Summary
Här beskriver vi ett protokoll för att upprätta och odla mänskliga - och mus-härledda 3-dimensionell (3D) gastric organoids, och metoden för överföring av 3D organoids till en 2-dimensionell enskiktslager. Användningen av den gastric epitelial enskiktslager som en roman scratch-sår-analysen för regenerering studier beskrivs också.
Abstract
In vitro studier av gastric såret reparation innebär vanligtvis användning av gastric cancer cellinjer i en scratch-sår-analys av cellulär proliferation och migration. En viktig begränsning av sådana analyser, är dock deras homogen sortiment av cellulära typer. Reparation är en komplex process som kräver samverkan mellan flera celltyper. Därför, för att studera en kultur saknar cellulär subtyper, är ett problem som måste övervinnas om vi ska förstå reparationsprocessen. Den gastric organoid modellen kan lindra problemet varigenom den heterogena samlingen av celltyper nära återspeglar gastric epitel eller andra infödda vävnader i vivo. Visat här är en roman, in vitro- scratch-såret analys härrör från mänskliga eller mus 3-dimensionella organoids som sedan kan överföras till en gastric epitelial enskiktslager som antingen intakt organoids eller som en enda cellsuspension av skiljas organoids. Syftet med protokollet är att upprätta organoid-derived gastric epitelial enskiktslager som kan användas i en roman scratch-såret assay system för att studera gastric regenerering.
Introduction
Användning av scratch-såret analyser är en populär metod för att studera reparation och förnyelse1,2,3,4,5,6. Den föreslagna metoden kan användas för att specifikt studera gastric regenerering och Helicobacter pylori kolonisering. I förflutnan, gastric cancer cellinjer har använts som ett sätt för att studera Helicobacter pylori (H. pylori) infektion1,2 och fram till nyligen gastric cancer cellinjer som AGS celler var gynnade1 ,2,3,4. En begränsning av magsäckscancer cellkulturer är deras misslyckande att sammanfatta den cellulära mångfalden av gastric epitel. För att försöka ta itu med denna begränsning, visat här är etablering och överföring av primära mänskliga - och mus-härledda 3-dimensionella fundic gastric organoids (FGOs) att en gastric epitelial enskiktslager för såret helande analyser baserat på en modifierad metod först beskrivs av Schlaermann et al. 7 vi bevisa att gastric epitelial enskiktslager härrör från klippt 3D gastric FGOs eller FGO-derived enstaka celler behålla en polariserad cellulära sammansättning som nära motsvarar som av gastric epitel invivo. Med tanke på att gastric cancer cellinjer inte visar cell sammansättning denna teknik visar, har det nuvarande protokollet en fördel över alternativa scratch-såret testmetoderna. Denna metod har optimerats whereby enskiktslager kan vara etablerade från hela organoids eller från en enda cell avstängning från dissocierade organoids och guldpläterade med en basalmembranet matris eller kollagen-beläggning. Det övergripande målet med detta protokoll är att upprätta en organoid härrör gastric epitelial enskiktslager kulturer för en roman såret helande analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
För att undvika kontaminering, utföra protokollet i sin helhet inom en steril vävnadsodling huva. Mänsklig fundic vävnad samlades in från patienter som genomgår hylsa gastrektomi enligt godkända University of Cincinnati IRB protokollet (IRB protokollnummer: 2015-4869).
Alla mus studier godkändes av University of Cincinnati institutionella djurens vård och användning kommittén (IACUC) som upprätthåller en American Association of Assessment och ackreditering av Laboratory Animal Care (AAALAC) anläggning.
1. upprätta människa 3D Gastric Fundic Organoids
Obs: Detta protokoll baseras på forskning som tidigare publicerats i denna lab8.
- Förbereda 3D organoid media som består av 50% Wnt-villkorade och 20% R-spondin luftkonditionerade medier.
- Förbereda Wnt luftkonditionerade medier, kultur L cellerna i Wnt odlingsmedium (Dulbecco ändrade Eagle Medium (DMEM), 10% fetalt bovint serum (FBS), 1% Penicillin/streptomycin) i 7 dagar, skörda medium och filtrera med hjälp av ett 0,22 µm filter.
- Förbered R-spondin luftkonditionerade. Växer en modifierad HEK-293T R-spondin utsöndrar cellinje i R-spondin odlingsmedium (Dulbecco ändrade Eagle Medium (DMEM), 10% fetalt bovint serum (FBS), 1% Penicillin/streptomycin). Vid kvarstad efter 2 h, ändra mediet från dessa celler till OPTIMEM tillväxt medium, 1% Penicillin/Streptomycin. Odla cellerna i 7 dagar. Sedan skörda R-spondin luftkonditionerade media och filtrera med hjälp av ett 0,22 µm filter.
Obs: Detta protokoll har publicerats tidigare och för en mer detaljerad protokoll avse 6,7,8.
- Tina tillväxtfaktor reducerad, fenolrött-fri basalmembranet matris för 16 h på isen vid 4 ° C. Samla in vävnaden i den iskalla Ca2 +/Mg2 +-gratis DBPS i en stor plastbehållare. Lagra på isen tills början steg 1.4.
Obs: Vävnad som samlas in från patienter som genomgår hylsa gastrektomi. - Med pincett, tvätta vävnaden kraftigt i en steril bägare innehållande 100 mL Ca2 +/Mg2 +-gratis Dulbeccos fosfat buffrad koksaltlösning (DPBS). Tvätta för cirka 30 s eller tills skräp och blodet har tagits bort. Nästa, med sterila kompresser, torka bort det slemhinna lagret från epitel.
- Med stor pincett, fast förstå muskellagrar av vävnad och med kraft, skrapa bort epitelet med stora böjda hemostatiska tången. Samla in skrapade epitelial fragment i en steril, polystyren petriskål.
- Finhacka epitelvävnad i cirka 2,0 x 2,0 mm2 storlek fragment med rakhyvlar för att optimera vävnad matsmältningen. Tvätta vävnad fragment med Ca2 +/Mg2 + -gratis DBPS kompletteras med antibiotika (Ca2 +/Mg2 + -gratis DPBS, 1% Penicillin/Streptomycin, 0,25 mg/mL amfotericinB 10 mg/mL Gentamicin, 50 mg/mL Kanamycin), tills tvätten är gratis blod. Utföra flera tvättar om det behövs. Kasta bort tvätten genom noggrant filtrering tvätten genom en steril kompress i en glasbägare på avfall.
- Samla tvättas fragment i en 125 mL glas rund botten kolven med en 25 mm rör bar och pre värmde inkubation media (basal media kompletteras med 2 mM L-glutamin, 1% Penicillin/Streptomycin, 10 mM HEPES buffert, 1 mg/mL kollagenas typ1, 2 mg/mL cellkultur grade bovint Serum Albumin). Tillslut rund botten kolven med gummi septa.
- Infoga en 20 G spinal nål i septa och Anslut den till ett syre tank med gummi spolning. Sätt in mjukpapper i slangen att skapa ett filter för att filtrera bort eventuella föroreningar. Slå på syre utflödet på låg. Sätt in 10-15 utflöde nålar i septa att undvika bristning av septa.
- Säkra uppsättningen upp till en ring stå med hjälp av klämmor och placera den i ett vattenbad som kalibreras till 37 ° C med en uppståndelse platta för 30-45 min. När vävnaden har inkubation i 15 min, ta bort 50 µL av inkubering media och kontrollera visuellt för dissocierade körtlar. Om körtlar inte tät eller har inte avgränsat från vävnaden, lämna för en ytterligare 5-10 min.
- Omedelbart efter inkubation, tillsätt 50 mL förvärms DMEM/F12 till inkubation media med steril serologiska pipett eller genom att hälla direkt i inkubation blandningen.
- Filtrera körtel blandningen genom en steril kompress i fyra 50 mL koniska rör. Hålla filtratet på is för 15 min till tillåta extraherade körtlar sedimentera till botten av koniska röret. Var noga med att inte störa de kvittade körtlarna, avlägsna och kassera utanför topp 40 mL av supernatanten med serologiska pipett. Återsuspendera de återstående 10 mL i 10 mL av DPBS kompletterat med antibiotika.
- Fördela blandningen jämnt i 5 mL cell kultur provrör. Centrifugera i 5 min på 65 x g vid 4 ° C och ta bort supernatanten noggrant med hjälp av en pipett. Återsuspendera pelleten i tinade basalmembranet matris med hjälp av en pipett eller en 200 µL brett pipettspetsen körtel. Blanda tills homogen.
Obs: Det är viktigt att utföra det här steget på isen och undvika polymerisation av basalmembranet matris under omrörning. Det är dessutom viktigt att visuellt inspektera körtel tätheten genom provtagning för 50 µL. Den optimala tätheten är ~ 70% konfluens. - Nästa, tallrik körtlar i 50 µL av basalmembranet matris med pipett bred spets. Undvika eventuella bubblor medan plätering.
- Att tillåta basalmembranet matris att polymerisera, inkubera i 10-15 min vid 37 ° C. Om plätering i en 12-väl kultur plattan, tillsätt 1 mL av hFGO media (avancerad Dulbeccos modifierade Eagle medium/F12 medium kompletteras med 2mM L-glutamin, 1% Penicillin/Streptomycin, 0,25 mg/mL amfotericinB 10 mg/mL Gentamicin, 50 mg/mL Kanamycin, 10 mM HEPES Buffert, 1 mM n-Acteylcystine, 1 x N2, 1 x B27, 50% Wnt-villkorade medium, 20% R-spondin-villkorade medium kompletteras med 100 ng/mL bone morphogenetic protein-hämmare, 1 nM gastrin, 50 ng/mL Epidermal tillväxtfaktor, 200 ng/mL Fibroblast tillväxtfaktor 10, 10 mM nikotinamid och 10 µM Y-27632 ROCK hämmare) per brunn. Om inte med hjälp av en 12-väl kultur tallrik Lägg till tillräckligt media att dränka basalmembranet matrix bubblan.
- Odla cellerna vid 37 ° C i en 5% CO2 befuktade cell kultur inkubator. Ändra media efter 4-5 dagar.
2. fastställande av mus-derived 3D Gastric Fundic Organoids
Obs: Detta protokoll har funnits tidigare publicerade 6. Tina basalmembranet matris på isen och förbereda alla reagenser före början.
- Offra möss med en metod som godkänts av forskning Institutionen där forskningen utförs. Ta bort magsäcken från musen och dissekera enligt den tidigare publicerade protokoll 6. Tvätta i 20 mL is kallt Ca2 +/Mg2 +-gratis DBPS.
Obs: C57BL/6 möss, i åldern 8-10 veckor, används för fundic gastric organoid kulturer. Möss var euthanized vid inandning av koldioxid följt av manuell cervikal dislokation innan magen borttagning. - Remsa muskellagrar från magen och några synliga blodkärl som tidigare publicerat 6.
- Separata fundus från antrum och förmagen med hjälp av en steril rakblad. Skär fundus med små kirurgiska sax i fragment cirka 2,0 x 2,0 mm. med pincett, samla fragment i en 15 mL koniska rör som innehåller EDTA inkubation buffert (Ca2 +/Mg2 +-gratis DPBS, 5 mM EDTA) och inkubera vid 4 ° C för 2 h med försiktig skakning.
- I en steril huva, lämna koniska tube och fragment på is för ca 5 min. Använd en pipett ta bort så mycket inkubation buffert som möjligt lämnar fragment orörd. Tillsätt 5 mL skakar buffert (1 g D-Sorbitol, 1,47 g sackaros i 100 mL Ca2 +/Mg2 +-gratis DPBS) och skaka hand med en kraft för 2 min. tillåta stora fragment att bosätta sig och med hast, med 1000 p pipett, ta bort de små fragment som har ännu att lösa i det översta lagret.
- Snurra de borttagna fragment för 5 min vid 4 ° C vid 65 x g.
- Samtidigt undvika luftbubblor, avlägsna supernatanten, Omsuspendera i matrisen basalmembranet och blanda tills det är homogen.
- Använd pipett bred spets tallrik basalmembranet matrisen på 50 µL per brunn och sedan Inkubera vid 37 ° C i 20 min.
- Lägg tillräckligt mFGO tillväxt medier (avancerad Dulbecco's modified Eagle medium/F12 medium kompletteras med 2mM L-glutamin, 1% Penicillin/Streptomycin, 10 mM HEPES buffert, 1mM n-Acteylcystine, 1 x N2, 1 x B27, 50% Wnt-villkorade medium, 20% R-spondin-villkorade medium kompletteras med 100 ng/mL bone morphogenetic protein-hämmare, 10 nM gastrin, 50ng/mL Epidermal tillväxtfaktor, 10 ng/mL Fibroblast tillväxtfaktor 10 och 10 µM Y-27632 ROCK hämmare) att dränka bubblan.
- Odla cellerna vid 37 ° C, 5% CO2 befuktade cell kultur inkubator. Ändra media efter 4-5 dagar.
3. kollagen beläggning för 2D överföring
Obs: Utför alla procedurer i en steril vävnadsodling huva om inget annat anges. Börja kollagen beläggning 24 h innan du överför 3D organoids till enskiktslager. Hålla rat tail kollagen på isen och skyddad från ljus. Kollagen belagda plattorna är bra för upp till 2 veckor. Om du inte använder belagda plattorna omedelbart, Linda plattan i parafilm och förvaras vid 4 ° C tills den behövs.
- Späd rat tail kollagen till 50 µg/mL med 20 mM-ättiksyra.
- Tillräckligt täcka ytan av brunnen med utspädda kollagen. För en brunn i en standard 12-väl plåt, täck med ca 1 mL av kollagen. Lämna över natten i rumstemperatur i en steril huva.
- Tvätta två gånger med 1 mL Ca2 +/Mg2 +-gratis DPBS per brunn och lämna avslöjade för 2 h i rumstemperatur i en steril huva.
4. basalmembranet Matrix beläggning för 2D överföring
Obs: Utför alla procedurer i en steril vävnadsodling huva om inget annat anges. Börja basalmembranet matrix beläggning 2 h innan du överför 3D organoids till enskiktslager. Hålla basalmembranet matrisen på is. Plattorna ska användas omedelbart och lagras inte under en längre tid.
- Späd basalmembranet matris i en 15 mL konisk slang med en cell kultur grade vatten på en 1:10 baserat. Späd på is.
- Med pipett Tillsätt 100 µL utspätt basalmembranet matris till varje brunn standard 12-bra platta. Använda en cell-skrapa, fördela jämnt matrisen utspädda basalmembranet i hela brunnen för ett jämnt skikt.
- Inkubera vid 37 ° C i 1 h.
- Ta bort återstående vattnet med pipett och torka i rumstemperatur i 1 h innan du överför 3D organoids.
5. överföring av 3D m/hFGOs till 2D Gastric epitelial Cell enskiktslager
- Efter 3D mus - eller mänskliga-härledda FGOs har varit odlade för 6-7 dagar, börja överföringen av 3D organoids till den 2D enskiktslager.
Obs: För varje brunn en enskiktslager krävs det rekommenderas att använda 300 intakt organoids eller enstaka celler härstammar från 300 organoids. I en robust kultur förväntas det erhålla cirka 150 organoid per brunn inom en 12 väl kultur plattan. - Var noga med plattor beläggs före flyttningen.
Obs: Basalmembranet matrix belagda plattorna har en genomskinlig gel-lager, kollagen belagda plattor har dock inte någon tydlig indikation av beläggningen. - Rubba 3D basalmembranet matrix bubblan från plattan av direkt pipettering 1 mL steril Ca2 +/Mg2 +-gratis DBPS på mitten av bubblan.
- Med pipett samla basalmembranet matris och organoid blandningen i cell kultur provrör. Samla i ett förhållande av 2 basalmembranet matrix bubblor per rör. Centrifugera under 5 minuter vid 40 x g- och 4 ° C.
- Använda ett vakuumsystem, avlägsna supernatanten och som mycket basalmembranet matris som möjligt. Återsuspendera i 4 mL Ca2 +/Mg2 +-gratis DBPS, avlägsna supernatanten och upprepa 2 - 3 gånger. För hela organoid överföringsprotokollet, Fortsätt till steg 5.10. Fortsätt till steg 5,7 för enstaka cell suspension protokollet.
- Pre varm cell avlossning lösning till 37 ° C och tillsätt 1 mL i varje rör. Blanda försiktigt genom att invertera rör eller pipettering upp och ner med en pipett. Inkubera i 10 minuter vid 37 ° C.
- Tillsätt 2 mL av Ca2 +/Mg2 +-gratis DBPS direkt till varje provrör.
- Använd en 26 G nål och spruta blandningen 2 - 3 gånger. Visuellt kontrollera enstaka celler. Spruta 1-2 gånger om det fortfarande organoids eller kluster av celler.
- Centrifugera vid 40 x g under 5 minuter vid 4 ° C. Återsuspendera pelleten i 2D FGO media (2D mus FGO odlingsmedium: avancerade Dulbeccos modifierade Eagle medium/F12 medium kompletteras med 2mM L-glutamin, 10 mM Penicillin/Streptomycin, 10% fetalt kalvserum, 10 mM HEPES buffert, 1 x N2, 1 x B27, kompletteras med 10 nM gastrin, 50 ng/mL Epidermal tillväxtfaktor, 1 µM TGF-β-hämmare och 10 µM Y-27632 ROCK-hämmare. 2D mänskliga FGO odlingsmedium: Avancerade Dulbeccos modifierade Eagle medium/F12 medium kompletteras med 2mM L-glutamin, 1% Penicillin/Streptomycin, 10 mM HEPES buffert, 10% fetalt kalvserum, 10 mM nikotinamid, 1 x N2, 1 x B27, kompletterad med 50 mg/mL Kanamycin, 50 ng/mL Epidermal tillväxt Faktor, och 10 µM Y-27632 ROCK-hämmare, 1 µM TGF-β-hämmare).
- Plattan resuspension på plattorna. Inkubera plattorna vid 37 ° C. Ersätta media var 4 dagar eller tidigare om media blir gul. Enskiktslager kräver cirka 4 dagar att bilda.
6. skrapa såret Assay använder 2D magsäckens epitelceller enskiktslager
- Med ett rakblad, repa enskiktslager när kulturen har nått 100% konfluens.
- Fixa enskiktslager med 3,7% formaldehyd i 15 min i rumstemperatur. Permeabilize med 0,5% icke-joniskt rengöringsmedel/PBS i 20 min i rumstemperatur.
- Nästa blockera enskiktslager med 2% åsna serum för 1 h i rumstemperatur och inkubera med 1: 1000 utspädning av H+, K+-ATPas primär antikropp över natten vid 4 ° C, tvätta med 0,1% icke-joniskt rengöringsmedel/PBS och inkubera med 1: 100 utspädning av åsna anti-mus 488 sekundär antikropp och 10μg/mL av Hoechst cellkärna fläcken för 1 h i rumstemperatur.
- För att identifiera ytan slemhinnor grop cellerna i 2D människa gastric enskiktslager kulturer, färga celler med 20 μg/ml av Ulex europaeus (UEAI) FITC-konjugat. Bild enskiktslager på confocal Mikroskop.
- Ta bilder av såret varje några h. Scratch kommer åter epitelialisera mellan 24-48 h beroende på kvaliteten på enskiktslager och variationen mellan patienter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Organoids härleddes från corpus/kroppen av människan eller fundus av mus magen vävnader (figur 1A). Efter antingen kollagenas eller EDTA rötning av mänskliga - eller mus-härledda magen vävnad respektive är körtlar inbäddade i basalmembranet matris och odlade för 6-7 dagar (figur 1A). Figur 1B visar bildandet av mänskliga-derived gastric organoids (huFGOs) som sedan har överförts till en gastric epitelial enskiktslager (huGEM) på basalmembranet matrix-belagd avdelningen bilder. Efter 4 dagar av kultur användes konfluenta huGEMs för scratch såret analyser (figur 1B). Bilder som samlats in från en tid förflutit analys av den huGEM som visade sårslutning inom kulturen under en period av 24 timmar (figur 2).
HuGEMs konstaterades att uttrycka de stora cellen härstamningar Hittade i den infödda mage vävnaden. Immunofluorescens färgning avslöjade ett uttryck för en polariserad E cadherin-positiv enskiktslager som bestod av parietala (figur 3B, C) och ytan slemhinnor (figur 3B, D) celler. PCR-analys använder RNA som samlats in från dessa enskiktslager bekräftade uttrycket av parietala och ytan slemhinnor celler, förutom chefen och slemhinnor hals cellerna (figur 3E). Konfluenta huGEMs uttryckte också några prolifererande celler (figur 3F). Analysen av dessa stora cell utvecklingslinjerna inom scratch såret analysen visade ihållande uttryck av parietala, chef, slemhinnor hals ytan slemhinnor celler över en 24 timmarsperiod (figur 4A, B). Sammantaget visar dessa data användningen av huGEMs som romanen kultur system att studera gastric förnyelse i vitro.
Figur 1: Generation människa gastric organoids (huFGO) och primära gastric epitelial enskiktslager (huGEM). (A) representativa bilder av mänskliga gastric vävnad och mus magen används för att generera körtlar för organoid kultur. Konturerade området anger fundic regionen mus magen. (B) generering av människa gastric organoids (huFGOs) som används för kulturen av mänskliga-derived gastric epitelial enskiktslager (huGEMs). Representativ bild av huGEM efter grunden visar det skadade området. Skalstapeln = 500 μm vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2: Scratch-såret assay. Representativa bilder samlas in från en tid förflutit experiment med huGEM 0, 8, 16 och 24 h efter scratch sår. Skalstapeln = 500 μm vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3: uttryck för större cell härstamningar i huGEM kulturer. Immunofluorescens färgning av huGEM kulturer visar uttrycket av (A) E-cadherin (Ecad, röd), surface slemhinnor celler (UEAI, grön) och atomkärnor (Hoechst, blå), och (B) E-cadherin (Ecad, röd), parietalcellerna (HK, grön) och atomkärnor () Hoechst, blå). Separata kanaler visas i (C) och (D). (E) RT-PCR utfördes med hjälp av RNA som utvinns ur huGEMs för uttrycket av H+K+-ATPas (ATP4a), pepsinogen C (PgC), MUC5AC och MUC6. (F) Proliferating celler inom den huGEM kulturen bestäms av EdU (röd) upptag. Skala bar (A-D) = 50 μm, skala bar (F) = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: förändringar i cell härstamning uttryck i scratch-såret analysen. Immunofluorescens färgning av huGEM kulturer visar uttrycket av E-cadherin (Ecad, red) eller ytan slemhinnor celler (UEAI, grön) eller parietalcellerna (HK, grön) och atomkärnor (Hoechst, blå) använder bilder som samlats in från huGEM kulturer 0, 8, 16 och 24 hrs inlägg Scratch-sår. Bkgrd = bakgrundsfärgning av basalmembranet matris på bilderna. XY-axis skalstapeln från 0 - 400 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Mus 3D Media | Stamlösning | Arbetar koncentration |
| nAcetylcysteine | Pulver | 1 mM |
| Gastrin | 10 ΜM | 10 nM |
| EGF | 500 µg/mL | 50 ng/mL |
| Skalle | 100 µg/mL | 100 ng/mL |
| FGF10 | 100 µg/mL | 100 ng/mL |
| YCMD | 10 mM | 10 ΜM |
| B27 | 50 x | 1 x |
| N2 | 100 x | 1 x |
| Penna/Strep | 1 M | 10 mM |
| HEPES | 1 M | 10 mM |
| Glutamax | 200 mM | 2 mM |
| WNT | 50% v/v | |
| R-Spondin | 10% v/v |
Tabell 1: Mus 3D Media-komponenter.
| Mus 2D Media | Stamlösning | Arbetar koncentration |
| FCS | 100% | 10% |
| YCMPD | 10 mM | 10 ΜM |
| Gastrin | 10 ΜM | 10 nM |
| EGF | 500 µg/mL | 50 ng/mL |
| B27 | 50 x | 1 x |
| N2 | 100 x | 1 x |
| Penna/Strep | 1 M | 10 mM |
| HEPES | 1 M | 10 mM |
| Glutamax | 200 mM | 2 mM |
| TGF-β-hämmare | 10 mM | 1 ΜM |
Tabell 2: Mus 2D mediekomponenter.
| Mänskliga 3D Media | Stamlösning | Arbetar koncentration |
| Nikotinamid | Pulver | 10 mM |
| nAcetylcysteine | Pulver | 1 mM |
| Gastrin | 10 ΜM | 1 nM |
| EGF | 500 µg/mL | 50 ng/mL |
| Skalle | 100 µg/mL | 100 ng/mL |
| FGF10 | 100 µg/mL | 200 ng/mL |
| YCMD | 10 mM | 10 ΜM |
| B27 | 50 x | 1 x |
| N2 | 100 x | 1 x |
| Penna/Strep | 1 M | 10 mM |
| HEPES | 1 M | 10 mM |
| Glutamax | 200 mM | 2 mM |
| Kanamycin | 1 M | 10 mM |
| Amfotericin B/Gentamycin | 125 µg/mL | 1 mM |
| WNT | 50% v/v | |
| R-Spondin | 10% v/v |
Tabell 3: Mänskliga 3D Media-komponenter.
| Mänskliga 2D Media | Stamlösning | Arbetar koncentration |
| FCS | 100% | 10% |
| YCMPD | 10 mM | 10 ΜM |
| Gastrin | 10 ΜM | 1 nM |
| EGF | 500 µg/mL | 50 ng/mL |
| B27 | 50 x | 1 x |
| N2 | 100 x | 1 x |
| Penna/Strep | 1 M | 10 mM |
| HEPES | 1 M | 10 mM |
| Glutamax | 200 mM | 2 mM |
| TGF-β-hämmare | 10 mM | 1 ΜM |
| Nikotinamid | Pulver | 10 mM |
| Kanamycin | 1 M | 10 mM |
Tabell 4: Mänskliga 2D mediekomponenter.
| Experimentella Problem | Felsökningstips |
| Enskiktslager misslyckas att bilda från organoids | (1) optimal odling villkoren för detta protokoll variera mellan experimentella behov. Människa och mus enskiktslager härrör från organoids bör vara odlade med utspädda basalmembranet matris när du använder glas eller plast kultur rätter. Rat tail kollagen är optimal för enskiktslager experiment av mus eller mänskligt ursprung som kräver polyester membran infogar dock. 2) optimal odling villkoren varierar beroende på den experimentella uppsättningen upp. Kulturerna med enda cellsuspension odlas helst med 3D FGO media medan intakt organoids odlas med 2D FGO media. |
| Enskiktslager härrör från äldre patienter (> 55 år) eller möss (> 18 månader) misslyckades att växa och nå konfluens | Om använda magen vävnad som samlats in från åldern möss (> 18 månader) eller patienter (> 55 år) tätheten av organoids som används för generering av enskiktslager bör fördubblas med tanke på att organoids tillväxt effektivitet minskas. |
| Organoids inte till formuläret från körtlar | Det rekommenderas att färskt (nyinköpta om möjligt) gastrin användas. Använd färska åter svävande gastrin var 4 månader. |
| Organoids misslyckas att bifoga och bilda enskiktslager | Se till att effektiv borttagning av basalmembranet matris har uppnåtts efter skörd organoids för överföring till kultur plattor för enskiktslager. |
| Kulturer som härrör från äldre patienter (> 55 år) eller möss (> 18 månader) misslyckas | Under perioderna som matsmältningen och inkubation räcker 15-30 min inledande inkubation följt av 5 min intervall för inkubation vid behov. Det bör noteras att patienter större än 55 år kan ha körtlar som dissocieras lättare och därför kräver mindre matsmältning. Likaså har FGOs härrör från äldre patienter visas långsammare tillväxt tid och ökad känslighet för centrifugering. För att få bästa resultat, begränsa eventuella överskott centrifugering när du arbetar med äldre vävnad och ersätta media i tid. |
Tabell 5: felsökningstips. Stött på problem och rekommenderade lösningar för optimal etablering och kultur av mänskliga eller mus gastric enskiktslager.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det nuvarande protokollet Detaljer inrättandet av mänskliga - och mus-härledda gastric epitelial enskiktslager som kan användas för scratch-såret analyser. Protokollet är beroende av begreppet hemvist stem cell isolering från primära mänskliga (eller mus) vävnader och är en modifierad protokollet först publicerades av Schlaermann et al7. Vi har särskilt optimerad protokollet här för att upprätta en konfluenta och polariserade gastric epitelial enskiktslager som uttrycker stora cell härstamningar som kan hittas i den gastric epitel i vivo. Magsår repair är en komplex process som involverar vävnad återepitelisation, förnyelse och spridning9,10,11. I synnerhet har vårt laboratorium rapporterat att regenerering av gastric epitel sammanfaller med framväxten av spasmolytiska polypeptid/klöver faktor (TFF) 2-uttryckande metaplasi (SPEM) vid magsår marginal inom de regenererande mag körtlarna 12,13. SPEM definieras som transdifferentiation av chief cell härstamning till en slemhinnor cell metaplasi14 som framträder med skada och försvinner när slemhinnan återgår till sin normala cellulära sammansättning12. Således, för att studera en sådan mekanism i ett in vitro -system, är det viktigt att de stora cell linjerna, såsom chief cellerna, är närvarande inom kulturen.
Användning av scratch-såret analyser har i stor utsträckning används för studier av reparation och förnyelse, och fram till nyligen var gastric cancer cellinjer används1,2,3,4. Medan grundläggande mekanismer har avslöjats med ventrikelcancer celler linjer, dessa kulturer omvandlas och saknar cellulär mångfalden av infödda magen vävnad. HuGEMs visas att behålla en polariserad och olika cellulära sammansättning som nära recapitulates gastric epitel i vivo. Dessutom efter att nå confluency huGEM kulturer kan bibehållas i upp till en månad i optimala förhållanden. Utökade kulturer möjliggör långsiktiga experiment. Således, framtida tillämpningar av den huGEMs som kan anses omfatta enskiktslager/immun samtidig cellkulturer och långsiktiga experiment för studien av Helicobacter pylori patogenes.
Det finns viktiga tekniska aspekter att notera i det nuvarande protokollet. Den första tekniska punkten är att valet av basalmembranet komponent varierar beroende på kultur cellytan som ska användas för experiment. För att säkerställa att optimal enskiktslager villkor uppnås, är det rekommenderat att kollagen används när experiment med enskiktslager kräver plattor med polyester membran skär. Men om enskiktslager experiment kräver glas eller plast kultur ytor, är utspädda basalmembranet matris det optimala valet av beläggning. För det andra, tätheten av organoids krävs för att nå en konfluenta enskiktslager måste justeras beroende på patienten som gastric vävnaden samlas ålder. För vävnad som samlats in från åldern möss (> 18 månader) eller patienter (> 55 år), organoid tätheten används bör vara ökad dubbelt när överföring till en enskiktslager på grund av minskad tillväxtkapaciteten i äldre individer. Under matsmältningen och inkubering av mänsklig vävnad härrör från äldre patienter, körtlar kan vara mer mottagliga för dissociation och centrifugering och därför: 1) bör vara centrifugeras så sparsamt som möjligt, (2) medier ersatte flitigt, och 3) under matsmältningen inkubationer 15 till 30 minuter med inkrementell tumörheterogenitet 5 minuter efteråt kommer att minska sannolikheten för med matsmältningen. Slutligen, när bildar enskiktslager från organoid-derived enda cellsuspensioner, 3D FGO media är mest optimala för korrekt bildande av enskiktslager medan när odling från intakt organoids, 2D FGO media har observerats för att ge högsta möjliga effektivitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete var stött av NIH (NIDDK) 5 R01 DK083402-07 bevilja (YZ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced Dulbecco's modified Eagle/F12 medium (basal media) | Life Technologies | 12634-010 | |
| GlutaMAX (L-glutamine) | Life Technologies | 25030-081 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Scientific | SV30010 | |
| Amphotericin B/Gentamicin | Thermo Scientific | R01510 | |
| Kanamycin | Thermo Fisher | RO1510 | |
| HEPES Buffer | Sigma Aldrich | H0887 | |
| n-Acetylcystine | Sigma Aldrich | A9165 | |
| N2 | Life Technologies | 17502-048 | |
| B27 | Life Technologies | 12587-010 | |
| BMP Inhibitor (Noggin) | Pepro Tech | 250-38 | |
| Gastrin | Tocris | 3006 | |
| EGF | Pepro Tech | 315-09 | |
| FGF10 | Pepro Tech | 100-26 | |
| Nicotinamide | Sigma Aldrich | N0636 | |
| Y-27632 ROCK Inhibitor | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| TGF-β Inhibitor | Tocris | 2939 | |
| Ca2+/Mg2+ -free DPBS | Fisher | 21-031CV | |
| Dulbecco's modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 12634-010 | |
| Fetal Bovine Serum | FBS | ||
| OPTIMEM | Invitrogen | ||
| 0.22µM filter | Fisher | 099-720-004 | |
| 37 °C Water Bath | |||
| Collagenase Type 1 | Worthington | LS004214 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9418 | |
| Kimwipes (tissue paper) | Fischer Scientific | 06-666C | |
| 125 mL round bottom flask | |||
| 1 in (25 mm) stir bar | |||
| Rubber Septa | |||
| Sterile Gauze | |||
| Stir Plate | |||
| Ring Stand | |||
| Ring Stand Clamps | |||
| Sterile petri dish | |||
| 18 G needles of 1.5 in length | Thermo Fisher | 305196 | |
| 20 G spinal needles of 3.5 in length | Thermo Fisher | 405182 | |
| 12-well cell culture treated plate | Midwest Scientific | 92012 | |
| Growth Factor Reduced, Phenol Red-free MatrigelTM (Basement membrane matrix) | Fisher | CB-40230C | |
| Sterile Razor Blades | |||
| Wide-tip tweezers | |||
| Curved Hemostatic Forceps | |||
| 200 µL wide pipette tips | Thermo Fisher | 02-707-134 | |
| 5 mL cell culture test tubes | Fisher | 14-956-3C | |
| Oxygen Tank with rubber hosing | |||
| 1 g D-Sorbitol | |||
| Sucrose | Fisher | SS-500 | |
| Dissecting microscope | |||
| Dissecting Tray | |||
| Rocking Table | |||
| Rat Tail Collagen Type 1 | Life Technologies | A10483-01 | |
| Cell culture grade glacial acetic acid | Fisher | A38-212 | |
| Cell culture grade water | Corning | 25-055-CV | |
| 2-well chamber slide | Thermo Fisher | 155380 | |
| 12-well Transwell (polyester membrane inserts) | Corning | 3460 | |
| Cell scraper | Corning | 353086 | |
| Accutase (cell detachment solution) | Stemcell Technologies | 7920 | |
| 263/8 G syringe | Thermo Fisher | 309625 | |
| Razor blade | |||
| L Cells | L cells, a Wnt3a producing cell line, were received as a gift from Dr. Hans Clevers (Hubrecht Institute for Developmental Biology and Stem Cell Research, Netherlands). | N/A | |
| HEK-293T Rspondin secreting cells | A modified HEK-293T R-spondin secreting cell line was obtained from Dr. Jeff Whitsett (Section of Neonatology, Perinatal and Pulmonary Biology, Cincinnati Children's Hospital Medical Centre and The University of Cincinnati College of Medicine, Cincinnati, USA ). | N/A | |
| HK-ATPase Primary Antibody | Invitrogen | SC-374094 | |
| E-Cadherinn | SantaCruz | sc-59778 | |
| UEA1 | Sigma Aldrich | L9006 | |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher | H3570 | |
| Alexafluor 488 secondary antibody (Donkey anti-mouse 488 secondary antibody) | ThermoFisher Scientific | R37114 |
References
- Nagy, T. A., et al. Helicobacter pylori regulates cellular migration and apoptosis by activation of phosphatidylinositol 3-kinase signaling. J Infect Dis. 199 (5), 641-651 (2009).
- Mnich, E., et al. Impact of Helicobacter pylori on the healing process of the gastric barrier. World J Gastroenterol. 22 (33), 7536-7558 (2016).
- Zhang, Y., et al. Bm-TFF2, a toad trefoil factor, promotes cell migration, survival and wound healing. Biochem Biophys Res Commun. 398 (3), 559-564 (2010).
- Crabtree, J. Role of cytokines in pathogenesis of Helicobacter pylori-induced mucosal damage. Dig Dis Sci. 43 (Supplement), 46S-53S (1998).
- Riahi, R., Yang, Y., Zhang, D. D., Wong, P. K. Advances in wound-healing assays for probing collective cell migration. J Lab Autom. 17 (1), 59-65 (2012).
- Zhang, M., Li, H., Ma, H., Qin, J. A simple microfluidic strategy for cell migration assay in an in vitro wound-healing model. Wound Repair Regen. 21 (6), 897-903 (2013).
- Schlaermann, P., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. 65 (2), 202-213 (2016).
- Bertaux-Skeirik, N., et al. CD44 plays a functional role in Helicobacter pylori-induced epithelial cell proliferation. PLoS Pathog. 11 (2), e1004663 (2015).
- Tarnawski, A. S. Cellular and molecular mechanisms of gastrointestinal ulcer healing. Dig Dis Sci. 50 (Suppl 1), S24-S33 (2005).
- Wright, N. A., Pike, C., Elia, G. Induction of a novel epidermal growth factor-secreting cell lineage by mucosal ulceration in human gastrointestinal stem cells. Nature. 343, 82-85 (1990).
- Wright, C. L., Riddell, R. H. Histology of the stomach and duodenum in Crohn's disease. Am J Surg Pathol. 22 (4), 383-390 (1998).
- Engevik, A. C., et al. The Development of Spasmolytic Polypeptide/TFF2-Expressing Metaplasia (SPEM) During Gastric Repair Is Absent in the Aged Stomach. CMGH. , In Press (2016).
- Bertaux-Skeirik, N., et al. CD44 variant isoform 9 emerges in response to injury and contributes to the regeneration of the gastric epithelium. Journal of Pathology. 242 (4), 463-475 (2017).
- Nam, K. T., et al. Mature chief cells are cryptic progenitors for metaplasia in the stomach. Gastroenterology. 139 (6), 2028-2037 (2010).
