Summary
यहां हम स्थापित करने और मानव संवर्धन और माउस के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन 3 आयामी (3 डी) गैस्ट्रिक organoids, और 3 डी organoids के हस्तांतरण के लिए एक 2-आयामी monolayer के लिए विधि व्युत्पंन । पुनर्जनन अध्ययन के लिए एक उपंयास खरोंच घाव परख के रूप में गैस्ट्रिक उपकला monolayer का उपयोग भी वर्णित है ।
Abstract
गैस्ट्रिक घावों की मरंमत के इन विट्रो में अध्ययन आमतौर पर सेलुलर प्रसार और प्रवास के एक खरोंच घाव परख में गैस्ट्रिक कैंसर सेल लाइनों का उपयोग शामिल है । ऐसे परख की एक महत्वपूर्ण सीमा है, तथापि, उनके सेलुलर प्रकार के समरूप वर्गीकरण है । मरंमत एक जटिल प्रक्रिया है जो कई प्रकार के सेल की बातचीत की मांग है । इसलिए, एक सेलुलर उपप्रकार से रहित संस्कृति का अध्ययन करने के लिए, एक चिंता का विषय है कि अगर हम मरंमत की प्रक्रिया को समझ रहे है दूर किया जाना चाहिए है । गैस्ट्रिक organoid मॉडल इस मुद्दे को कम कर सकते है जिससे कोशिका प्रकार के विषम संग्रह को दर्शाता है कि गैस्ट्रिक उपकला या vivo मेंअंय देशी ऊतकों की । यहां का प्रदर्शन एक उपंयास है, इन विट्रो में खरोंच-घाव मानव या माउस से व्युत्पंन परख 3 आयामी organoids जो तब एक गैस्ट्रिक उपकला monolayer को या तो बरकरार organoids या असंबद्ध के एक सेल निलंबन के रूप में स्थानांतरित किया जा सकता organoids । प्रोटोकॉल का लक्ष्य organoid-व्युत्पंन गैस्ट्रिक उपकला monolayers है कि एक उपंयास खरोंच में इस्तेमाल किया जा सकता है घाव परख प्रणाली गैस्ट्रिक पुनर्जनन अध्ययन करने के लिए स्थापित करने के लिए है ।
Introduction
खरोंच घाव परख का उपयोग मरंमत और पुनर्जनन1,2,3,4,5,6के अध्ययन के लिए एक लोकप्रिय तरीका है । प्रस्तावित पद्धति का उपयोग गैस्ट्रिक पुनर्जनन और Helicobacter हेलिकोबेक्टर औपनिवेशीकरण के लिए विशेष रूप से अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है । अतीत में, गैस्ट्रिक कैंसर सेल लाइनों का अध्ययन करने के लिए एक साधन के रूप में इस्तेमाल किया गया है Helicobacter हेलिकोबेक्टर (एच. हेलिकोबेक्टर) संक्रमण1,2 और हाल ही में जब तक गैस्ट्रिक कैंसर सेल लाइनों जैसे AGS कोशिकाओं इष्ट थे1 ,2,3,4. गैस्ट्रिक कैंसर सेल संस्कृतियों की एक सीमा उनके गैस्ट्रिक उपकला के सेलुलर विविधता दोहराऊंगा विफलता है । इस सीमा को संबोधित करने की कोशिश करने के लिए, यहां का प्रदर्शन किया स्थापना और प्राथमिक मानव के हस्तांतरण-और माउस व्युत्पंन 3 आयामी एक संशोधित विधि के आधार पर घाव भरने की परख के लिए एक गैस्ट्रिक उपकला monolayer के लिए organoids (FGOs) पहले Schlaermann एट अलद्वारा वर्णित है । 7 हम प्रदर्शन कि गैस्ट्रिक उपकला monolayers कतरनी 3 डी गैस्ट्रिक FGOs या FGO-व्युत्पन्न एकल कोशिकाओं से व्युत्पंन एक ध्रुवीय सेलुलर रचना है कि बारीकी से vivo में गैस्ट्रिक उपकला का प्रतिनिधित्व करता है बनाए रखने. यह देखते हुए कि गैस्ट्रिक कैंसर सेल लाइनों सेल संरचना इस तकनीक को प्रदर्शित नहीं करता है, वर्तमान प्रोटोकॉल वैकल्पिक खरोंच पर एक फायदा है-घाव परख तरीकों । इस पद्धति को अनुकूलित किया गया है जिससे monolayers पूरे organoids से या असंबद्ध organoids से एक ही सेल निलंबन से स्थापित किया जा सकता है और एक तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स या कोलेजन-कोटिंग का उपयोग कर चढ़ाया । इस प्रोटोकॉल के समग्र लक्ष्य एक उपंयास घाव भरने परख के लिए एक organoid व्युत्पंन गैस्ट्रिक उपकला monolayer संस्कृतियों की स्थापना है ।
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Protocol
संक्रमण से बचने के लिए, एक बाँझ ऊतक संस्कृति हुड के भीतर अपनी संपूर्णता में प्रोटोकॉल प्रदर्शन करते हैं । सिनसिनाटी के अनुमोदित विश्वविद्यालय आईआरबी प्रोटोकॉल (आईआरबी प्रोटोकॉल नंबर: २०१५-४८६९) के अनुसार लीव gastrectomy के दौर से गुजरने वाले मरीजों से मानव कोष ऊतक एकत्र किया गया ।
सभी माउस अध्ययन सिनसिनाटी संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) है कि मूल्यांकन और प्रयोगशाला पशु देखभाल (AAALAC) सुविधा के प्रत्यायन के एक अमेरिकी संघ का कहना है की विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया ।
1. मानव-व्युत्पन्न 3 डी गैस्ट्रिक funder Organoids की स्थापना
नोट: इस प्रोटोकॉल अनुसंधान पर आधारित है पहले इस प्रयोगशाला में प्रकाशित8।
- 3 डी organoid मीडिया जो ५०% Wnt-वातानुकूलित और 20% आर-spondin कंडीशन्ड मीडिया के होते है तैयार करते हैं ।
- Wnt कंडीशन्ड मीडिया तैयार करें, Wnt विकास माध्यम में संस्कृति एल कोशिकाओं (Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM), 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 1% पेनिसिलिन/streptomycin) 7 दिनों के लिए, मध्यम फसल, और एक ०.२२ µm फिल्टर का उपयोग कर फिल्टर.
- R-spondin वातानुकूलित मीडिया तैयार करें । बढ़ती एक संशोधित HEK-293T r-spondin स्रावित सेल लाइन आर में spondin विकास मध्यम (Dulbecco के संशोधित ईगल मध्यम (DMEM), 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 1% पेनिसिलिन/streptomycin) । 2 ज के बाद अनुलग्नक पर, इन कोशिकाओं से मध्यम OPTIMEM विकास मध्यम करने के लिए परिवर्तित करें, 1% पेनिसिलिन/Streptomycin. संस्कृति 7 दिनों के लिए कोशिकाओं । फिर फसल आर-spondin वातानुकूलित मीडिया और एक ०.२२ µm फ़िल्टर का उपयोग कर फिल्टर ।
नोट: यह प्रोटोकॉल पहले प्रकाशित किया गया है और एक अधिक विस्तृत प्रोटोकॉल के लिए 6,7,8देखें ।
- गल वृद्धि कारक कम, phenol लाल मुक्त तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स 16 के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर बर्फ पर एच । एक बड़े प्लास्टिक कंटेनर में बर्फ ठंडा Ca2 +/Mg2 +-मुक्त DBPS में ऊतक ले लीजिए । शुरुआत कदम १.४ तक बर्फ पर स्टोर ।
नोट: ऊतक आस्तीन gastrectomy से गुजर रोगियों से एकत्र किया जाता है । - संदंश का प्रयोग, ऊतक सख्ती से एक बाँझ चोंच में १०० मिलीलीटर सीए2 +/Mg2 +मुक्त Dulbecco के फॉस्फेट बफर खारा (DPBS) युक्त में धो. लगभग 30 एस या जब तक मलबे और रक्त को हटा दिया गया है के लिए धो लें । अगला, बाँझ धुंध का उपयोग करना, उपकला से श्लेष्मा परत दूर पोंछ.
- बड़े संदंश का प्रयोग, दृढ़ता से ऊतक और बल के साथ की मांसपेशी परत समझ, बड़े घुमावदार hemostatic संदंश का उपयोग कर उपकला दूर परिमार्जन. एक बाँझ, polystyrene पेट्री डिश में स्क्रैप उपकला टुकड़े ले लीजिए ।
- लगभग २.० x २.० mm2 आकार के टुकड़ों में उपकला ऊतक कीमा का उपयोग करने के लिए ऊतक पाचन का अनुकूलन । ऊतक टुकड़े धो ca के साथ2 +/Mg2 + -मुक्त DBPS एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक (ca2 +/Mg2 + मुक्त DPBS, 1% पेनिसिलिन/Streptomycin, ०.२५ मिलीग्राम/एमएल Amphotericin बी/10 मिलीग्राम/एमएल Gentamicin, ५० मिलीग्राम/एमएल कनमीसिन), जब तक धुल खून से मुक्त है । यदि आवश्यक हो तो एकाधिक बहाकर प्रदर्शन करें । सावधानी से एक बेकार चोंच में एक बाँझ धुंध के माध्यम से धोने को छानने से धोने त्यागें ।
- एक 25 मिमी हलचल बार और पूर्व गर्म मशीन मीडिया के साथ एक १२५ मिलीलीटर गिलास दौर नीचे कुप्पी में धोया टुकड़े ले लीजिए (बेसल मीडिया 2 मिमी L-glutamine के साथ पूरक, 1% पेनिसिलिन/Streptomycin, 10 मिमी HEPES बफर, 1 मिलीग्राम/एमएल Collagenase प्रकार 1, 2 मिलीग्राम/एमएल सेल संस्कृति ग्रेड गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन) । रबर सेपता के साथ गोल नीचे कुप्पी सील ।
- सेपता में एक 20 ग्राम रीढ़ की हड्डी डालें और इसे रबर hosing के साथ एक ऑक्सीजन टैंक से कनेक्ट करें । किसी भी दूषित पदार्थों को फ़िल्टर करने के लिए, एक फिल्टर बनाने के लिए टयूबिंग में टिशू पेपर डालें । ऑक्सीजन बहिर्वाह कम पर चालू करें । सेपता का टूटना से बचने के लिए सेपता में 10-15 बहिर्वाह सुई डालें ।
- एक अंगूठी के लिए सेट अप सुरक्षित clamps का उपयोग कर खड़े हो जाओ और यह एक जल स्नान में जगह 30-45 मिनट के लिए एक हलचल थाली के साथ ३७ ° c करने के लिए तुले । ऊतक 15 मिनट के लिए किया गया है के बाद, मशीन मीडिया के ५० µ एल निकालें और असंबद्ध ग्रंथियों के लिए नेत्रहीन की जांच करें । यदि ग्रंथियों घने नहीं है या ऊतक से अलग नहीं किया है, एक अतिरिक्त 5-10 मिनट के लिए छोड़ दें ।
- तुरंत मशीन के बाद, ५० मिलीलीटर पूर्व गरम DMEM/F12 एक बाँझ सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग कर या सीधे मशीन मिश्रण में डालने के द्वारा मशीन मीडिया के लिए जोड़ें ।
- ४ ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूबों में एक बाँझ धुंध के माध्यम से ग्रंथि मिश्रण फ़िल्टर । 15 मिनट के लिए बर्फ पर निस्पंदन रखने के लिए निकाला ग्रंथियों शंकु ट्यूब के नीचे करने के लिए व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देते हैं । बसे ग्रंथियों को परेशान करने के लिए नहीं सावधान रहना, हटाने और एक सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग कर supernatant के शीर्ष ४० मिलीलीटर बंद त्यागें । एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक DPBS के 10 मिलीलीटर में शेष 10 मिलीलीटर reसस्पेंड ।
- मिश्रण समान रूप से 5 मिलीलीटर सेल संस्कृति परीक्षण ट्यूबों में वितरित । 4 डिग्री सेल्सियस पर ६५ x g पर 5 मिनट के लिए केंद्रापसारक और supernatant ध्यान से एक पिपेट का उपयोग कर हटा दें । या तो एक पिपेट या एक २०० µ l चौड़े पिपेट टिप का उपयोग कर गल तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में ग्रंथि गोली reसस्पेंड । सजातीय तक मिश्रण ।
नोट: यह बर्फ पर इस कदम का प्रदर्शन करने के लिए महत्वपूर्ण है और तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के बहुलकीकरण से बचने के लिए जबकि मिश्रण । इसके अतिरिक्त, यह नेत्रहीन ५० µ एल के लिए नमूने द्वारा ग्रंथि घनत्व का निरीक्षण करने के लिए महत्वपूर्ण है । इष्टतम घनत्व ~ ७०% प्रवाह है । - अगले, प्लेट तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के ५० µ एल में ग्रंथियों का उपयोग कर एक व्यापक पिपेट इत्तला दे दी । जबकि चढ़ाना किसी भी बुलबुले उत्पादन से बचें ।
- polymerize करने के लिए तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स की अनुमति, ३७ डिग्री सेल्सियस पर 10-15 मिनट के लिए मशीन । अगर एक 12 अच्छी तरह से संस्कृति की थाली में चढ़ाना, hFGO मीडिया की 1 मिलीलीटर जोड़ें (उंनत Dulbecco के संशोधित ईगल मध्यम/2mM एल के साथ पूरक glutamine, 1% पेनिसिलिन/Streptomycin, ०.२५ मिलीग्राम/एमएल Amphotericin बी/10 मिलीग्राम/एमएल Gentamicin, ५० मिलीग्राम/एमएल कनमीसिन, 10 मिमी HEPES बफर, 1 मिमी n-Acteylcystine, 1 एक्स N2, 1 x B27, ५०% Wnt-वातानुकूलित मध्यम, 20% आर-spondin-वातानुकूलित मध्यम १०० एनजी के साथ पूरक है/एमएल बोन morphogenetic प्रोटीन अवरोध करनेवाला, 1 एनएम गैस्ट्रीन, ५० एनजी/एमएल एपिडर्मल वृद्धि कारक, २०० एनजी/एमएल Fibroblast वृद्धि फैक्टर 10, 10 mM Nicotinamide, और 10 µ एम वाय-२७६३२ रॉक अवरोधक) प्रति अच्छी तरह से । एक 12-अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट का उपयोग नहीं करते हैं, तो तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स बुलबुला जलमग्न करने के लिए पर्याप्त मीडिया जोड़ें ।
- संस्कृति एक 5% CO2 humidified सेल संस्कृति मशीन में ३७ ° c पर कोशिकाओं । बदलें मीडिया हर 4-5 दिन ।
2. माउस की स्थापना-3 डी गैस्ट्रिक funded Organoids व्युत्पंन
नोट: यह प्रोटोकॉल पहले 6प्रकाशित किया जा चुका है । बर्फ पर गल तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स और शुरुआत से पहले सभी एजेंट तैयार करते हैं ।
- अनुसंधान संस्था द्वारा अनुमोदित एक विधि का उपयोग कर चूहों का बलिदान जहां अनुसंधान किया जा रहा है । माउस से पेट निकालें और पहले से प्रकाशित प्रोटोकॉल के अनुसार 6काटना । 20 मिलीलीटर बर्फ ठंडा Ca2 +/Mg2 +मुक्त DBPS में धो लो ।
नोट: C57BL/6 चूहों, 8-10 सप्ताह की आयु, funder गैस्ट्रिक organoid संस्कृतियों के लिए उपयोग किया जाता है । चूहे पेट हटाने से पहले मैनुअल गर्भाशय ग्रीवा के बाद कार्बन डाइऑक्साइड की साँस लेना द्वारा euthanized थे । - पेट और किसी भी दिखाई रक्त वाहिकाओं से मांसपेशी परत पट्टी के रूप में पहले 6प्रकाशित ।
- कोटर और forestomach से fundus अलग एक बाँझ उस्तरा ब्लेड का उपयोग कर । कट fundus टुकड़ों में छोटे सर्जिकल कैंची का उपयोग लगभग २.० x २.० मिमी । संदंश का प्रयोग, एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब EDTA मशीन बफर युक्त (Ca2 +/Mg2 +मुक्त DPBS, 5 मिमी EDTA) और 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 एच के लिए के साथ मशीन में टुकड़े इकट्ठा कोमल आंदोलन ।
- एक बाँझ डाकू में, लगभग 5 मिनट के लिए बर्फ पर शंकु ट्यूब और टुकड़े छोड़ दें. एक पिपेट का उपयोग करने के लिए संभव के रूप में बहुत गर्मी बफर हटाने के रूप में टुकड़े अछूता छोड़ । 5 मिलीलीटर मिलाते बफर जोड़ें (1 जी डी-सोर्बिटोल, १.४७ जी सुक्रोज में १०० एमएल Ca2 +/Mg2 +मुक्त DPBS) और 2 मिनट के लिए एक बल के साथ हाथ से हिला । बड़े टुकड़ों को व्यवस्थित करने और जल्दबाजी के साथ, एक 1000p पिपेट का उपयोग करने की अनुमति दें, छोटे टुकड़ों को दूर करें जो अभी तक बसा है शीर्ष परत में ।
- 5 मिनट के लिए निकाले गए टुकड़ों को 4 डिग्री सेल्सियस पर ६५ x g पर स्पिन
- जबकि हवा के बुलबुले से परहेज, supernatant को हटाने, तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में reसस्पेंड और मिश्रण जब तक यह समरूप है ।
- एक व्यापक टिप पिपेट का उपयोग करने के लिए प्लेट तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स ५० µ एल पर अच्छी तरह से और फिर 20 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर मशीन ।
- पर्याप्त mFGO वृद्धि मीडिया जोड़ें (उंनत Dulbecco के संशोधित ईगल मध्यम/2mM एल के साथ पूरक glutamine, 1% पेनिसिलिन/Streptomycin, 10 mM HEPES बफर, 1mM एन-Acteylcystine, 1 x N2, 1 x B27, ५०% Wnt-वातानुकूलित मध्यम, 20% आर-spondin-वातानुकूलित १०० एनजी/एमएल बोन morphogenetic प्रोटीन अवरोधक, 10 एनएम गैस्ट्रीन, 50ng/एमएल एपिडर्मल वृद्धि कारक, 10 एनजी/एमएल Fibroblast विकास फैक्टर 10, और 10 µ एम वाई २७६३२ रॉक अवरोधक) के साथ पूरक मध्यम बुलबुला जलमग्न करने के लिए ।
- संस्कृति ३७ ° c, 5% कं2 humidified सेल संस्कृति मशीन पर कोशिकाओं । हर 4-5 दिन मीडिया बदलें ।
3.2 डी स्थानांतरण के लिए कोलेजन कोटिंग
नोट: जब तक अंयथा निर्दिष्ट एक बाँझ ऊतक संस्कृति हूड में सभी प्रक्रियाओं का प्रदर्शन । monolayer के लिए 3 डी organoids स्थानांतरित करने से पहले कोलेजन कोटिंग 24 एच शुरू करो । बर्फ पर चूहे की पूंछ कोलेजन रखो और प्रकाश से ढाल । कोलेजन लेपित प्लेटें अप करने के लिए 2 सप्ताह के लिए अच्छा कर रहे हैं । यदि लेपित प्लेटों का उपयोग नहीं कर तुरंत, parafilm में थाली और 4 डिग्री सेल्सियस पर दुकान लपेटो जब तक की जरूरत है ।
- चूहे पूंछ कोलेजन को ५० µ g/एमएल पतला 20 मिमी एसिटिक एसिड का उपयोग कर ।
- पर्याप्त पतला कोलेजन के साथ अच्छी तरह की सतह को कवर । एक के लिए एक अच्छी तरह से 12-अच्छी थाली, लगभग कोलेजन के साथ 1 मिलीलीटर के साथ कोट में । एक बाँझ डाकू में कमरे के तापमान पर रात भर छोड़ दें ।
- 1 मिलीलीटर Ca2 +/Mg2 +-अच्छी तरह से प्रति मुक्त DPBS और एक बाँझ डाकू में कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए खुला छोड़ के साथ दो बार धो लो ।
4.2 डी स्थानांतरण के लिए तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स कोटिंग
नोट: जब तक अंयथा निर्दिष्ट एक बाँझ ऊतक संस्कृति हूड में सभी प्रक्रियाओं का प्रदर्शन । monolayer के लिए 3 डी organoids स्थानांतरित करने से पहले तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स कोटिंग 2 एच शुरू करो । बर्फ पर तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स रखो । लेपित प्लेटें तुरंत इस्तेमाल किया जा रहे है और समय की एक विस्तारित अवधि के लिए संग्रहीत नहीं किया जा सकता है ।
- एक 1:10 अनुपात में एक सेल संस्कृति ग्रेड पानी के साथ एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स पतला । बर्फ पर पतला ।
- एक पिपेट का उपयोग कर एक मानक 12 अच्छी तरह से प्लेट के एक अच्छी तरह से पतला तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के १०० µ एल जोड़ें । एक सेल खुरचनी का प्रयोग, समान रूप से एक भी कोट के लिए अच्छी तरह भर पतला तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स वितरित ।
- 1 एच के लिए ३७ ° c पर मशीन ।
- 3 डी organoids स्थानांतरित करने से पहले 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर एक पिपेट और शुष्क का उपयोग अवशिष्ट पानी निकालें ।
5.2d गैस्ट्रिक उपकला कोशिका Monolayers के लिए 3 डी एम/hFGOs का स्थानांतरण
- 3 डी माउस के बाद-या मानव व्युत्पंन FGOs 6-7 दिनों के लिए किया गया है, 2d monolayer के लिए 3 डी organoids के हस्तांतरण शुरू करते हैं ।
नोट: के लिए एक monolayer आवश्यक यह ३०० बरकरार organoids या एकल कोशिकाओं ३०० organoids से व्युत्पंन का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है की एक अच्छी तरह से । एक मजबूत संस्कृति में यह लगभग १५० organoid/अच्छी तरह से एक 12 अच्छी तरह से संस्कृति की थाली के भीतर प्राप्त करने की उंमीद है । - सुनिश्चित करें कि प्लेटें स्थानांतरित करने से पहले लेपित हैं ।
नोट: तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स लेपित प्लेटों एक पारदर्शी जेल परत है, तथापि, कोलेजन लेपित प्लेटों कोटिंग के किसी भी स्पष्ट संकेत नहीं होगा । - सीधे pipetting द्वारा प्लेट से 3 डी तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स बुलबुला बेदखल 1 मिलीलीटर बाँझ Ca2 +/Mg2 +-बुलबुला के केंद्र पर नि: शुल्क DBPS.
- एक पिपेट का उपयोग कर, सेल संस्कृति परीक्षण ट्यूबों में तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स और organoid मिश्रण इकट्ठा । ट्यूब प्रति 2 तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स बुलबुले के अनुपात में ले लीजिए । ४० x g और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए केंद्रापसारक ।
- एक वैक्यूम प्रणाली का प्रयोग, supernatant और जितना संभव हो उतना तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स को हटा दें । Ca के 4 मिलीलीटर में reसस्पैंड2 +/Mg2 +-मुक्त DBPS, supernatant को हटा दें, और 2-3 बार दोहराएं । पूरे organoid स्थानांतरण प्रोटोकॉल के लिए, चरण ५.१० के लिए आगे बढ़ें । एकल कक्ष निलंबन प्रोटोकॉल के लिए ५.७ चरण के लिए जारी रखें ।
- ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए पूर्व गर्म सेल टुकड़ी समाधान और प्रत्येक टेस्ट ट्यूब के लिए 1 मिलीलीटर जोड़ें । धीरे या तो पलटना ट्यूब या ऊपर और एक पिपेट के साथ नीचे pipetting द्वारा मिश्रण । ३७ डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए मशीन ।
- Ca के 2 मिलीलीटर2 +/Mg2 +-सीधे प्रत्येक परीक्षण ट्यूब के लिए नि: शुल्क DBPS जोड़ें ।
- एक 26 जी सुई का प्रयोग करें और मिश्रण सिरिंज 2-3 बार । नेत्रहीन एकल कक्षों के लिए जांच करें । सिरिंज 1-2 अधिक बार अगर वहां अभी भी organoids या कोशिकाओं के समूहों रहे हैं ।
- 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ४० x g पर केंद्रापसारक । 2 डी FGO मीडिया (2d माउस FGO विकास माध्यम: उंनत Dulbecco के संशोधित ईगल मध्यम/F12 मध्यम 2mM L-glutamine, 10 mm पेनिसिलिन/Streptomycin, 10% भ्रूण बछड़ा सीरम, 10 मिमी HEPES बफर, 1 एक्स N2, 1 एक्स B27 के साथ पूरक में गोली reसस्पेंड, 10 एनएम गैस्ट्रीन, ५० एनजी/एमएल एपिडर्मल वृद्धि कारक, 1 µ m TGF-β अवरोध करनेवाला, और 10 µ एम वाई-२७६३२ रॉक अवरोधक के साथ पूरक । 2d मानव FGO विकास माध्यम: उंनत Dulbecco के संशोधित ईगल मध्यम/2mM एल के साथ पूरक-glutamine, 1% पेनिसिलिन/Streptomycin, 10 मिमी HEPES बफर, 10% भ्रूण बछड़ा सीरम, 10 मिमी Nicotinamide, 1 एक्स N2, 1 एक्स B27, ५० मिलीग्राम के साथ पूरक/एमएल कनमीसिन, ५० एनजी/एमएल एपिडर्मल वृद्धि फैक्टर, और 10 µ एम वाई-२७६३२ रॉक अवरोध करनेवाला, 1 µ m TGF-β अवरोध करनेवाला).
- प्लेट लेपित प्लेटों पर पुनर्निलंबन । ३७ डिग्री सेल्सियस पर मशीन प्लेट । मीडिया को बदलें हर 4 दिन या पहले अगर मीडिया पीला हो जाता है । Monolayer लगभग 4 दिनों के लिए फार्म की आवश्यकता है ।
6. खरोंच घाव परख 2 डी गैस्ट्रिक उपकला कोशिका Monolayers का उपयोग
- एक उस्तरा ब्लेड का प्रयोग, monolayer खरोंच जब संस्कृति १००% प्रवाह तक पहुंच गया है ।
- फिक्स monolayers कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए ३.७% formaldehyde का उपयोग कर । कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए ०.५% गैर ईओण डिटर्जेंट/
- अगले ब्लॉक monolayers 1 के लिए 2% गधा सीरम के साथ कमरे के तापमान पर और एच के 1:1000 कमजोर पड़ने के साथ गर्मी+, कश्मीर+-ATPase प्राथमिक 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर एंटीबॉडी, ०.१% गैर ईओण डिटर्जेंट के साथ धो/ विरोधी माउस ४८८ माध्यमिक एंटीबॉडी और 10μg/एमएल Hoechst सेल नाभिक के लिए 1 घंटे के तापमान पर कमरे में दाग ।
- 2 डी मानव व्युत्पंन गैस्ट्रिक monolayer संस्कृतियों में सतह श्लेष्मा गड्ढे कोशिकाओं की पहचान करने के लिए, दाग कोशिकाओं के साथ 20 μg/mL के Ulex europaeus (UEAI) FITC संयुग्मी । एक फोकल माइक्रोस्कोप पर छवि monolayers ।
- घाव की छवियों को ले हर कुछ ज. स्क्रैच monolayer और रोगियों के बीच भिन्नता की गुणवत्ता के आधार पर 24-48 एच के बीच फिर से epithelialize जाएगा.
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Representative Results
Organoids या तो मानव या fundus के माउस पेट के ऊतकों (चित्र 1a) के कॉर्पस/ या तो collagenase या EDTA मानव या माउस के पाचन-क्रमशः पेट ऊतक व्युत्पंन के बाद, ग्रंथियों तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में एंबेडेड और 6-7 दिनों(चित्र 1a) के लिए प्रसंस्कृत कर रहे हैं । चित्रा 1b मानव व्युत्पंन गैस्ट्रिक organoids (huFGOs) है कि फिर तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स लेपित चैंबर स्लाइड पर एक गैस्ट्रिक उपकला monolayer (huGEM) को हस्तांतरित किया गया है के गठन को दर्शाता है । संस्कृति के 4 दिनों के बाद, धाराप्रवाह huGEMs खरोंच घाव परख (आंकड़ा 1b) के लिए इस्तेमाल किया गया । huGEM के एक समय चूक विश्लेषण से एकत्र छवियां 24 घंटे की अवधि में संस्कृति के भीतर घाव बंद दिखाया (चित्रा 2) ।
HuGEMs प्रमुख कोशिका वंश देशी पेट के ऊतकों में पाया व्यक्त करने के लिए पाए गए । इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला एक ध्रुवीकरण ई cadherin की अभिव्यक्ति का पता चला-सकारात्मक monolayer कि पार्श्विका के शामिल (चित्र बी, सी) और सतह श्लेष्म (चित्र बी, डी) कोशिकाओं. पीसीआर विश्लेषण इन monolayers से एकत्र आरएनए का उपयोग मुख्य और श्लेष्मा गर्दन कोशिकाओं के अलावा पार्श्विका और सतह श्लेष्म कोशिकाओं की अभिव्यक्ति की पुष्टि की (चित्रा 3E) । धाराप्रवाह huGEMs भी कुछ proliferating कोशिकाओं (चित्रा 3F) व्यक्त की है । खरोंच घाव परख के भीतर इन प्रमुख कोशिका वंश का विश्लेषण पार्श्विका, मुख्य, श्लेष्मा गर्दन की सतह श्लेष्म कोशिकाओं पर एक 24 घंटे समय अवधि (चित्र 4a, बी) की निरंतर अभिव्यक्ति से पता चला । सामूहिक रूप से, इन आंकड़ों को उपंयास संस्कृति प्रणाली के रूप में huGEMs के उपयोग के लिए इन विट्रो मेंगैस्ट्रिक पुनर्जनन अध्ययन का प्रदर्शन ।
चित्र 1: मानव व्युत्पंन गैस्ट्रिक organoids (huFGO) और प्राथमिक गैस्ट्रिक उपकला monolayers (huGEM) की पीढ़ी । (क) मानव गैस्ट्रिक ऊतक और माउस पेट के प्रतिनिधि छवियों organoid संस्कृति के लिए ग्रंथियों उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया. रेखांकित क्षेत्र माउस पेट के funded क्षेत्र को इंगित करता है । (ख) मानव-व्युत्पंन गैस्ट्रिक organoids (huFGOs) की पीढ़ी है कि मानव व्युत्पंन गैस्ट्रिक उपकला monolayers (huGEMs) की संस्कृति के लिए उपयोग किया जाता है । huGEM के प्रतिनिधि छवि खरोंच के बाद घायल क्षेत्र दिखा । स्केल बार = ५०० माइक्रोन कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 2: खरोंच-घाव परख । प्रतिनिधि छवियों को खरोंच घाव के बाद huGEM 0, 8, 16, और 24 एच का उपयोग कर एक समय चूक प्रयोग से एकत्र की । स्केल बार = ५०० माइक्रोन कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 3: huGEM संस्कृतियों में प्रमुख कोशिका वंश की अभिव्यक्ति । इम्यूनोफ्लोरेसेंस की अभिव्यक्ति का प्रदर्शन huGEM संस्कृतियों के दाग ( क) ई cadherin (Ecad, लाल), सतह श्लेष्मा कोशिकाओं (UEAI, हरा) और नाभिक (Hoechst, नीला), और (ख) ई cadherin (Ecad, लाल), पार्श्विका कोशिकाओं (एच, ग्रीन) और नाभिक ( Hoechst, नीला) । अलग चैनल (C) और (D)में दिखाए जाते हैं । (ङ) आरटी-पीसीआर huGEMs से H+K+-ATPase (ATP4a), pepsinogen सी (PgC), MUC5AC, और MUC6 की अभिव्यक्ति के लिए निकाली गई आरएनए का उपयोग किया गया था । (च) EdU (red) द्वारा निर्धारित huGEM संस्कृति के भीतर Proliferating कक्ष । स्केल बार (A-D) = ५० माइक्रोन, स्केल बार (F) = १०० माइक्रोन । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 4: खरोंच में कोशिका वंश अभिव्यक्ति में परिवर्तन घाव परख । इम्यूनोफ्लोरेसेंस huGEM संस्कृतियों के दाग ई cadherin की अभिव्यक्ति का प्रदर्शन (Ecad, लाल) या सतह श्लेष्म कोशिकाओं (UEAI, हरे) या पार्श्विका कोशिकाओं (एच, ग्रीन) और नाभिक (Hoechst, नीला) huGEM संस्कृतियों से एकत्र स्लाइड का उपयोग कर 0, 8, 16, और 24 hrs पोस्ट खरोंच-घाव । Bkgrd = स्लाइड पर तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स की पृष्ठभूमि धुंधला । XY-अक्ष स्केल पट्टी से 0-400 माइक्रोन । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
| माउस 3 डी मीडिया | स्टॉक समाधान | कार्य एकाग्रता |
| nAcetylcysteine | पाउडर | 1 मिमी |
| गैस्ट्रीन | १० µ मी | 10 एनएम |
| Egf | ५०० µ g/mL | ५० एनजी/ |
| नोगिन | १०० µ g/mL | १०० एनजी/ |
| FGF10 | १०० µ g/mL | १०० एनजी/ |
| YCMD | 10 एमएम | १० µ मी |
| B27 | 50x | 1x |
| N2 | 100x | 1x |
| कलम Strep/ | 1 मीटर | 10 एमएम |
| HEPES | 1 मीटर | 10 एमएम |
| Glutamax | २०० एमएम | 2 मिमी |
| WNT | ५०% v/ | |
| आर-Spondin | १०% वि. वि./ |
तालिका 1: माउस 3d मीडिया घटक ।
| माउस 2d मीडिया | स्टॉक समाधान | कार्य एकाग्रता |
| Fcs | १००% | 10% |
| YCMPD | 10 एमएम | १० µ मी |
| गैस्ट्रीन | १० µ मी | 10 एनएम |
| Egf | ५०० µ g/mL | ५० एनजी/ |
| B27 | 50x | 1x |
| N2 | 100x | 1x |
| कलम Strep/ | 1 मीटर | 10 एमएम |
| HEPES | 1 मीटर | 10 एमएम |
| Glutamax | २०० एमएम | 2 मिमी |
| TGF-β अवरोध करनेवाला | 10 एमएम | 1 µ m |
तालिका 2: माउस 2d मीडिया घटक ।
| मानव 3 डी मीडिया | स्टॉक समाधान | कार्य एकाग्रता |
| Nicotinamide | पाउडर | 10 एमएम |
| nAcetylcysteine | पाउडर | 1 मिमी |
| गैस्ट्रीन | १० µ मी | 1 एनएम |
| Egf | ५०० µ g/mL | ५० एनजी/ |
| नोगिन | १०० µ g/mL | १०० एनजी/ |
| FGF10 | १०० µ g/mL | २०० एनजी/ |
| YCMD | 10 एमएम | १० µ मी |
| B27 | 50x | 1x |
| N2 | 100x | 1x |
| कलम Strep/ | 1 मीटर | 10 एमएम |
| HEPES | 1 मीटर | 10 एमएम |
| Glutamax | २०० एमएम | 2 मिमी |
| कनमीसिन | 1 मीटर | 10 एमएम |
| Amphotericin B गेन्तमयसीं/ | १२५ µ g/mL | 1 मिमी |
| WNT | ५०% v/ | |
| आर-Spondin | १०% वि. वि./ |
तालिका 3: मानव 3 डी मीडिया घटकों ।
| मानव 2d मीडिया | स्टॉक समाधान | कार्य एकाग्रता |
| Fcs | १००% | 10% |
| YCMPD | 10 एमएम | १० µ मी |
| गैस्ट्रीन | १० µ मी | 1 एनएम |
| Egf | ५०० µ g/mL | ५० एनजी/ |
| B27 | 50x | 1x |
| N2 | 100x | 1x |
| कलम Strep/ | 1 मीटर | 10 एमएम |
| HEPES | 1 मीटर | 10 एमएम |
| Glutamax | २०० एमएम | 2 मिमी |
| TGF-β अवरोध करनेवाला | 10 एमएम | 1 µ m |
| Nicotinamide | पाउडर | 10 एमएम |
| कनमीसिन | 1 मीटर | 10 एमएम |
तालिका 4: मानव 2d मीडिया अवयव ।
| प्रयोगात्मक समस्या | समस्या निवारण टिप |
| Monolayers organoids से फार्म लेने में विफल | 1) इस प्रोटोकॉल के लिए इष्टतम संवर्धन शर्तों प्रयोगात्मक जरूरतों के बीच बदलती हैं । मानव और माउस organoids से व्युत्पंन monolayers पतला तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स का उपयोग करते हुए जब कांच या प्लास्टिक संस्कृति व्यंजन का उपयोग कर संस्कृति होना चाहिए । हालांकि, चूहे पूंछ कोलेजन माउस या मानव मूल है कि पॉलिएस्टर झिल्ली आवेषण की आवश्यकता के monolayer प्रयोगों के लिए इष्टतम है । 2) इष्टतम संवर्धन शर्तों प्रयोगात्मक सेट अप के आधार पर बदलती हैं । एकल सेल निलंबन का उपयोग संस्कृतियों आदर्श 3 डी FGO मीडिया के साथ, जबकि बरकरार organoids 2 डी FGO मीडिया के साथ संस्कृति रहे है संस्कृति रहे हैं । |
| वृद्ध रोगियों से व्युत्पंन Monolayers (> 55 वर्ष) या चूहों (> 18 महीने) बढ़ने और प्रवाह तक पहुंचने में विफल | यदि पेट ऊतक वृद्ध चूहों से एकत्र का उपयोग (> 18 महीने) या रोगियों (> 55 वर्ष) monolayer की पीढ़ी के लिए इस्तेमाल किया organoids का घनत्व दोगुना किया जाना चाहिए कि organoids की वृद्धि क्षमता में कमी आई है । |
| Organoids ग्रंथियों से फार्म करने में विफल | यह सिफारिश की है कि ताजा (नए खरीदा यदि संभव हो तो) गैस्ट्रीन इस्तेमाल किया जा । नए सिरे से फिर से निलंबित गैस्ट्रीन हर 4 महीने का उपयोग करें । |
| Organoids अनुलग्न करने और प्रपत्र monolayers करने में विफल | सुनिश्चित करें कि तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के कुशल हटाने monolayers के लिए संस्कृति प्लेटों को हस्तांतरण के लिए कटाई organoids के बाद हासिल किया गया है । |
| आयु वर्ग के रोगियों (> 55 वर्ष) या चूहों (> 18 महीने) से प्राप्त संस्कृतियों विफल | पाचन और मशीन अवधि के दौरान, प्रारंभिक मशीन के 15-30 मिनट के रूप में आवश्यक मशीन के 5 मिनट के अंतराल के बाद पर्याप्त है । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि रोगियों को अधिक से अधिक उम्र के ५५ वर्ष ग्रंथियों कि अधिक आसानी से असंबद्ध हैं और इसलिए कम पाचन की आवश्यकता हो सकती है. इसी तरह, FGOs वृद्ध रोगियों से व्युत्पंन धीमी वृद्धि समय प्रदर्शित किया है और वृद्धि की संवेदनशीलता के लिए केंद्रापसारक । सबसे अच्छा परिणाम प्राप्त करने के लिए, किसी भी अतिरिक्त केंद्रापसारक सीमा जब वृद्ध ऊतक के साथ काम करने और एक समय पर ढंग से मीडिया की जगह । |
तालिका 5: समस्या निवारण युक्तियां. सामना करना पड़ा मुद्दों और इष्टतम स्थापना और मानव या माउस गैस्ट्रिक monolayers की संस्कृति के लिए अनुशंसित संकल्प ।
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Discussion
वर्तमान प्रोटोकॉल विवरण मानव की स्थापना और माउस व्युत्पंन गैस्ट्रिक उपकला monolayers कि खरोंच के लिए इस्तेमाल किया जा सकता घाव परख । प्रोटोकॉल प्राथमिक मानव (या माउस) ऊतकों से निवासी स्टेम सेल अलगाव की अवधारणा पर निर्भर करता है और एक संशोधित पहले Schlaermann एट अल7द्वारा प्रकाशित प्रोटोकॉल है । विशेष रूप से, हम यहां प्रोटोकॉल अनुकूलित किया है एक धाराप्रवाह और ध्रुवीय गैस्ट्रिक उपकला monolayer जो प्रमुख कोशिका वंश जो vivo मेंगैस्ट्रिक उपकला के भीतर पाया जा सकता है व्यक्त की स्थापना के लिए । गैस्ट्रिक अल्सर मरंमत एक जटिल प्रक्रिया है कि ऊतक पुनः epithelialization, पुनर्जनन, और प्रसार9,10,11शामिल है । विशेष रूप से, हमारी प्रयोगशाला ने बताया है कि गैस्ट्रिक उपकला के पुनर्जनन spasmolytic पॉलीपेप्टाइड के उद्भव के साथ मेल खाता है/trefoil फैक्टर (TFF) 2-व्यक्त metaplasia (SPEM) के भीतर अल्सर मार्जिन चूकने वाले गैस्ट्रिक ग्रंथियों 12,13. SPEM एक श्लेष्मा कोशिका metaplasia में मुख्य कोशिका वंश के transdifferentiation के रूप में परिभाषित किया गया है14 कि चोट के साथ उभर और गायब हो जाता है जब म्यूकोसा अपनी सामान्य सेलुलर रचना12के लिए रिटर्न. इस प्रकार, एक इन विट्रो प्रणाली में इस तरह के एक तंत्र का अध्ययन करने के लिए, यह आवश्यक है कि प्रमुख कोशिकाओं के रूप में मुख्य सेल वंश, संस्कृति के भीतर मौजूद हैं.
खरोंच का उपयोग घाव परख बड़े पैमाने पर मरंमत और पुनर्जनन के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया गया है, और हाल ही में जब तक, गैस्ट्रिक कैंसर सेल लाइनों का इस्तेमाल किया गया1,2,3,4। जबकि बुनियादी तंत्र गैस्ट्रिक कैंसर कोशिकाओं लाइनों का उपयोग कर पता चला गया है, इन संस्कृतियों बदल रहे है और देशी पेट के ऊतकों की सेलुलर विविधता की कमी है । HuGEMs एक ध्रुवीकरण और विविध सेलुलर संरचना है कि बारीकी से vivo मेंगैस्ट्रिक उपकला recapitulates को बनाए रखने के लिए दिखाए जाते हैं । इसके अतिरिक्त, प्रवाह huGEM संस्कृतियों तक पहुंचने के बाद इष्टतम स्थितियों में एक महीने के लिए बनाए रखा जा सकता है । विस्तारित संस्कृतियों दीर्घकालिक प्रयोगों के लिए अनुमति देते हैं । इस प्रकार, huGEMs है कि विचार किया जा सकता है के भविष्य के अनुप्रयोगों के monolayer/प्रतिरक्षा सेल सह संस्कृतियों और दीर्घकालिक प्रयोगों के अध्ययन के लिए Helicobacter हेलिकोबेक्टर रोगजनन ।
वर्तमान प्रोटोकॉल में नोट करने के लिए महत्वपूर्ण तकनीकी पहलू हैं । पहली तकनीकी बात यह है कि तहखाने झिल्ली घटक के विकल्प सेल संस्कृति की सतह है कि प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है के आधार पर बदलता है । सुनिश्चित करें कि इष्टतम monolayer शर्तों तक पहुंच रहे हैं, यह अनुशंसित है कि कोलेजन प्रयोग किया जाता है जब monolayers के साथ प्रयोग पॉलिएस्टर झिल्ली आवेषण के साथ प्लेट की आवश्यकता होती है । हालांकि, अगर monolayer प्रयोगों कांच या प्लास्टिक की संस्कृति सतहों की आवश्यकता, पतला तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स कोटिंग के इष्टतम विकल्प है । दूसरा, एक धाराप्रवाह monolayer तक पहुँचने के लिए आवश्यक organoids का घनत्व रोगी की उम्र के आधार पर समायोजित किया जाना चाहिए जिसमें से गैस्ट्रिक ऊतक एकत्र की है. ऊतक वृद्ध चूहों (> 18 महीने) या रोगियों (> 55 वर्ष) से एकत्र के लिए, organoid घनत्व का इस्तेमाल किया दोहरा वृद्धि की जानी चाहिए जब एक monolayer को स्थानांतरित वृद्ध व्यक्तियों में कम वृद्धि क्षमता के कारण. पाचन और मानव वृद्ध रोगियों से व्युत्पंन ऊतक की गर्मी के दौरान, ग्रंथियों और अधिक पृथक्करण और केंद्रापसारक के लिए अतिसंवेदनशील हो सकता है और इसलिए: 1) के रूप में संभव के रूप में संयमित किया जाना चाहिए, 2) मीडिया लगन से प्रतिस्थापित, और 3) पाचन के दौरान 15 से 30 मिनट की गर्मी 5 मिनट के वृद्धिशील डाइजेस्टर के साथ बाद में पाचन की संभावना कम हो जाएगा । अंत में, जब organoid से monolayers बनाने-एकल सेल सस्पेंशन, 3 डी FGO मीडिया monolayers के समुचित गठन के लिए सबसे इष्टतम है जबकि जब संवर्धन बरकरार organoids से, 2d FGO मीडिया को उच्चतम दक्षता उपज मनाया गया है ।
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
इस काम को NIH (NIDDK) 5 R01 DK083402-07 ग्रांट (YZ) द्वारा सपोर्ट किया गया ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced Dulbecco's modified Eagle/F12 medium (basal media) | Life Technologies | 12634-010 | |
| GlutaMAX (L-glutamine) | Life Technologies | 25030-081 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Scientific | SV30010 | |
| Amphotericin B/Gentamicin | Thermo Scientific | R01510 | |
| Kanamycin | Thermo Fisher | RO1510 | |
| HEPES Buffer | Sigma Aldrich | H0887 | |
| n-Acetylcystine | Sigma Aldrich | A9165 | |
| N2 | Life Technologies | 17502-048 | |
| B27 | Life Technologies | 12587-010 | |
| BMP Inhibitor (Noggin) | Pepro Tech | 250-38 | |
| Gastrin | Tocris | 3006 | |
| EGF | Pepro Tech | 315-09 | |
| FGF10 | Pepro Tech | 100-26 | |
| Nicotinamide | Sigma Aldrich | N0636 | |
| Y-27632 ROCK Inhibitor | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| TGF-β Inhibitor | Tocris | 2939 | |
| Ca2+/Mg2+ -free DPBS | Fisher | 21-031CV | |
| Dulbecco's modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 12634-010 | |
| Fetal Bovine Serum | FBS | ||
| OPTIMEM | Invitrogen | ||
| 0.22µM filter | Fisher | 099-720-004 | |
| 37 °C Water Bath | |||
| Collagenase Type 1 | Worthington | LS004214 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9418 | |
| Kimwipes (tissue paper) | Fischer Scientific | 06-666C | |
| 125 mL round bottom flask | |||
| 1 in (25 mm) stir bar | |||
| Rubber Septa | |||
| Sterile Gauze | |||
| Stir Plate | |||
| Ring Stand | |||
| Ring Stand Clamps | |||
| Sterile petri dish | |||
| 18 G needles of 1.5 in length | Thermo Fisher | 305196 | |
| 20 G spinal needles of 3.5 in length | Thermo Fisher | 405182 | |
| 12-well cell culture treated plate | Midwest Scientific | 92012 | |
| Growth Factor Reduced, Phenol Red-free MatrigelTM (Basement membrane matrix) | Fisher | CB-40230C | |
| Sterile Razor Blades | |||
| Wide-tip tweezers | |||
| Curved Hemostatic Forceps | |||
| 200 µL wide pipette tips | Thermo Fisher | 02-707-134 | |
| 5 mL cell culture test tubes | Fisher | 14-956-3C | |
| Oxygen Tank with rubber hosing | |||
| 1 g D-Sorbitol | |||
| Sucrose | Fisher | SS-500 | |
| Dissecting microscope | |||
| Dissecting Tray | |||
| Rocking Table | |||
| Rat Tail Collagen Type 1 | Life Technologies | A10483-01 | |
| Cell culture grade glacial acetic acid | Fisher | A38-212 | |
| Cell culture grade water | Corning | 25-055-CV | |
| 2-well chamber slide | Thermo Fisher | 155380 | |
| 12-well Transwell (polyester membrane inserts) | Corning | 3460 | |
| Cell scraper | Corning | 353086 | |
| Accutase (cell detachment solution) | Stemcell Technologies | 7920 | |
| 263/8 G syringe | Thermo Fisher | 309625 | |
| Razor blade | |||
| L Cells | L cells, a Wnt3a producing cell line, were received as a gift from Dr. Hans Clevers (Hubrecht Institute for Developmental Biology and Stem Cell Research, Netherlands). | N/A | |
| HEK-293T Rspondin secreting cells | A modified HEK-293T R-spondin secreting cell line was obtained from Dr. Jeff Whitsett (Section of Neonatology, Perinatal and Pulmonary Biology, Cincinnati Children's Hospital Medical Centre and The University of Cincinnati College of Medicine, Cincinnati, USA ). | N/A | |
| HK-ATPase Primary Antibody | Invitrogen | SC-374094 | |
| E-Cadherinn | SantaCruz | sc-59778 | |
| UEA1 | Sigma Aldrich | L9006 | |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher | H3570 | |
| Alexafluor 488 secondary antibody (Donkey anti-mouse 488 secondary antibody) | ThermoFisher Scientific | R37114 |
References
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