo Fisher | 305196 | |
| 20 G spinal needles of 3.5 in length | Thermo Fisher | 405182 | |
| 12-well cell culture treated plate | Midwest Scientific | 92012 | |
| Growth Factor Reduced, Phenol Red-free MatrigelTM (Basement membrane matrix) | Fisher | CB-40230C | |
| Sterile Razor Blades | |||
| Wide-tip tweezers | |||
| Curved Hemostatic Forceps | |||
| 200 µL wide pipette tips | Thermo Fisher | 02-707-134 | |
| 5 mL cell culture test tubes | Fisher | 14-956-3C | |
| Oxygen Tank with rubber hosing | |||
| 1 g D-Sorbitol | |||
| Sucrose | Fisher | SS-500 | |
| Dissecting microscope | |||
| Dissecting Tray | |||
| Rocking Table | |||
| Rat Tail Collagen Type 1 | Life Technologies | A10483-01 | |
| Cell culture grade glacial acetic acid | Fisher | A38-212 | |
| Cell culture grade water | Corning | 25-055-CV | |
| 2-well chamber slide | Thermo Fisher | 155380 | |
| 12-well Transwell (polyester membrane inserts) | Corning | 3460 | |
| Cell scraper | Corning | 353086 | |
| Accutase (cell detachment solution) | Stemcell Technologies | 7920 | |
| 263/8 G syringe | Thermo Fisher | 309625 | |
| Razor blade | |||
| L Cells | L cells, a Wnt3a producing cell line, were received as a gift from Dr. Hans Clevers (Hubrecht Institute for Developmental Biology and Stem Cell Research, Netherlands). | N/A | |
| HEK-293T Rspondin secreting cells | A modified HEK-293T R-spondin secreting cell line was obtained from Dr. Jeff Whitsett (Section of Neonatology, Perinatal and Pulmonary Biology, Cincinnati Children's Hospital Medical Centre and The University of Cincinnati College of Medicine, Cincinnati, USA ). | N/A | |
| HK-ATPase Primary Antibody | Invitrogen | SC-374094 | |
| E-Cadherinn | SantaCruz | sc-59778 | |
| UEA1 | Sigma Aldrich | L9006 | |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher | H3570 | |
| Alexafluor 488 secondary antibody (Donkey anti-mouse 488 secondary antibody) | ThermoFisher Scientific | R37114 |
References
- Nagy, T. A., et al. Helicobacter pylori regulates cellular migration and apoptosis by activation of phosphatidylinositol 3-kinase signaling. J Infect Dis. 199 (5), 641-651 (2009).
- Mnich, E., et al. Impact of Helicobacter pylori on the healing process of the gastric barrier. World J Gastroenterol. 22 (33), 7536-7558 (2016).
- Zhang, Y., et al. Bm-TFF2, a toad trefoil factor, promotes cell migration, survival and wound healing. Biochem Biophys Res Commun. 398 (3), 559-564 (2010).
- Crabtree, J. Role of cytokines in pathogenesis of Helicobacter pylori-induced mucosal damage. Dig Dis Sci. 43 (Supplement), 46S-53S (1998).
- Riahi, R., Yang, Y., Zhang, D. D., Wong, P. K. Advances in wound-healing assays for probing collective cell migration. J Lab Autom. 17 (1), 59-65 (2012).
- Zhang, M., Li, H., Ma, H., Qin, J. A simple microfluidic strategy for cell migration assay in an in vitro wound-healing model. Wound Repair Regen. 21 (6), 897-903 (2013).
- Schlaermann, P., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. 65 (2), 202-213 (2016).
- Bertaux-Skeirik, N., et al. CD44 plays a functional role in Helicobacter pylori-induced epithelial cell proliferation. PLoS Pathog. 11 (2), e1004663 (2015).
- Tarnawski, A. S. Cellular and molecular mechanisms of gastrointestinal ulcer healing. Dig Dis Sci. 50 (Suppl 1), S24-S33 (2005).
- Wright, N. A., Pike, C., Elia, G. Induction of a novel epidermal growth factor-secreting cell lineage by mucosal ulceration in human gastrointestinal stem cells. Nature. 343, 82-85 (1990).
- Wright, C. L., Riddell, R. H. Histology of the stomach and duodenum in Crohn's disease. Am J Surg Pathol. 22 (4), 383-390 (1998).
- Engevik, A. C., et al. The Development of Spasmolytic Polypeptide/TFF2-Expressing Metaplasia (SPEM) During Gastric Repair Is Absent in the Aged Stomach. CMGH. , In Press (2016).
- Bertaux-Skeirik, N., et al. CD44 variant isoform 9 emerges in response to injury and contributes to the regeneration of the gastric epithelium. Journal of Pathology. 242 (4), 463-475 (2017).
- Nam, K. T., et al. Mature chief cells are cryptic progenitors for metaplasia in the stomach. Gastroenterology. 139 (6), 2028-2037 (2010).
