Summary
כאן נתאר פרוטוקול על יצירה וערבה culturing האדם ואת העכבר-נגזר תלת-ממדי (3D) קיבה organoids, ואת שיטת להעברת organoids תלת-ממד טפט 2-ממדי. השימוש טפט אפיתל הקיבה כמו assay הרומן פצע שריטה ללימודי התחדשות גם מתואר.
Abstract
מחקרים במבחנה של הפצע קיבה תיקון בדרך כלל כרוכה בשימוש של שורות תאים סרטן קיבה ב וזמינותו פצע שריטה של התפשטות תאי והעברה. מגבלה קריטית אחת של מבחני כזה, זאת, מבחר סוגי הסלולר הומוגני שלהם. תיקון הוא תהליך מורכב אשר דורש את האינטראקציה של מספר סוגי תאים. לכן, ללמוד תרבות ללא יחוברו הסלולר, היא דאגה שחייבים להכריעו אם ברצוננו להבין את תהליך התיקון. המודל תא צורב קיבה עשויה להקל על הבעיה לפיה האוסף הטרוגנית של סוגי תאים מקרוב משקף של האפיתל קיבה או אחרים רקמות מקורי בתוך vivo. הפגינו כאן הוא רומן, במבחנה פצע שריטה assay נגזר מן האדם או בעכבר organoids תלת-ממדי אשר אז ניתן להעביר טפט אפיתל הקיבה כמו גם organoids שלמים או השעיה תא בודד של חלופה מועדפת organoids. המטרה של הפרוטוקול היא להקים תא צורב-derived קיבה אפיתל monolayers יכול לשמש במערכת assay פצע שריטה הרומן ללמוד התחדשות קיבה.
Introduction
השימוש של מבחני פצע שריטה היא שיטה פופולרית לימוד תיקון והתחדשות1,2,3,4,5,6. המתודולוגיה המוצעת עשוי לשמש ללמוד במיוחד התחדשות קיבה ו קולוניזציה הליקובקטר פילורי . בעבר, שורות תאים סרטן קיבה שימשו כאמצעי ללמוד הליקובקטר פילורי (ח פילורי) זיהום1,2 , עד סרטן קיבה לאחרונה היו שורות תאים כגון תאים AGS המועדף1 ,2,3,4. מגבלה אחת של תרביות תאים סרטן הקיבה היא כשל שלהם כדי לסכם את הגיוון הסלולר של האפיתל קיבה. כדי לנסות לטפל מגבלה זו, הדגים שהנה הממסד ואת ההעברה של ראשי האדם ואת העכבר-נגזר תלת-ממדי fundic קיבה organoids (FGOs) אפיתל חד שכבתי קיבה עבור מבחני ריפוי הפצע המבוסס על שיטה שונה קודם שתואר על ידי Schlaermann et al. 7 נדגים כי monolayers אפיתל הקיבה נגזר לכסנתם FGOs קיבה תלת-ממד או תאים בודדים נגזר FGO שומרים על קומפוזיציה הסלולר מקוטב המייצג בצורה הקרובה של האפיתל קיבה ויוו. בהתחשב בכך שורות תאים סרטן קיבה לא מפגינים את ההרכב תא שטכניקה זו מציגה הפרוטוקול הנוכחי יש יתרון על פני שיטות אלטרנטיבית assay שריטה-פצע. מתודולוגיה זו מוטבה לפיה monolayers יכול להיות הוקמה כל organoids או השעיה תא בודד מן organoids הפומבית, מצופה שימוש במטריצה קרום המרתף או ציפוי קולגן. המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא ליצור שתא צורב נגזר תרבויות קיבה אפיתל חד שכבתי assay הריפוי הפצע הרומן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כדי למנוע זיהום, לבצע פרוטוקול בשלמותו בתוך כיסוי סטרילי תרביות רקמה. רקמה אנושית fundic נאסף מתוך בחולים שעברו ניתוח שרוול קיבה לפי הפרוטוקול באוניברסיטת סינסינטי IRB שאושרו (מספר פרוטוקול IRB: 2015-4869).
כל המחקרים העכבר אושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים באוניברסיטת סינסינטי ועל שימוש הוועדה (IACUC) השומר על מתקן של האגודה האמריקאית של הערכה, הסמכה של מעבדה חיה על עצמך (AAALAC).
1. יצירת האדם, נגזר 3D קיבה Fundic Organoids
הערה: פרוטוקול זה מתבסס על מחקר שפורסם בעבר זו המעבדה8.
- להכין מדיה תא צורב 3D, אשר מורכב של 50% ממוזגים ונ ט ו- 20% R-spondin ממוזגים מדיה.
- הכנת חגיגת ממוזגים מדיה, התרבות התאים L מדיום הגידול ונ ט (Dulbecco המתואמת של הנשר בינוני (DMEM), 10% סרום שור עוברית (FBS), 1% פניצילין/סטרפטומיצין) 7 ימים, למסוק את המדיום ולאחר סינון באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר.
- להכין מדיה R-spondin ממוזגים. לגדול ששונה HEK-293T R-spondin מפרישים קו תא במדיום הגידול R-spondin (Dulbecco המתואמת של הנשר בינוני (DMEM), 10% סרום שור עוברית (FBS), 1% פניצילין/סטרפטומיצין). על הקובץ המצורף לאחר 2 h, לשנות את המדיום של תאים אלה לצמיחה OPTIMEM בינוני, 1% פניצילין/סטרפטומיצין. התרבות התאים במשך 7 ימים. לאחר מכן לקצור את המדיה R-spondin ממוזגים, סינון באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר.
הערה: פרוטוקול זה שפורסם בעבר, פרוטוקול מפורט יותר פנה ל 6,7,8.
- הפשרת המטריקס מופחתת, פנול אדום ללא קרום המרתף פקטורי גדילה עבור h 16 על הקרח ב 4 º C. לאסוף את הרקמה ב קר כקרח Ca2 +/Mg2 +-חינם DBPS במיכל פלסטיק גדולים. לאחסן על הקרח עד תחילת שלב 1.4.
הערה: רקמת נאסף מתוך בחולים שעברו ניתוח שרוול קיבה. - באמצעות מלקחיים, לשטוף את הרקמה נמרצות בתוך סטרילי המכיל 100 מ ל Ca2 +/Mg2 +-חינם של Dulbecco פוספט Buffered מלוחים (DPBS). כביסה עבור 30 s או עד ההריסות ואת הדם הוסר. לאחר מכן, בעזרת גזה סטרילית, לנגב את השכבה ריריות של האפיתל.
- בעזרת מלקחיים גדולים, בחוזקה תופסים את שכבת השריר של הרקמה, בכוח, לגרד משם האפיתל עם המלקחיים גדול מעוקל hemostatic. לאסוף את השברים אפיתל שרוטים לתוך צלחת פטרי סטרילי, פוליסטירן.
- מינצ את רקמת האפיתל לחלקים כ 2.0 x 2.0 מ מ2 בגודל באמצעות מכונות גילוח כדי למטב את רקמת לעיכול. לשטוף את שברי רקמת עם Ca2 +/Mg2 + -חינם DBPS בתוספת אנטיביוטיקה (Ca2 +/Mg2 + -חינם, DPBS, 1% פניצילין/סטרפטומיצין, 0.25 מ"ג/מ"ל המפוטריצין 10 מ"ג/מ"ל גנטמיצין, 50 מ"ג/מ"ל Kanamycin), עד לשטוף את הינה ללא דם. ביצוע שוטף מרובים במידת הצורך. למחוק את לשטוף את-ידי סינון בקפידה לשטוף את דרך גזה סטרילי לתוך גביע פסולת.
- שטף לאסוף את שברי לתוך כוס 125 מ ל עגול בתחתית הבקבוק עם בר מערבבים 25 מ מ, דגירה מראש ומחוממת מדיה (media הבזליים בתוספת 2 מ מגלוטמין, 1% פניצילין/סטרפטומיצין, 10 מ מ HEPES מאגר, 1 מ"ג/מ"ל Collagenase סוג 1, תרבית תאים 2 מ"ג/מ"ל כיתה שור אלבומין). חותם את הבקבוקון התחתון עגול עם גומי septa.
- להכניס מחט השדרה 20 גרם septa וחבר אותו מיכל חמצן עם גומי ששטף.... כדי לסנן החוצה כל מזהמים, הכנס נייר טישו הצנרת כדי ליצור מסנן. הפעל את יצוא חמצן על אש נמוכה. להוסיף 10-15 יצוא מחטים לתוך septa כדי למנוע שבר septa.
- לאבטח את ערכת למעלה אל דוכן הטבעת באמצעות מלחציים ולמקם אותו באמבט מים המכויל 37 ° C עם צלחת מערבבים למשך 30-45 דקות. לאחר יש כבר המקננת הרקמה למשך 15 דקות, להסיר µL 50 הדגירה ומדיה בדוק חזותית בלוטות חלופה מועדפת. אם בלוטות אינם צפופים או לא הפרדת מן הרקמה, להשאיר למשך דקות נוספות 5-10.
- מיד לאחר דגירה, להוסיף 50 מ ל שחומם מראש DMEM/F12 הדגירה מדיה באמצעות פיפטה סרולוגית סטרילי או על ידי מזיגת ישירות לתוך התערובת הדגירה.
- לסנן את התערובת בלוטת דרך גזה סטרילי לתוך ארבעה צינורות חרוט 50 מ. שמור את פילטרט של קרח למשך 15 דקות לאפשר חילוץ בלוטות להתיישב לתחתית הצינור חרוט. יש להיזהר לא להפריע בלוטות התיישבו, להסיר, למחוק את החלק העליון 40 מ של supernatant באמצעות פיפטה סרולוגית. Resuspend הנותרים 10 מ ב- 10 מ"ל של DPBS בתוספת אנטיביוטיקה.
- פזר את התערובת באופן שווה לתוך מ ל תא תרבות מתכלה. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב g x 65 ב 4 ° C ולהסיר את תגובת שיקוע בזהירות בעזרת פיפטה. Resuspend בגדר בלוטת במטריצת המופשרים קרום המרתף באמצעות פיפטה או טיפ פיפטה רחב µL 200. מערבבים עד הומוגניות.
הערה: חשוב לבצע שלב זה על הקרח וכדי למנוע פלמור של מטריקס קרום המרתף תוך כדי ערבוב. בנוסף, חשוב לבחון באופן חזותי את צפיפות בלוטת על ידי דגימה עבור 50 µL. צפיפות אופטימלית היא ~ 70% confluency. - בשלב הבא, צלחת הבלוטות ב- 50 µL של מטריקס קרום המרתף באמצעות פיפטה שקצהו רחב. הימנע לייצר בועות בעת ציפוי.
- כדי לאפשר קרום המרתף מטריקס פולימריזציה, תקופת דגירה של 10-15 דקות ב 37 º C. אם ציפוי בצלחת תרבות 12-ובכן, להוסיף 1 מ"ל של מדיה hFGO (בינוני בינוני/F12 נשר ששונה מתקדמת של Dulbecco בתוספת 2 מ מגלוטמין, 1% פניצילין/סטרפטומיצין, 0.25 מ"ג/מ"ל המפוטריצין 10 מ"ג/מ"ל גנטמיצין, 50 מ"ג/מ"ל Kanamycin, 10 מ מ HEPES מאגר, 1 מ מ n-Acteylcystine, 1 x N2, 1 x B27, 50% ממוזגים ונ ט בינוני, בינוני R-spondin-ממוזגים 20% בתוספת 100 ננוגרם למ"ל עצם מעכב חלבון morphogenetic, 1 ננומטר גסטרין, 50 ננוגרם למ"ל גורם הגדילה באפידרמיס, גורם הצמיחה פיברובלסט 200 ng/mL 10, 10 מ מ Nicotinamide, ו- 10 מיקרומטר רוק Y-27632 מעכב) לכל טוב. אם לא באמצעות צלחת 12-ובכן תרבות להוסיף מדיה מספיק להציף את הבועה מטריקס קרום המרתף.
- התרבות התאים ב- 37 מעלות צלזיוס חממה תרבות 5% CO2 תא humidified. לשנות מדיה כל 4-5 ימים.
2. הקמת נגזר עכבר 3D קיבה Fundic Organoids
הערה: פרוטוקול זה כבר שפורסמו בעבר 6. הפשרת קרום המרתף מטריקס על הקרח והכן ריאגנטים כל לפני תחילתו.
- להקריב עכברים באמצעות שיטה שאושרו על-ידי מוסד מחקר שבו מתבצע המחקר. להסיר את הבטן של העכבר ומנתחים לפי פרוטוקולים שפורסמו בעבר 6. כביסה ב 20 mL קרח קר Ca2 +/Mg2 +-חינם DBPS.
הערה: עכברים C57BL/6, בגילאי 8-10 שבועות, משמשים fundic תא צורב קיבה תרבויות. עכברים היו מורדמים באמצעות אינהלציה של פחמן דו חמצני ואחריו ידנית נקע בצוואר הרחם לפני הסרת קיבה. - להסיר את שכבת השריר מאזור הבטן, כל כלי דם גלוי כאמור לאור 6.
- הפרד את הפונדוס antrum ו forestomach בעזרת סכין גילוח סטרילי. לחתוך הפונדוס באמצעות מספריים כירורגיים קטנים לחלקים כ 2.0 x 2.0 מ מ. באמצעות מלקחיים, לאסוף את השברים לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל המכילה EDTA הדגירה מאגר (Ca2 +/Mg2 +-חינם DPBS, 5 מ מ EDTA) דגירה ב 4 מעלות צלזיוס במשך שעתיים עם עצבנות עדין.
- בשכונה סטרילי, להשאיר צינור חרוטי ולהשתמש שברים בקרח במשך כ- 5 דק פיפטה עליך להסיר כמה שיותר מאגר הדגירה ככל האפשר עוזב קטעים לא נגעה. הוסף 5 מ ל לרעוד מאגר (1 g D-בסורביטול, סוכרוז 1.47 אינץ g ב- 100 מ ל Ca2 +/Mg2 +-ללא DPBS) ומנערים בעבודת יד עם כוח 2 דק מאפשר השברים גדולים ליישב ולהסיר בחיפזון, באמצעות פיפטה p 1000, הרסיסים קטן שעדיין לא להתפשר בשכבה העליונה.
- ספין השברים שהוסר למשך 5 דקות ב 4 ° C-65 x g.
- תוך הימנעות בועות אוויר, להסיר את תגובת שיקוע, resuspend המטריצה קרום המרתף ומערבבים עד שזה הומוגנית.
- השתמש פיפטה עצה רחב של צלחת המטריקס קרום המרתף-µL 50 לכל טוב, ואז דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
- הוסף מדיה צמיחה מספיק mFGO (של מתקדם Dulbecco ששינה בינוני בינוני/F12 נשר בתוספת 2 מ מגלוטמין, 1% פניצילין/סטרפטומיצין, 10 מ מ HEPES מאגר, 1 מ מ n-Acteylcystine, 1 x N2, 1 x B27, 50% בינוני ממוזגים ונ ט, 20% R-spondin-מיזוג בינוני בתוספת 100 ננוגרם למ"ל עצם morphogenetic חלבון מעכב, גסטרין nM 10, 50ng/mL גורם הגדילה באפידרמיס, גורם הצמיחה פיברובלסט ng/mL 10 10 ו- 10 מיקרומטר רוק Y-27632 מעכב) ומטביעים את הבועה.
- התרבות התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 תא humidified תרבות חממה. לשנות את המדיה כל 4-5 ימים.
3. קולגן ציפוי להעברת 2D
הערה: ביצוע כל ההליכים ברדס תרביות רקמה עקר אלא אם צוין אחרת. מתחילים ציפוי 24 שעות לפני העברת 3D organoids טפט קולגן. לשמור על הקולגן זנב העכברוש על הקרח, מפני אור. קולגן מצופה לוחות טובים עבור עד 2 שבועות. אם אינך משתמש הלוחות מצופים מיד, לעטוף את הצלחת מצלמות-מיקרוסקופים, חנות ב 4 ° C עד שהוא נדרש.
- לדלל הקולגן זנב עכבר כדי 50 µg/mL באמצעות חומצה אצטית מ מ 20.
- מספיק לכסות את פני השטח של הבאר עם קולגן מדולל. במשך אחד בצלחת 12-ובכן תקן, מעיל עם 1 מ"ל של קולגן. להשאיר למשך הלילה בטמפרטורת החדר בשכונה סטרילי.
- תשטוף פעמיים עם 1 מ ל Ca2 +/Mg2 +-חינם DPBS לכל טוב ולהשאיר חשפו כבר שעתיים בטמפרטורת החדר בשכונה סטרילי.
4. קרום המרתף ציפוי מטריקס להעברת 2D
הערה: ביצוע כל ההליכים ברדס תרביות רקמה עקר אלא אם צוין אחרת. מתחילים ציפוי 2 h לפני העברת 3D organoids טפט מטריקס קרום המרתף. לשמור על המטריקס קרום המרתף על קרח. צלחות מצופה שייעשה שימוש מיידי, אפשרות לאחסן לתקופה ממושכת של זמן.
- לדלל המטריקס קרום המרתף צינור חרוטי 15 מ"ל עם מים כיתה תרבות תא בעשר: 1 יחס. לדלל על קרח.
- באמצעות פיפטה להוסיף 100 µL של קרום המרתף מדולל מטריקס כל טוב של צלחת 12-ובכן סטנדרטי. באמצעות המגרד של התא, פזר באופן שווה המטריקס קרום המרתף מדולל ברחבי הבאר על המעיל אפילו.
- דגירה ב 37 ° C עבור 1 h.
- להסיר את שאריות מים באמצעות פיפטה ויבש בטמפרטורת החדר מאובטח לפני העברת organoids תלת-ממד.
5. העברת מ' 3D/hFGOs 2D Monolayers תא אפיתל הקיבה
- לאחר 3D העכבר או האדם-נגזר ש-fgos יש כבר תרבותי במשך 6-7 ימים, מתחילים את העברת 3D organoids טפט 2D.
הערה: עבור כל טוב של טפט נדרש מומלץ להשתמש organoids ללא פגע 300 או תאים בודדים נגזר 300 organoids. בתרבות חזקים הוא צפוי לקבל כ 150 תא צורב/טוב בתוך צלחת 12 תרבות היטב. - ודא לוחות מצופה לפני העברת.
הערה: הלוחות מטריקס מצופה קרום המרתף יש שכבת ג'ל שקוף, עם זאת, לא יהיו קולגן מצופה לוחות אינדיקציה ברורה של הציפוי. - לסלק את הבועה מטריקס תלת-ממד קרום המרתף הצלחת על ידי 1 מ"ל סטרילי Ca2 +/Mg2 +ישירות pipetting-חינם DBPS במרכז הבועה.
- באמצעות פיפטה של, לאסוף את התערובת של מטריקס ותא צורב קרום המרתף לתוך התא תרבות מתכלה. לאסוף ביחס של 2 בועות מטריקס קרום המרתף למחזור. צנטריפוגה למשך 5 דקות 40 x g ו- 4 מעלות צלזיוס.
- באמצעות מערכת ואקום, להסיר את תגובת שיקוע ובאשר מטריקס קרום המרתף הרבה ככל האפשר. Resuspend ב מ 4 ל Ca2 +/Mg2 +-חינם DBPS, להסיר את תגובת שיקוע, וחזור על 2 - 3 פעמים. עבור פרוטוקול העברת כל תא צורב, המשך לשלב 5.10. המשך לשלב 5.7 עבור פרוטוקול התליה תא בודד.
- לחמם פתרון ניתוק התא 37 ° C ולהוסיף 1 מ"ל כל מבחנה. מערבבים בעדינות על-ידי היפוך צינורות או pipetting למעלה ולמטה עם פיפטה. תקופת דגירה של 10 דקות ב 37 º C.
- להוסיף 2 מ של Ca2 +/Mg2 +-חינם DBPS ישירות אל כל מבחנה.
- שימוש במחט 26 גרם, מזרק התערובת 2 - 3 פעמים. בדיקה חזותית עבור תאים בודדים. מזרק 1-2 פעמים נוספות אם יש עדיין organoids או אשכולות של תאים.
- צנטריפוגה ב 40 x g דקות 5-4 מעלות צלזיוס. Resuspend בגדר בתקשורת FGO 2D (מדיום הגידול FGO העכבר 2D: בינוני בינוני/F12 נשר ששונה מתקדמת של Dulbecco בתוספת 2 מ מגלוטמין, 10 מ מ פניצילין/סטרפטומיצין, 10% עוברית עגל סרום, 10 מ מ מאגר HEPES, 1 x N2, 1 x B27, בתוספת 10 ננומטר גסטרין, 50 ננוגרם למ"ל גורם הגדילה באפידרמיס, 1 מיקרומטר TGF-β מעכב ו- 10 מיקרומטר רוק Y-27632 מעכב. 2D מדיום הגידול האנושית של FGO: בינוני בינוני/F12 נשר שונה של Dulbecco מתקדם בתוספת 2 מ מגלוטמין, 1% פניצילין/סטרפטומיצין, 10 מ מ HEPES מאגר, 10% עוברית עגל סרום, 10 מ מ Nicotinamide, 1 x N2, 1 x B27, בתוספת 50 מ"ג/מ"ל Kanamycin, 50 ננוגרם למ"ל גדילה עוריות פקטור, ו- 10 מיקרומטר רוק Y-27632 מעכב, 1 מיקרומטר TGF-β מעכב).
- צלחת resuspension על צלחות מצופה. דגירה צלחות ב 37 º C. החלפת מדיה כל 4 ימים או מוקדם יותר אם המדיה לצהוב. טפט דורשת כ 4 ימים לטופס.
6. לגרד Assay הפצע באמצעות תאים אפיתל הקיבה 2D Monolayers
- בעזרת סכין גילוח, לגרד את חד שכבתי כאשר התרבות הגיעה confluency 100%.
- לתקן את monolayers באמצעות פורמלין 3.7% למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. Permeabilize ללא יונית 0.5% סבון/PBS במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
- הבא לחסום monolayers עם סרום החמור 2% לשעה בטמפרטורת החדר, דגירה לדילול 1:1000 H+, K+-ATPase נוגדן ראשוני בין לילה ב 4 ° C, לשטוף עם 0.1% ללא יונית דטרגנט/PBS, דגירה עם בטחונות דילול של חמור נוגדן אנטי עכבר 488 משני ו- 10μg/mL של גרעין התא Hoechst כתם לשעה בטמפרטורת החדר.
- כדי לזהות את התאים משטח בור ריריות בתרבויות חד שכבתי קיבה 2D האדם, נגזר, כתם תאים עם 20 μg /mL של המספר המשלים FITC Ulex europaeus (UEAI). תמונה monolayers על מיקרוסקופ קונפוקלי.
- קח תמונות של הפצע כל ה כמה שריטות epithelialize מחדש בין 24-48 שעות בהתאם לאיכות של טפט וריאציה בין חולים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Organoids נגזר קורפוס/גוף האדם או הפונדוס של רקמות הקיבה העכבר (איור 1 א'). לאחר collagenase או EDTA העיכול של האדם או עכבר-נגזר רקמת הקיבה בהתאמה, בלוטות מוטבע לתוך קרום המרתף מטריקס, תרבותי במשך 6-7 ימים (איור 1 א'). איור 1B מדגים את היווצרות האדם, נגזר קיבה organoids (huFGOs) זה ואז הועבר לטיפולו טפט אפיתל הקיבה (huGEM) בשקופיות קאמרית מצופים מטריצה קרום המרתף. לאחר 4 ימים של התרבות, confluent huGEMs שימשו מבחני פצע שריטה (איור 1B). התמונות שנאספו מניתוח לשגות זמן של huGEM הראתה סגירת הפצע בתוך התרבות על פני תקופה של 24 שעות (איור 2).
HuGEMs נמצאו לבטא את שושלות תאים עיקריים נמצאו בתוך רקמת הקיבה מקורית. Immunofluorescence מכתים חשף את הביטוי של E מקוטב טפט קדהרין-חיוביות אשר כללה את הקודקוד (איור 3B, ג), על פני ריריות (איור 3B, D) תאים. ניתוח ה-PCR באמצעות RNA שנאסף monolayers אלה אישר את הביטוי של תאי ריריות הקודקוד ועל פני השטח, בנוסף התאים הצוואר הצ'יף והכומר ריריות (איור 3E). Confluent huGEMs הביע כמה תאים proliferating (איור 3F). ניתוח של אלה שושלות תאים עיקריים בתוך פצע שריטה וזמינותו גילה ביטוי מתמשכת של תאי ריריות משטח צוואר הקודקוד, צ'יף, ריריות מעל שעה 24 פרק זמן (איור 4A, ב'). באופן קולקטיבי, נתונים אלה מדגימים את השימוש huGEMs כמערכת תרבות הרומן לימודים התחדשות קיבה במבחנה.
איור 1: דור של האדם, נגזר organoids קיבה (huFGO), monolayers אפיתל הקיבה הראשי (huGEM). (א) להחליפן בתמונות של הבטן רקמת ועכבר קיבה אנושית המשמש ליצירת בלוטות לתרבות תא צורב. אזור מחולקת לרמות מציינת אזור fundic של הקיבה העכבר. דור (B) של האדם, נגזר קיבה organoids (huFGOs) אשר משמשים עבור התרבות של האדם, נגזר קיבה אפיתל monolayers (huGEMs). תמונה ייצוגית של huGEM לאחר שריטה מציג את האזור הפצוע. סרגל קנה מידה = 500 μm אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: פצע שריטה assay. להחליפן בתמונות שנאסף ניסוי מעניין בזמן שימוש huGEM 0, 8, 16, ו- 24 שעות לאחר גירוד פצע. סרגל קנה מידה = 500 μm אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: ביטוי של שושלות תאים גדולים בתרבויות huGEM. Immunofluorescence מכתים של תרבויות huGEM הממחיש את הביטוי של (א) E קדהרין (Ecad, אדום), פני תאי ריריות (UEAI, ירוק), גרעינים (Hoechst, כחול), ו (B) E קדהרין (Ecad, אדום), תאי הדופן בקיבה (HK, ירוק), גרעינים ( Hoechst, כחול). ערוצים נפרדים מוצגים (ג) ו- (ד). (ה) RT-PCR התבצע בעזרת RNA מופק huGEMs עבור הביטוי של H+K+-ATPase (ATP4a), pepsinogen C (PgC), MUC5AC, MUC6. תאים Proliferating (נ) בתוך התרבות huGEM נקבע על-ידי ספיגת אדו (אדום). קנה המידה של בר (י-ם) = 50 μm, סולם בר (נ) = 100 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: שינויים בביטוי שושלת היוחסין תא וזמינותו פצע שריטה. Immunofluorescence מכתים של תרבויות huGEM הממחיש את הביטוי של E קדהרין (Ecad, אדום) או משטח תאים ריריות (UEAI, ירוק) או תאי הדופן בקיבה (HK, ירוק), גרעינים (Hoechst, כחול) באמצעות שקופיות שנאסף huGEM תרבויות 0, 8, 16 ו-24 שעות פוסט שריטה-פצע. Bkgrd = רקע מכתים של קרום המרתף מטריקס בשקופיות. XY-ציר בר סולם של 0 - 400 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| מדיה 3D העכבר | פתרון מניות | ריכוז העבודה |
| nAcetylcysteine | אבקת | 1 מ מ |
| גסטרין | 10 מיקרומטר | 10 ננומטר |
| EGF | µg 500/mL | 50 ng/mL |
| הראש | µg 100/mL | 100 ננוגרם למ"ל |
| FGF10 | µg 100/mL | 100 ננוגרם למ"ל |
| YCMD | 10 מ מ | 10 מיקרומטר |
| B27 | 50 x | 1 x |
| N2 | 100 x | 1 x |
| עט/סטרפ | 1 מ' | 10 מ מ |
| HEPES | 1 מ' | 10 מ מ |
| Glutamax | 200 מ מ | 2 מ מ |
| ונ ט | 50% v/v | |
| R-Spondin | 10% v/v |
טבלה 1: העכבר רכיבי מדיה תלת-ממד.
| מדיה 2D העכבר | פתרון מניות | ריכוז העבודה |
| FCS | 100% | 10% |
| YCMPD | 10 מ מ | 10 מיקרומטר |
| גסטרין | 10 מיקרומטר | 10 ננומטר |
| EGF | µg 500/mL | 50 ng/mL |
| B27 | 50 x | 1 x |
| N2 | 100 x | 1 x |
| עט/סטרפ | 1 מ' | 10 מ מ |
| HEPES | 1 מ' | 10 מ מ |
| Glutamax | 200 מ מ | 2 מ מ |
| TGF-β מעכב | 10 מ מ | 1 מיקרומטר |
טבלה 2: העכבר רכיבי מדיה 2D.
| מדיה תלת-ממד אנושי | פתרון מניות | ריכוז העבודה |
| Nicotinamide | אבקת | 10 מ מ |
| nAcetylcysteine | אבקת | 1 מ מ |
| גסטרין | 10 מיקרומטר | 1 ננומטר |
| EGF | µg 500/mL | 50 ng/mL |
| הראש | µg 100/mL | 100 ננוגרם למ"ל |
| FGF10 | µg 100/mL | 200 ng/mL |
| YCMD | 10 מ מ | 10 מיקרומטר |
| B27 | 50 x | 1 x |
| N2 | 100 x | 1 x |
| עט/סטרפ | 1 מ' | 10 מ מ |
| HEPES | 1 מ' | 10 מ מ |
| Glutamax | 200 מ מ | 2 מ מ |
| Kanamycin | 1 מ' | 10 מ מ |
| המפוטריצין/Gentamycin | µg 125/mL | 1 מ מ |
| ונ ט | 50% v/v | |
| R-Spondin | 10% v/v |
טבלה 3: רכיבי מדיה תלת-ממד אנושי.
| מדיה 2D אנושי | פתרון מניות | ריכוז העבודה |
| FCS | 100% | 10% |
| YCMPD | 10 מ מ | 10 מיקרומטר |
| גסטרין | 10 מיקרומטר | 1 ננומטר |
| EGF | µg 500/mL | 50 ng/mL |
| B27 | 50 x | 1 x |
| N2 | 100 x | 1 x |
| עט/סטרפ | 1 מ' | 10 מ מ |
| HEPES | 1 מ' | 10 מ מ |
| Glutamax | 200 מ מ | 2 מ מ |
| TGF-β מעכב | 10 מ מ | 1 מיקרומטר |
| Nicotinamide | אבקת | 10 מ מ |
| Kanamycin | 1 מ' | 10 מ מ |
טבלה 4: רכיבי מדיה 2D אנושי.
| הבעיה ניסיוני | פתרון בעיות עצה |
| Monolayers להיכשל טופס מ- organoids | 1) culturing אופטימאליים עבור פרוטוקול זה משתנה בין צרכים ניסיוני. אנושית ותרבותית monolayers העכבר נגזר organoids צריך להיות באמצעות מטריצת קרום המרתף מדולל בעת שימוש זכוכית או פלסטיק תרבות מנות. אולם, קולגן זנב החולדה היא אופטימלית לניסויים טפט של העכבר או הוספת מקור אנושי הדורשים ממברנה פוליאסטר. 2) אופטימאליים culturing משתנים בהתאם לקבוצת הניסוי למעלה. תרבויות באמצעות תא בודד ההשעיה אידיאלי מתורבתים עם 3D FGO מדיה ואילו organoids ללא פגע מתורבתים עם 2D FGO מדיה. |
| Monolayers נגזר בגילאי חולים (> 55 שנים) או עכברים (> 18 חודשים) נכשלה לגדול ולהגיע confluency | אם באמצעות רקמות הקיבה שנאסף עכברים בגיל העמידה (> 18 חודשים) או חולים (> 55 שנה) צריך להיות מוכפל הצפיפות של organoids המשמש את הדור של טפט בהתחשב בכך היעילות צמיחה של organoids הוא ירד. |
| Organoids להיכשל טופס מן בלוטות | מומלץ הזה טרי (שזה עתה לרכוש במידת האפשר) גסטרין לשמש. השתמש גסטרין טרי מחדש על תנאי כל 4 חודשים. |
| Organoids להיכשל לצרף ויוצרים monolayers | ודא כי הסרת יעיל של מטריקס קרום המרתף הושגה לאחר קציר organoids לצורך העברת ללוחות תרבות עבור monolayers. |
| תרבויות נגזר בגילאי חולים (> 55 שנים) או עכברים (> 18 חודשים) להיכשל | בתקופות דגירה והעיכול, מספיקה 15-30 דקות של דגירה הראשוני ולאחריו 5 דקות במרווחים של דגירה לפי הצורך. יצוין, כי חולים גדול מ- 55 שנים של גיל יכול להיות בלוטות הם חלופה מועדפת יותר בקלות, ולכן מצריך פחות לעיכול. באופן דומה, FGOs נגזר חולים בגילאי יש להציג זמן צמיחה איטית יותר, ורגישות מוגברת כדי צנטריפוגה. כדי להשיג את התוצאות הטובות ביותר, להגביל כל צנטריפוגה עודף בעת עבודה עם רקמת בגילאי ולהחליף מדיה מתוזמנים. |
טבלה 5: עצות לפתרון בעיות. נתקל בעיות ופתרונן המומלצת הממסד אופטימלית, התרבות של האדם או בעכבר monolayers קיבה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בפרוטוקול הנוכחי מפרט הקמתה של האדם ואת העכבר-נגזר קיבה אפיתל monolayers יכול לשמש עבור מבחני שריטה-פצע. הפרוטוקול תלוי המושג תושב תאי בידוד האדם הראשי (או עכבר) ברקמות, פרוטוקול ששונה מתפרסם לראשונה על ידי Schlaermann et al7. בפרט, יש אופטימיזציה פרוטוקול כאן להקים confluent ואנו מקוטב טפט אפיתל הקיבה אשר מבטא המייג'ור תא שושלות אשר ניתן למצוא בתוך ה אפיתל הקיבה ויוו. תיקון כיב קיבה הוא תהליך מורכב, הכרוך רקמת epithelialization מחדש, התחדשות, התפשטות9,10,11. בפרט, המעבדה שלנו דיווחה כי התחדשות של האפיתל הקיבה עולה בקנה אחד עם הופעתה של מפוליפפטיד spasmolytic/trefoil פקטור (TFF) לבטא 2 מטפלזיה (SPEM) בקצה תחום כיב בתוך בלוטות הקיבה ההתחדשות 12,13. SPEM מוגדר את transdifferentiation של שושלת היוחסין התא הראשי לתוך מטפלזיה תא ריריות14 זה מגיח עם פציעה ונעלם כאשר רירית חוזר אל הרכב סלולרית רגילה שלה12. לפיכך, במחקר כזה מנגנון במערכת במבחנה , זה חיוני כי שושלות תאים גדולים, כגון תאי צ'יף, הם מתנה בתוך התרבות.
השימוש של פצע שריטה מבחני שימשו נרחב לחקר תיקון והתחדשות, עד לאחרונה, שורות תאים סרטן קיבה היו בשימוש1,2,3,4. בעוד מנגנוני היסוד נחשפו באמצעות שורות תאים סרטן קיבה, תרבויות אלה הופכים וחסרי המגוון הסלולר של רקמת הקיבה מקורית. HuGEMs מוצגים כדי לשמור על קומפוזיציה הסלולר מקוטב ומגוון זה מקרוב recapitulates את אפיתל הקיבה vivo בתוך. בנוסף, אחרי שהגיע huGEM confluency תרבויות יכול להישמר עד לחודש בתנאים אופטימליים. תרבויות המורחבת לאפשר לניסויים לטווח ארוך. לפיכך, יישומים עתידיים של huGEMs עשוי להיחשב כוללים טפט/החיסון התא שותף תרבויות וניסויים לטווח ארוך עבור חקר הליקובקטר פילורי פתוגנזה.
ישנם היבטים טכניים חשוב לציין בפרוטוקול הנוכחי. הנקודה הטכנית הראשונה היא כי הבחירה של קרום המרתף מרכיב משתנה בהתאם השטח התרבות התא כדי לשמש לניסויים. כדי להבטיח תנאים מיטביים טפט נגישים, מומלץ שקולגן זה משמש בעת ניסויים עם monolayers דורשים צלחות עם ממברנה פוליאסטר מוסיף. עם זאת, אם טפט ניסויים מחייבים זכוכית או פלסטיק תרבות משטחים, קרום המרתף מדולל מטריקס היא הבחירה האופטימלית של ציפוי. שנית, הצפיפות של organoids נדרש להגיע עם טפט confluent שתישמר בהתאם לגיל המטופל שמהם נאסף רקמת קיבה. בשביל לרקמות שנאסף עכברים בגיל (> 18 חודשים) או חולים (> 55 שנה), צפיפות תא צורב בשימוש צריכה להיות כפולה מוגברת כאשר העברת טפט בשל יכולת צמיחה ירידה ב בגילאי יחידים. במהלך העיכול דגירה של רקמה אנושית נגזר חולים בגילאי, בלוטות עשויים להיות רגישים יותר דיסוציאציה, צנטריפוגה, ולכן: 1) צריך להיות centrifuged במשורה כמו אפשרי, 2) מדיה החליף בחריצות, ובמהלך 3) עיכול incubations של 15-30 דקות עם digestions מצטבר של 5 דקות לאחר מכן יקטין את הסבירות של לאורך מערכת העיכול. לבסוף, כאשר ויוצרים monolayers של המתלים נגזר תא צורב תא בודד, מדיה FGO תלת-ממד הוא האופטימלי ביותר עבור נאות היווצרות monolayers ואילו כאשר culturing מ organoids ללא פגע, מדיה FGO 2D נצפתה להניב את היעילות הגבוהה ביותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי NIH (NIDDK) 5 R01 DK083402-07 הענק (yz ימאהה).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced Dulbecco's modified Eagle/F12 medium (basal media) | Life Technologies | 12634-010 | |
| GlutaMAX (L-glutamine) | Life Technologies | 25030-081 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Scientific | SV30010 | |
| Amphotericin B/Gentamicin | Thermo Scientific | R01510 | |
| Kanamycin | Thermo Fisher | RO1510 | |
| HEPES Buffer | Sigma Aldrich | H0887 | |
| n-Acetylcystine | Sigma Aldrich | A9165 | |
| N2 | Life Technologies | 17502-048 | |
| B27 | Life Technologies | 12587-010 | |
| BMP Inhibitor (Noggin) | Pepro Tech | 250-38 | |
| Gastrin | Tocris | 3006 | |
| EGF | Pepro Tech | 315-09 | |
| FGF10 | Pepro Tech | 100-26 | |
| Nicotinamide | Sigma Aldrich | N0636 | |
| Y-27632 ROCK Inhibitor | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| TGF-β Inhibitor | Tocris | 2939 | |
| Ca2+/Mg2+ -free DPBS | Fisher | 21-031CV | |
| Dulbecco's modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 12634-010 | |
| Fetal Bovine Serum | FBS | ||
| OPTIMEM | Invitrogen | ||
| 0.22µM filter | Fisher | 099-720-004 | |
| 37 °C Water Bath | |||
| Collagenase Type 1 | Worthington | LS004214 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9418 | |
| Kimwipes (tissue paper) | Fischer Scientific | 06-666C | |
| 125 mL round bottom flask | |||
| 1 in (25 mm) stir bar | |||
| Rubber Septa | |||
| Sterile Gauze | |||
| Stir Plate | |||
| Ring Stand | |||
| Ring Stand Clamps | |||
| Sterile petri dish | |||
| 18 G needles of 1.5 in length | Thermo Fisher | 305196 | |
| 20 G spinal needles of 3.5 in length | Thermo Fisher | 405182 | |
| 12-well cell culture treated plate | Midwest Scientific | 92012 | |
| Growth Factor Reduced, Phenol Red-free MatrigelTM (Basement membrane matrix) | Fisher | CB-40230C | |
| Sterile Razor Blades | |||
| Wide-tip tweezers | |||
| Curved Hemostatic Forceps | |||
| 200 µL wide pipette tips | Thermo Fisher | 02-707-134 | |
| 5 mL cell culture test tubes | Fisher | 14-956-3C | |
| Oxygen Tank with rubber hosing | |||
| 1 g D-Sorbitol | |||
| Sucrose | Fisher | SS-500 | |
| Dissecting microscope | |||
| Dissecting Tray | |||
| Rocking Table | |||
| Rat Tail Collagen Type 1 | Life Technologies | A10483-01 | |
| Cell culture grade glacial acetic acid | Fisher | A38-212 | |
| Cell culture grade water | Corning | 25-055-CV | |
| 2-well chamber slide | Thermo Fisher | 155380 | |
| 12-well Transwell (polyester membrane inserts) | Corning | 3460 | |
| Cell scraper | Corning | 353086 | |
| Accutase (cell detachment solution) | Stemcell Technologies | 7920 | |
| 263/8 G syringe | Thermo Fisher | 309625 | |
| Razor blade | |||
| L Cells | L cells, a Wnt3a producing cell line, were received as a gift from Dr. Hans Clevers (Hubrecht Institute for Developmental Biology and Stem Cell Research, Netherlands). | N/A | |
| HEK-293T Rspondin secreting cells | A modified HEK-293T R-spondin secreting cell line was obtained from Dr. Jeff Whitsett (Section of Neonatology, Perinatal and Pulmonary Biology, Cincinnati Children's Hospital Medical Centre and The University of Cincinnati College of Medicine, Cincinnati, USA ). | N/A | |
| HK-ATPase Primary Antibody | Invitrogen | SC-374094 | |
| E-Cadherinn | SantaCruz | sc-59778 | |
| UEA1 | Sigma Aldrich | L9006 | |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher | H3570 | |
| Alexafluor 488 secondary antibody (Donkey anti-mouse 488 secondary antibody) | ThermoFisher Scientific | R37114 |
References
- Nagy, T. A., et al. Helicobacter pylori regulates cellular migration and apoptosis by activation of phosphatidylinositol 3-kinase signaling. J Infect Dis. 199 (5), 641-651 (2009).
- Mnich, E., et al. Impact of Helicobacter pylori on the healing process of the gastric barrier. World J Gastroenterol. 22 (33), 7536-7558 (2016).
- Zhang, Y., et al. Bm-TFF2, a toad trefoil factor, promotes cell migration, survival and wound healing. Biochem Biophys Res Commun. 398 (3), 559-564 (2010).
- Crabtree, J. Role of cytokines in pathogenesis of Helicobacter pylori-induced mucosal damage. Dig Dis Sci. 43 (Supplement), 46S-53S (1998).
- Riahi, R., Yang, Y., Zhang, D. D., Wong, P. K. Advances in wound-healing assays for probing collective cell migration. J Lab Autom. 17 (1), 59-65 (2012).
- Zhang, M., Li, H., Ma, H., Qin, J. A simple microfluidic strategy for cell migration assay in an in vitro wound-healing model. Wound Repair Regen. 21 (6), 897-903 (2013).
- Schlaermann, P., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. 65 (2), 202-213 (2016).
- Bertaux-Skeirik, N., et al. CD44 plays a functional role in Helicobacter pylori-induced epithelial cell proliferation. PLoS Pathog. 11 (2), e1004663 (2015).
- Tarnawski, A. S. Cellular and molecular mechanisms of gastrointestinal ulcer healing. Dig Dis Sci. 50 (Suppl 1), S24-S33 (2005).
- Wright, N. A., Pike, C., Elia, G. Induction of a novel epidermal growth factor-secreting cell lineage by mucosal ulceration in human gastrointestinal stem cells. Nature. 343, 82-85 (1990).
- Wright, C. L., Riddell, R. H. Histology of the stomach and duodenum in Crohn's disease. Am J Surg Pathol. 22 (4), 383-390 (1998).
- Engevik, A. C., et al. The Development of Spasmolytic Polypeptide/TFF2-Expressing Metaplasia (SPEM) During Gastric Repair Is Absent in the Aged Stomach. CMGH. , In Press (2016).
- Bertaux-Skeirik, N., et al. CD44 variant isoform 9 emerges in response to injury and contributes to the regeneration of the gastric epithelium. Journal of Pathology. 242 (4), 463-475 (2017).
- Nam, K. T., et al. Mature chief cells are cryptic progenitors for metaplasia in the stomach. Gastroenterology. 139 (6), 2028-2037 (2010).
