Summary
Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Einrichtung und Kultivierung von Mensch und Maus abgeleitet 3-dimensionale (3D) Magen Organellen und die Methode für die Übertragung von 3D Organellen auf eine 2-dimensionale monomolekularen Film. Die Verwendung von Magen epithelialen Monolage als eine neuartige Kratzer-Wunde-Assay für Regeneration Studien wird ebenfalls beschrieben.
Abstract
In-vitro- Studien der Magen Wunde Reparatur umfasst in der Regel die Verwendung von Magenkrebs Zell-Linien in einem neu-Wunde-Assay der zelluläre Proliferation und Migration. Eine kritische Einschränkung solcher Tests ist jedoch ihre homogene Sortiment von zellulären Arten. Reparatur ist ein komplexer Prozess, der die Interaktion der verschiedenen Zelltypen verlangt. Daher geht um eine Kultur zelluläre Subtypen zu studieren, die überwunden werden müssen, wenn wir die Reparatur-Prozess zu verstehen. Das Magenband organoide Modell kann dieses Problem beheben, wobei die heterogene Sammlung von Zelltypen, die den Magen Epithel oder anderen nativen Gewebe in Vivoentspricht. Gezeigt, hier ist ein Roman, in-vitro- Kratzer-Wunde Assay abgeleitet von Mensch oder Maus 3-dimensionale Organellen, die dann auf eine gastrische Epithelzellen Monolage als entweder intakten Organellen oder als einzelne Zelle Aussetzung der übertragen können getrennt Organellen. Das Ziel des Protokolls ist, organoide abgeleitet gastrische Epithelzellen Monolagen zu etablieren, die in einem Roman Kratzer-Wunde-Assay-System einsetzbar, um Magen-Regeneration zu studieren.
Introduction
Die Verwendung von Grund auf neu-Wunde-Assays ist eine beliebte Methode zur Untersuchung von Reparatur und Regeneration1,2,3,4,5,6. Die vorgeschlagene Methode kann verwendet werden, insbesondere Magen-Regeneration und Helicobacter Pylori Besiedlung zu studieren. In der Vergangenheit Magenkrebs Zelllinien als Mittel verwendet wurden, um Helicobacter Pylori (H. Pylori) Infektion1,2 studieren und Zell-Linien wie AGS Zellen waren bis vor kurzem Magenkrebs favorisierte1 ,2,3,4. Eine Einschränkung der Magenkrebs Zellkulturen ist ihrer Nichtbeachtung die zelluläre Vielfalt der Magen Epithel zu rekapitulieren. Zu versuchen, diese Einschränkung Adresse gezeigt, hier ist die Errichtung und die Übertragung der primären Mensch und Maus abgeleitet 3-dimensionale fundic Magen Organellen (FGOs), ein Magen epithelialen Monolage für Wunde heilende Assays basieren auf einer modifizierten Methode zuerst von Schlaermann Et al.beschrieben. 7 wir zeigen, dass Magen epitheliale Monolagen abgeleitet 3D Magen FGOs geschert oder FGO abgeleitet Einzelzellen behalten eine polarisierte zelluläre Zusammensetzung, die eng, die der Magen Epithel darstellt in-vivo. Angesichts der Tatsache, dass Magenkrebs Zelllinien keine Zelle Zusammensetzung, die diese Technik zeigt erkennen lassen, hat das aktuelle Protokoll einen Vorteil gegenüber alternativen Kratzer-Wunde-Assay-Methoden. Diese Methodik wurde optimiert, wobei Monolagen etablierten aus ganzen Organellen oder aus einer einzelnen Zelle Suspendierung vom dissoziierten Organellen und überzogen mit einer Basalmembran Matrix oder Kollagen-Beschichtung werden können. Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, festzulegen, dass eine organoide gastrische Epithelzellen Monolage Kulturen für einen neuartigen Wunde heilende Assay abgeleitet.
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Protocol
Um Kontaminationen zu vermeiden, führen Sie Protokoll in seiner Gesamtheit in eine sterile Gewebekultur Kapuze. Fundic Gewebe von Patienten mit Sleeve-Gastrektomie nach dem genehmigten Protokoll der University of Cincinnati IRB gesammelt wurde (IRB-Protokollnummer: 2015-4869).
Alle Studien an Mäusen wurden genehmigt, von der University of Cincinnati institutionelle Pflege der Tiere und Nutzung Committee (IACUC), die eine American Association of Assessment und Akkreditierung von Laboratory Animal Care (AAALAC) Anlage unterhält.
1. zur Gründung Human abgeleitet 3D Magen Fundic Organellen
Hinweis: Dieses Protokoll basiert auf Recherchen, die zuvor in diesem Labor8veröffentlicht.
- Bereiten Sie 3D organoide Medien besteht aus 50 % Wnt konditioniert und zu 20 % R-Spondin konditioniert Medien vor.
- Bereiten Sie Wnt konditioniert Medien, Kultur der L-Zellen im Wnt Wachstumsmedium (Dulbecco modifizierten Eagle Medium (DMEM), 10 % fetalen bovine Serum (FBS), 1 % Penicillin/Streptomycin) für 7 Tage, das Medium zu ernten, und Filtern Sie mit einem 0,22 µm-Filter.
- R-Spondin konditioniert Medien vorbereiten. Eine modifizierte HEK-293T R-Spondin absondernde Zelllinie R-Spondin Nährmedium wachsen (Dulbecco modifizierten Eagle Medium (DMEM), 10 % fetalen bovine Serum (FBS), 1 % Penicillin/Streptomycin). Auf Anlage nach 2 h, ändern Sie das Medium aus diesen Zellen in OPTIMEM Wachstum Mittel, 1 % Penicillin/Streptomycin. Kulturzellen Sie für 7 Tage. Dann ernten die R-Spondin konditioniert Medien und Filtern mit einem 0,22 µm-Filter.
Hinweis: Dieses Protokoll ist bereits erschienen und für eine ausführlichere Protokoll beziehen sich auf 6,7,8.
- Auftauen der Wachstumsfaktor reduziert, Phenol rotfrei-Basalmembran Matrix für 16 h auf dem Eis bei 4 ° C. Sammeln Sie das Gewebe in den eiskalten Ca2 +/Mg2 +-DBPS in einem großen Kunststoff-Behälter frei. Speichern Sie auf dem Eis bis Anfang Schritt 1.4.
Hinweis: Gewebe wird von Patienten, die Sleeve-Gastrektomie gesammelt. - Mit Pinzette, waschen das Gewebe kräftig in einem sterilen Becher mit 100 mL Ca2 +/Mg2 +-freie Dulbeccos Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (DPBS). Wäsche für ca. 30 s oder bis die Trümmer und das Blut entfernt wurde. Als nächstes mit steriler Gaze, wischen Sie die Schleimschicht aus dem Epithel.
- Mit großen Zangen, fest fassen Sie die Muskelschicht des Gewebes und mit Kraft, kratzen Sie entfernt das Epithel mit der großen gebogenen blutstillende Pinzette. Sammeln Sie die ausgekratzte epithelialen Fragmente in eine Petrischale aus Polystyrol, steril.
- Zerkleinere die Epithelgewebe in etwa 2.0 x 2.0 mm2 große Fragmente mit Rasierer, um Gewebe Verdauung zu optimieren. Waschen Sie die gewebefragmente mit Ca2 +/Mg2 + -frei DBPS ergänzt mit Antibiotika (Ca2 +/Mg2 + -freie DPBS, 1 % Penicillin/Streptomycin, 0,25 mg/mL Amphotericin B 10 mg/mL Gentamicin, 50 mg/mL Kanamycin), bis die Wäsche ist frei von Blut. Führen Sie mehrere Wäschen, wenn nötig. Aus der Wäsche durch sorgfältig filtern die Wäsche durch eine sterile Gaze in ein Becherglas Abfall entsorgen.
- Sammeln gewaschen Fragmente in ein 125 mL Glas Runde untere Kolben mit 25 mm Stir Bar und vorgewärmten Inkubation Medien (basale Medien ergänzt mit 2 mM L-Glutamin, 1 % Penicillin/Streptomycin, 10 mM HEPES-Puffer, 1 mg/mL Kollagenase Typ1, 2 mg/mL Zellkultur Klasse Rinderserumalbumin). Versiegeln der Rundboden-Küvette mit Kautschuk Septen.
- Legen Sie eine 20 G spinalnadel in die Septen und schließen Sie es an eine Sauerstoffflasche mit Kautschuk Schlauch. Um Verunreinigungen herauszufiltern, stecken Sie Seidenpapier in den Schlauch zum Erstellen eines Filters. Schalten Sie den Sauerstoff-Abfluss auf Low. Die Septen zu vermeiden, den Bruch der Septen stecken Sie 10-15 Abfluss Nadeln.
- Sichern Sie den Satz bis zum Ring stehen mit Schellen und legen Sie es in einem Wasserbad auf 37 ° C mit einer Platte rühren für 30-45 min kalibriert. Nachdem das Gewebe für 15 min Inkubation wurde, entfernen Sie 50 µL der Inkubation Medien und visuell suchen dissoziierten Drüsen. Wenn Drüsen nicht dicht sind oder nicht aus dem Gewebe getrennt haben, lassen Sie für eine weitere 5-10 min.
- Fügen Sie unmittelbar nach der Inkubation, 50 mL DMEM/F12 vorgewärmt, Inkubation Medien mit einer sterilen serologische Pipette oder indem Sie direkt in die Inkubation-Mischung Gießen.
- Filtern Sie die Drüse Mischung durch eine sterile Gaze in vier 50 mL konische Röhrchen. Halten Sie das Filtrat auf Eis für 15 min erlauben extrahierte Drüsen an der Unterseite des konischen Rohres zu begleichen. Achten Sie darauf, nicht zu stören die sesshaften Drüsen, entfernen und entsorgen Sie weg von der Oberseite 40 mL überstand mit einer serologischen Pipette. Aufzuwirbeln Sie die restliche 10 mL in 10 mL des DPBS ergänzt mit Antibiotika.
- Verteilen Sie die Mischung gleichmäßig in 5 mL Zelle Kultur Reagenzgläser. Für 5 min bei 65 X g bei 4 ° C zentrifugiert und den Überstand mit einer Pipette vorsichtig zu entfernen. Aufzuwirbeln Sie die Drüse Pellet in aufgetauten Basalmembran Matrix mit einer Pipette oder einem 200 µL Breite PIPETTENSPITZE. Mischen Sie, bis Sie homogen.
Anmerkung: Es ist wichtig, diesen Schritt ausführen, auf dem Eis und Polymerisation der Basalmembran Matrix beim Mischen zu vermeiden. Darüber hinaus ist es wichtig, die Drüse Dichte von Stichproben für 50 µL Sichtprüfung. Die optimale Dichte ist ~ 70 % Konfluenz. - Als nächstes Platte die Drüsen in 50 µL der Basalmembran Matrix mit einer Pipette weit gekippt. Produzieren Luftblasen während der Beschichtung zu vermeiden.
- Damit können Basalmembran Matrix zu polymerisieren, 10-15 min bei 37 ° c inkubieren Wenn in einer Kultur 12-Well-Platte Plattieren, fügen Sie 1 mL hFGO Medien (Advanced Dulbecco modifizierte Eagle Medium/F12 Medium ergänzt mit 2mM L-Glutamin, 1 % Penicillin/Streptomycin, 0,25 mg/mL Amphotericin B 10 mg/mL Gentamicin, 50 mg/mL Kanamycin, 10 mM HEPES Puffer, 1 mM n-Acteylcystine, 1 X N2, 1 x B27, 50 % Wnt konditioniertes Medium, 20 % R Spondin-konditioniertes Medium ergänzt mit 100 ng/mL Knochen morphogenetische Protein Inhibitor 1 nM Gastrin, 50 ng/mL Epidermal Growth Factor, 200 ng/mL Fibroblasten-Wachstumsfaktor 10, 10 mM Nicotinamid, und 10 µM Y-27632 ROCK-Inhibitor) pro Bohrloch. Wenn nicht mit einer Kultur 12-Well-Platte hinzufügen genügend Medien um die Basalmembran Matrix Blase zu versenken.
- Kultur der Zellen bei 37 ° C in einem 5 % CO2 befeuchtete Zelle Kultur Inkubator. Wechseln Sie Medium alle 4-5 Tage.
2. Einrichtung Maus stammenden 3D Magen Fundic Organellen
Hinweis: Dieses Protokoll wurde bisher erschienen 6. Tauen Sie Basalmembran Matrix auf dem Eis auf und bereiten Sie alle Reagenzien vor Beginn.
- Opfern Sie Mäuse mit einer Methode, die von der Forschungseinrichtung genehmigt wo ist Forschung durchgeführt. Entfernen Sie den Magen von der Maus und sezieren Sie gemäß den zuvor veröffentlichten Protokolle 6. Waschen in 20 mL Eis kalt Ca2 +/Mg2 +-DBPS frei.
Hinweis: C57BL/6 Mäusen, im Alter von 8-10 Wochen werden für fundic Magen organoide Kulturen verwendet. Mäuse wurden durch das Einatmen von Kohlendioxid, gefolgt von manuellen zervikale Dislokation vor dem Magen entfernen eingeschläfert. - Streifen die Muskelschicht aus dem Magen und sichtbaren Blutgefäße wie zuvor 6veröffentlicht.
- Trennen Sie den Fundus von Antrum und Vormagen mit einer sterilen Rasierklinge. Geschnittenen Fundus mit kleine Chirurgische Schere in Fragmente ca. 2,0 x 2,0 mm. mit Zange, sammeln die Fragmente in einem 15 mL konische Röhrchen mit EDTA Inkubation Puffer (Ca2 +/Mg2 +-freie DPBS, 5 mM EDTA) und inkubieren Sie bei 4 ° C für 2 h mit sanfte Bewegung.
- In einem sterilen Haube konische Rohr verlassen und Fragmente auf Eis für etwa 5 min. soviel Inkubation Puffer möglichst unberührt Fragmente entfernen mit einer Pipette. Geben Sie 5 mL Puffer schütteln (1 g D-Sorbit, 1,47 g Saccharose in 100 mL Ca2 +/Mg2 +-frei DPBS) und von hand mit einer Kraft zu schütteln, für 2 min. ermöglicht die große Fragmente zu begleichen und mit Eile, mit einer Pipette 1000 p entfernen die kleinen Fragmente, die noch zu begleichen in der oberen Schicht.
- Drehen Sie die entfernte Fragmente für 5 min bei 4 ° C bei 65 X g.
- Unter Vermeidung von Luftblasen, entnehmen Sie des Überstands in der Basalmembran Matrix Aufschwemmen Sie und mischen Sie, bis sie homogen ist.
- Verwenden Sie eine breite Spitze-Pipette, um die Basalmembran Matrix in 50 µL pro Well Platte und dann bei 37 ° C für 20 min inkubieren.
- Fügen Sie genug mFGO Wachstumsmedien (Advanced Dulbecco geändert Eagle Medium/F12 Medium ergänzt mit 2mM L-Glutamin, 1 % Penicillin/Streptomycin, 10 mM HEPES Buffer, 1mM n-Acteylcystine, 1 x N2, 1 x B27, 50 % Wnt konditioniertes Medium, 20 % R-Spondin-Klimaanlage Medium mit 100 ng/mL Knochen morphogenetische Protein Inhibitor, 10 nM Gastrin 50ng/mL Epidermal Growth Factor, 10 ng/mL Fibroblasten-Wachstumsfaktor 10 und 10 µM Y-27632 ROCK Inhibitor ergänzt) um die Blase zu versenken.
- Kultur der Zellen bei 37 ° C, 5 % CO2 befeuchtete Zelle Kultur Inkubator. Wechseln Sie das Medium alle 4-5 Tage.
(3) Kollagen-Beschichtung für 2D Übertragung
Hinweis: Führen Sie alle Verfahren in einem sterilen Gewebekultur Abzug sofern nicht anders angegeben. Beginnen Sie Kollagen 24 h vor der Übertragung 3D Organellen, die Monolayer Beschichtung. Halten Sie die Ratte Schweif Kollagen auf dem Eis und vor Licht geschützt. Kollagen beschichtete Platten eignen sich für bis zu 2 Wochen. Wenn nicht sofort die beschichteten Platten verwenden, wickeln Sie die Platte im Parafilm und Store bei 4 ° C bis benötigt.
- Verdünnen Sie die Ratte Schweif Kollagen bis 50 µg/mL mit 20 mM-Essigsäure.
- Bedecken Sie hinreichend die Oberfläche des Brunnens mit verdünnter Kollagen. Für einen Brunnen in einem standard 12-Well-Platte mit etwa 1 mL der Kollagen bestreichen. Lassen Sie über Nacht bei Raumtemperatur in einer sterilen Kapuze.
- Waschen zweimal mit 1 mL Ca2 +/Mg2 +-kostenlose DPBS pro Bohrloch und lassen bei Raumtemperatur in einem sterilen Abzug für 2 h aufgedeckt.
(4) Basalmembran Matrix Beschichtung für 2D Übertragung
Hinweis: Führen Sie alle Verfahren in einem sterilen Gewebekultur Abzug sofern nicht anders angegeben. Beginnen Sie Basalmembran Matrix 2 h vor der Übertragung 3D Organellen, die Monolayer Beschichtung. Halten Sie die Basalmembran Matrix auf Eis. Beschichtete Platten sofort verwendet werden und können nicht für längere Zeit gespeichert werden.
- Verdünnen Sie die Basalmembran Matrix in einem 15 mL konische Röhrchen mit Grade Zellwasser Kultur bei einem 01:10 Verhältnis. Verdünnen Sie auf Eis.
- Mit einer Pipette geben 100 µL verdünnter Basalmembran Matrix in jedem standard 12-Well-Platte. Mit einem Zelle Schaber, gleichmäßig verteilen Sie die verdünnte Basalmembran Matrix in den Brunnen für eine gleichmäßige Schicht.
- Inkubation bei 37 ° C für 1 h.
- Entfernen Sie das restliche Wasser mit einer Pipette und Trocknen bei Raumtemperatur 1 Stunde vor der Übertragung 3D Organellen.
5. Übertragung von 3D m/hFGOs auf 2D Magen epitheliale Zelle Monoschichten
- Nach 3D Maus - oder Mensch-abgeleitet haben FGOs für 6-7 Tage kultiviert wurde, beginnen die Übertragung von 3D Organellen, die 2D Monolage.
Hinweis: Für jedes gut einen monomolekularen Film benötigt empfiehlt es 300 intakter Organellen oder einzelne Zellen aus 300 Organellen zu verwenden. In einer robusten Kultur wird es voraussichtlich ca. 150 organoide/gut innerhalb einer Platte 12 gut Kultur zu erhalten. - Achten Sie darauf, dass die Platten vor der Übertragung beschichtet sind.
Hinweis: Die Basalmembran Matrix beschichtete Platten haben eine lichtdurchlässige Gelschicht, Kollagen beschichtete Platten müssen jedoch nicht offensichtliche Anzeichen der Beschichtung. - Die 3D Basalmembran Matrix Blase von der Platte zu vertreiben, durch direkt pipettieren 1 mL sterile Ca2 +/Mg2 +-freie DBPS auf die Mitte der Blase.
- Mit einer Pipette, die Basalmembran Matrix und organoide Mischung in Reagenzgläsern Zelle Kultur sammeln. Sammeln Sie in einem Verhältnis von 2 Keller Matrix membranbläschen pro Röhre. Zentrifuge für 5 min bei 40 x g und 4 ° C.
- Mit einem Vakuumsystem Überstand entfernen und wie viel Basalmembran Matrix wie möglich. In Ca2 +/Mg2 +4 mL aufzuwirbeln-freie DBPS, entfernen den überstand und 2 - 3 Mal wiederholen. Das ganze organoide Übertragungsprotokoll fahren Sie mit Schritt 5.10. Fahren Sie mit Schritt 5.7 für die einzelne Zelle Aussetzung Protokoll.
- Zelle Ablösung Lösung auf 37 ° C vorwärmen und jedes Reagenzglas 1 mL hinzufügen. Mischen Sie vorsichtig durch invertieren Röhren oder oben und unten mit einer Pipette pipettieren. 10 min bei 37 ° c inkubieren
- Fügen Sie 2 mL Ca2 +/Mg2 +-freie DBPS direkt in jedes Reagenzglas.
- Verwenden Sie eine 26 G-Nadel und Spritze die Mischung 2-3 Mal. Eine Sichtkontrolle für einzelne Zellen. Spritze 1-2 Mal, gibt es noch Organellen oder Gruppen von Zellen.
- Zentrifuge bei 40 X g für 5 min bei 4 ° C. Das Pellet in 2D FGO Medien Aufschwemmen (2D Maus FGO Wachstumsmedium: Advanced Dulbecco modifizierte Eagle Medium/F12 Medium ergänzt mit 2mM L-Glutamin, 10 mM Penicillin/Streptomycin, 10 % fetalen Kälberserum, 10 mM HEPES Buffer, 1 x N2, 1 x B27, ergänzt mit 10 nM Gastrin, 50 ng/mL Epidermal Growth Factor, 1 µM TGF-β-Inhibitor und 10 µM Y-27632 ROCK-Inhibitor. 2D menschlichen FGO Wachstumsmedium: Erweiterte Dulbecco modifizierte Eagle Medium/F12 Medium ergänzt mit 2mM L-Glutamin, 1 % Penicillin/Streptomycin, 10 mM HEPES-Puffer, 10 % fetalen Kälberserum, 10 mM Nicotinamid, 1 x N2, 1 x B27, ergänzt mit 50 mg/mL Kanamycin, 50 ng/mL epidermiale Wachstum Faktor und 10 µM Y-27632 ROCK-Inhibitor, 1 µM TGF-β-Hemmer).
- Platte die Wiederfreisetzung auf beschichteten Platten. Platten bei 37 ° c inkubieren Ersetzen Sie Medien alle 4 Tage oder früher Wenn Medien gelb dargestellt wird. Monolage erfordert ca. 4 Tage zu bilden.
(6) kratzen Sie Wunde Assay mit 2D gastrische Epithelzelle Monoschichten
- Mit einer Rasierklinge, kratzen Sie die Monolayer, wenn die Kultur 100 % Konfluenz erreicht hat.
- Monolagen mit 3,7 % Formaldehyd für 15 min bei Raumtemperatur zu beheben. Permeabilize mit 0,5 % nicht-ionische Waschmittel/PBS für 20 min bei Raumtemperatur.
- Als nächstes blockieren Monolagen mit 2 % Esel Serum für 1 h bei Raumtemperatur und inkubieren Sie mit 1: 1000 Verdünnung von H+, K+-ATPase Primärantikörper über Nacht bei 4 ° C mit 0,1 % nicht-ionische Waschmittel/PBS waschen und inkubieren Sie mit 1: 100 Verdünnung der Esel Anti-Maus 488 Sekundärantikörper und 10μg/mL von Hoechst Zellkernen färben für 1 h bei Raumtemperatur.
- Um die Oberfläche Schleim Grube Zellen in 2D Menschen abgeleitet Magen Monolayer-Kulturen zu identifizieren, zu beflecken Zellen mit 20 μg /mL von Ulex Europaeus (UEAI)-FITC-Konjugat. Bild Monolagen auf eine confocal Mikroskop.
- Nehmen Sie Bilder von Wunde jedes Paar h. Kratzer zwischen 24-48 h abhängig von der Qualität der Monolage und Unterschiede zwischen den Patienten wieder epithelisiert werden.
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Representative Results
Organellen stammen aus dem Korpus/Körper des Menschen oder Fundus der Maus Magen Gewebe (Abbildung 1A). Nach Kollagenase oder EDTA Verdauung von Mensch oder Maus abgeleitet Magen Gewebe sind, Drüsen in Basalmembran Matrix eingebettet bzw. für 6-7 Tage (Abbildung 1A) kultiviert. Abbildung 1 b zeigt die Bildung des Menschen abgeleitet Magen Organellen (HuFGOs), die dann zu einer Magen epithelialen Monolayer (HuGEM) auf Basalmembran Kammer Matrix-beschichtete Folien übertragen wurden. Nach 4 Tagen Kultur dienten konfluierende HuGEMs für Kratzer Wunde Assays (Abbildung 1 b). Bilder gesammelt von einer Zeit verfallen Analyse der HuGEM zeigten Wundverschluss innerhalb der Kultur über einen Zeitraum von 24 Stunden (Abbildung 2).
HuGEMs wurden gefunden, die große Zelle Linien auszudrücken im nativen Magen Gewebe gefunden. Immunfluoreszenz-Färbung den Ausdruck eine polarisierte E-Cadherin-Positive monomolekularen Film, die aus der parietalen (Abb. 3 b, C) und die Oberfläche Schleim (Abb. 3 b, D) bestand aufgedeckt Zellen. PCR-Analysen mit RNA aus dieser Monolayer gesammelt bestätigt den Ausdruck der parietalen und Oberfläche Schleimhaut Zellen neben den Chef und Schleim Hals Zellen (Abbildung 3E). Konfluierende HuGEMs äußerten einige Proliferierende Zellen (Abbildung 3F). Analyse dieser großen Zelle Linien innerhalb der Kratzer Wunde Test ergab nachhaltig Ausdruck der parietalen, Chef, Schleim Hals Oberfläche Schleimhaut Zellen über eine 24-Stunden-Zeitraum (Abbildung 4A, B). Insgesamt zeigen diese Daten die Verwendung von HuGEMs als neuartige Kultursystem zu Magen-Regeneration in-vitro-Studie.
Abbildung 1: Generation von Menschen abgeleitet Magen Organellen (HuFGO) und primäre gastrische Epithelzellen Monoschichten (HuGEM). (A) repräsentative Bilder des menschlichen Magen Gewebe und Maus Magen zur Erzeugung von Drüsen für organoide Kultur. Umrissenen Bereich zeigt fundic Region des Magens Maus. (B) Generation von Menschen abgeleitet Magen Organellen (HuFGOs), die für die Kultur der Menschen abgeleitet gastrische Epithelzellen Monoschichten (HuGEMs) verwendet werden. Repräsentatives Bild der HuGEM nach vorne zeigt das verletzte Gebiet. Maßstabsleiste = 500 μm Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Scratch-Wunde Assay. Repräsentative Bilder gesammelt von einem Zeit-Zeitraffer-Experiment mit HuGEM 0, 8, 16 und 24 h nach vorne gewickelt. Maßstabsleiste = 500 μm Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Ausdruck der großen Zelle Linien in HuGEM Kulturen. Immunfluoreszenz-Färbung des HuGEM Kulturen zeigen den Ausdruck (A) E-Cadherin (Ecad, rot), Oberflächen-Schleimhaut Zellen (grüne UEAI) und Kerne (Hoechst, blau), und (B) E-Cadherin (Ecad, rot), Parietalzellen (HK, grün) und Kerne () Hoechst, blau). Separate Kanäle sind in (C) und (D)dargestellt. (E) RT-PCR erfolgte mittels RNA extrahiert aus HuGEMs für den Ausdruck von H+K+-ATPase (ATP4a), Pepsinogen C (PgC), MUC5AC und MUC6. (F) Proliferating Zellen innerhalb der HuGEM Kultur von EdU (rot) Aufnahme bestimmt. Skala bar (A-D) = 50 μm, Skala bar (F) = 100 μm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Änderungen in Zelle Abstammung Ausdruck in der Scratch-Wunde-Assay. Immunfluoreszenz-Färbung des HuGEM Kulturen demonstriert die Expression von E-Cadherin (Ecad, rot) oder Schleimhaut Oberflächenzellen (grüne UEAI) oder Parietalzellen (HK, grün) und Kerne (Hoechst, blau) mit Folien von HuGEM Kulturen 0, 8, 16 und 24 Stunden Post gesammelt Kratzer-Wunde. Grunge = Hintergrundfärbung der Basalmembran Matrix auf Folien. Maßstabsleiste XY-Achse von 0 - 400 μm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Maus 3D Medien | Stammlösung | Arbeiten Konzentration |
| nAcetylcysteine | Pulver | 1 mM |
| Gastrin | 10 ΜM | 10 nM |
| EGF | 500 µg/mL | 50 ng/mL |
| Birne | 100 µg/mL | 100 ng/mL |
| FGF10 | 100 µg/mL | 100 ng/mL |
| YCMD | 10 mM | 10 ΜM |
| B27 | 50 x | 1 x |
| N2 | 100 x | 1 x |
| Pen/Strep | 1 M | 10 mM |
| HEPES | 1 M | 10 mM |
| Glutamax | 200 mM | 2 mM |
| WNT | 50 % V/v | |
| R-Spondin | 10 % V/v |
Tabelle 1: Maus 3D Media-Komponenten.
| Maus 2D Medien | Stammlösung | Arbeiten Konzentration |
| FCS | 100 % | 10 % |
| YCMPD | 10 mM | 10 ΜM |
| Gastrin | 10 ΜM | 10 nM |
| EGF | 500 µg/mL | 50 ng/mL |
| B27 | 50 x | 1 x |
| N2 | 100 x | 1 x |
| Pen/Strep | 1 M | 10 mM |
| HEPES | 1 M | 10 mM |
| Glutamax | 200 mM | 2 mM |
| TGF-β-inhibitor | 10 mM | 1 ΜM |
Tabelle 2: Maus-2D Media-Komponenten.
| Menschlichen 3D-Medien | Stammlösung | Arbeiten Konzentration |
| Nicotinamid | Pulver | 10 mM |
| nAcetylcysteine | Pulver | 1 mM |
| Gastrin | 10 ΜM | 1 nM |
| EGF | 500 µg/mL | 50 ng/mL |
| Birne | 100 µg/mL | 100 ng/mL |
| FGF10 | 100 µg/mL | 200 ng/mL |
| YCMD | 10 mM | 10 ΜM |
| B27 | 50 x | 1 x |
| N2 | 100 x | 1 x |
| Pen/Strep | 1 M | 10 mM |
| HEPES | 1 M | 10 mM |
| Glutamax | 200 mM | 2 mM |
| Kanamycin | 1 M | 10 mM |
| Amphotericin B/Gentamycin | 125 µg/mL | 1 mM |
| WNT | 50 % V/v | |
| R-Spondin | 10 % V/v |
Tabelle 3: Menschlicher 3D Media-Komponenten.
| Menschlichen 2D Medien | Stammlösung | Arbeiten Konzentration |
| FCS | 100 % | 10 % |
| YCMPD | 10 mM | 10 ΜM |
| Gastrin | 10 ΜM | 1 nM |
| EGF | 500 µg/mL | 50 ng/mL |
| B27 | 50 x | 1 x |
| N2 | 100 x | 1 x |
| Pen/Strep | 1 M | 10 mM |
| HEPES | 1 M | 10 mM |
| Glutamax | 200 mM | 2 mM |
| TGF-β-inhibitor | 10 mM | 1 ΜM |
| Nicotinamid | Pulver | 10 mM |
| Kanamycin | 1 M | 10 mM |
Tabelle 4: Menschliche 2D Media-Komponenten.
| Experimentelle Problem | Tipp zur Fehlerbehebung |
| Monolagen Scheitern in Form von Organellen | (1) optimale Kultivierung Bedingungen für dieses Protokoll variieren zwischen experimentellen Bedürfnisse. Mensch und Maus Monolagen abgeleitet von Organellen mit verdünnter Basalmembran Matrix bei Verwendung von Glas oder Kunststoff Kultur Gerichte gezüchtet werden sollten. Jedoch Ratte Schweif Kollagen ist optimal für Monolage Experimente von Maus oder menschlichen Ursprungs, die aus Polyester Membran erfordern fügt. (2) optimale Kultivierung Bedingungen variieren je nach eingestellter experimentelle oben. Kulturen mit einzelnen Zellsuspension sind idealerweise mit 3D FGO Medien kultiviert, während intakte Organellen mit 2D FGO Medien kultiviert werden. |
| Abgeleitet von Monolagen im Alter von Patienten (> 55 Jahre) oder Mäuse (> 18 Monate) nicht wachsen und erreichen die Konfluenz | Wenn im Alter von Mäusen mit Magen Gewebe entnommen werden (> 18 Monate) oder Patienten (> 55 Jahre) sollte die Dichte der Organellen verwendet für die Generation der Monolage verdoppelt werden, angesichts der Tatsache, dass die Effizienz der Wachstum der Organellen verringert wird. |
| Organellen Scheitern in Form von Drüsen | Es wird empfohlen, dass frisch (wenn möglich neu gekauft) Gastrin verwendet werden. Verwenden Sie frisch neu suspendierten Gastrin alle 4 Monate. |
| Organellen nicht befestigen und bilden Monolayer | Stellen Sie sicher, dass effiziente Entfernung von Basalmembran Matrix erzielt wurden, nach der Ernte Organellen für die Übertragung auf Kultur-Platten für Monolagen. |
| Abgeleitet von Kulturen im Alter von Patienten (> 55 Jahre) oder Mäuse (> 18 Monate) scheitern | Während der Verdauung und Inkubation ist 15-30 min der erste Inkubation gefolgt von 5 min Abständen der Inkubation nach Bedarf ausreichend. Es sei darauf hingewiesen, dass Patienten über 55 Jahre alt Drüsen haben können, die leichter dissoziiert und benötigen daher weniger Verdauung. Ebenso haben FGOs abgeleitet von gealterten Patienten langsamer Wachstumszeit und erhöhte Empfindlichkeit zur Zentrifugation angezeigt. Um die besten Ergebnisse zu erhalten, begrenzen Sie jede überschüssige Zentrifugation zu, bei der Arbeit mit Alter Gewebe und ersetzen Sie Medien in einer fristgerechten Weise zu. |
Tabelle 5: Tipps zur Fehlerbehebung. Aufgetretenen Probleme und empfohlenen Lösungen für die optimale Einrichtung und Kultur der Mensch oder Maus Magen Monolagen.
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Discussion
Das aktuelle Protokoll beschreibt die Einrichtung von Mensch und Maus abgeleitet gastrische Epithelzellen Monolagen, die für neu-Wunde Assays verwendet werden können. Das Protokoll hängt das Konzept der ansässigen Stammzellen isoliert von primären Mensch (oder Maus) Gewebe und ist ein modifiziertes Protokoll zuerst veröffentlicht durch Schlaermann Et al.7. Insbesondere haben wir das Protokoll hier so optimiert, dass ein Zusammenfluss etablieren und polarisiert gastrische Epithelzellen Monolage welche drückt der großen Zell-Linien, die im Magen Epithel in Vivozu finden. Magengeschwür-Reparatur ist ein komplexer Prozess, der Gewebe Re Epithelisierung, Regeneration und Verbreitung9,10,11beinhaltet. Vor allem hat unser Labor berichtet, dass die Regeneration der Magen Epithel deckt sich mit dem Aufkommen der spasmolytische Polypeptid/Dreiblatt Faktor (TFF) 2 exprimierenden Metaplasie (SPEM) am Rand innerhalb der regenerierenden gastrischen Drüsen Geschwür 12,13. SPEM Transdifferenzierung der obersten Zelle Linie in eine schleimige Zelle Metaplasie14 bezeichnet, die mit Verletzungen taucht auf und verschwindet, sobald die Schleimhaut wieder ihrer normalen zellulären Zusammensetzung12. Um einen solchen Mechanismus in einem in-vitro- System zu studieren, ist es so wichtig, dass die große Zelle Linien, wie z. B. die Hauptzellen innerhalb der Kultur vorhanden sind.
Die Verwendung von Grund auf neu-Wunde Assays werden ausgiebig seit der Studie von Reparatur und Regeneration, und bis vor kurzem waren Magenkrebs Zelllinien verwendet1,2,3,4. Während Magenkrebs Zelllinien mit grundlegende Mechanismen aufgedeckt wurden, diese Kulturen verwandeln und die zelluläre Vielfalt der einheimischen Magen Gewebe fehlt. HuGEMs werden angezeigt, eine polarisierte und vielfältige zelluläre Zusammensetzung zu behalten, die genau den Magen Epithel in Vivorekapituliert. Darüber hinaus nach erreichen confluency HuGEM Kulturen bis zu einem Monat unter optimalen Bedingungen aufrechterhalten werden können. Erweiterte Kulturen ermöglichen langfristige Experimente. So gehören zukünftige Anwendungen der HuGEMs, die angesehen werden können Co Zellkulturen Monolage/Immunsystem und langfristig Experimente zur Erforschung der Pathogenese der Helicobacter Pylori .
Es gibt wichtige technische Aspekte in das aktuelle Protokoll fest. Die ersten technischen Punkt ist, dass die Wahl der Basalmembran Komponente der Zelloberfläche Kultur abhängig, die für Experimente verwendet werden soll. Um sicherzustellen, dass optimale Monolage Bedingungen erreicht werden, empfiehlt es sich, dass das Kollagen verwendet wird, wenn Experimente mit Monolagen Platten mit Polyester Membran Einsätze erfordern. Allerdings, wenn Monolage Experimente Glas oder Kunststoff Kultur Oberflächen erfordern, verdünnte Basalmembran Matrix ist die optimale Wahl der Beschichtung. Zweitens muss die Dichte der Organellen erforderlich, um eine konfluierende Monolage erreichen je nach Alter des Patienten angepasst werden, der Magen Gewebe entnommen wird. Für Gewebe aus Alter Mäuse gesammelt (> 18 Monate) oder Patienten (> 55 Jahre), die organoide Dichte verwendet sollte erhöhte zweifach bei Übertragung auf einen monomolekularen Film aufgrund der verminderten Wachstum in Personen im Alter von. Während der Verdauung und Inkubation von menschlichem Gewebe abgeleitet von Alter Patienten, Drüsen möglicherweise anfälliger für Dissoziation und Zentrifugation und somit: 1) sollte so sparsam wie möglich, (2) Medien fleißig ersetzt, und (3) während der Verdauung zentrifugiert werden Inkubationen von 15 bis 30 Minuten mit inkrementellen Verdauung von 5 Minuten danach sinkt die Wahrscheinlichkeit, dass über Verdauung. Schließlich ist Monolagen aus Suspensionen organoide abgeleitet Einzelzelle bilden, FGO 3D-Medien optimal für die korrekte Bildung von Monolagen während bei der Kultivierung von intakter Organellen, 2D FGO Medien beobachtet worden ist, um höchste Effizienz zu erzielen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde unterstützt von der NIH (NIDDK) 5 R01 DK083402-07 (YZ) zu gewähren.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced Dulbecco's modified Eagle/F12 medium (basal media) | Life Technologies | 12634-010 | |
| GlutaMAX (L-glutamine) | Life Technologies | 25030-081 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Scientific | SV30010 | |
| Amphotericin B/Gentamicin | Thermo Scientific | R01510 | |
| Kanamycin | Thermo Fisher | RO1510 | |
| HEPES Buffer | Sigma Aldrich | H0887 | |
| n-Acetylcystine | Sigma Aldrich | A9165 | |
| N2 | Life Technologies | 17502-048 | |
| B27 | Life Technologies | 12587-010 | |
| BMP Inhibitor (Noggin) | Pepro Tech | 250-38 | |
| Gastrin | Tocris | 3006 | |
| EGF | Pepro Tech | 315-09 | |
| FGF10 | Pepro Tech | 100-26 | |
| Nicotinamide | Sigma Aldrich | N0636 | |
| Y-27632 ROCK Inhibitor | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| TGF-β Inhibitor | Tocris | 2939 | |
| Ca2+/Mg2+ -free DPBS | Fisher | 21-031CV | |
| Dulbecco's modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 12634-010 | |
| Fetal Bovine Serum | FBS | ||
| OPTIMEM | Invitrogen | ||
| 0.22µM filter | Fisher | 099-720-004 | |
| 37 °C Water Bath | |||
| Collagenase Type 1 | Worthington | LS004214 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9418 | |
| Kimwipes (tissue paper) | Fischer Scientific | 06-666C | |
| 125 mL round bottom flask | |||
| 1 in (25 mm) stir bar | |||
| Rubber Septa | |||
| Sterile Gauze | |||
| Stir Plate | |||
| Ring Stand | |||
| Ring Stand Clamps | |||
| Sterile petri dish | |||
| 18 G needles of 1.5 in length | Thermo Fisher | 305196 | |
| 20 G spinal needles of 3.5 in length | Thermo Fisher | 405182 | |
| 12-well cell culture treated plate | Midwest Scientific | 92012 | |
| Growth Factor Reduced, Phenol Red-free MatrigelTM (Basement membrane matrix) | Fisher | CB-40230C | |
| Sterile Razor Blades | |||
| Wide-tip tweezers | |||
| Curved Hemostatic Forceps | |||
| 200 µL wide pipette tips | Thermo Fisher | 02-707-134 | |
| 5 mL cell culture test tubes | Fisher | 14-956-3C | |
| Oxygen Tank with rubber hosing | |||
| 1 g D-Sorbitol | |||
| Sucrose | Fisher | SS-500 | |
| Dissecting microscope | |||
| Dissecting Tray | |||
| Rocking Table | |||
| Rat Tail Collagen Type 1 | Life Technologies | A10483-01 | |
| Cell culture grade glacial acetic acid | Fisher | A38-212 | |
| Cell culture grade water | Corning | 25-055-CV | |
| 2-well chamber slide | Thermo Fisher | 155380 | |
| 12-well Transwell (polyester membrane inserts) | Corning | 3460 | |
| Cell scraper | Corning | 353086 | |
| Accutase (cell detachment solution) | Stemcell Technologies | 7920 | |
| 263/8 G syringe | Thermo Fisher | 309625 | |
| Razor blade | |||
| L Cells | L cells, a Wnt3a producing cell line, were received as a gift from Dr. Hans Clevers (Hubrecht Institute for Developmental Biology and Stem Cell Research, Netherlands). | N/A | |
| HEK-293T Rspondin secreting cells | A modified HEK-293T R-spondin secreting cell line was obtained from Dr. Jeff Whitsett (Section of Neonatology, Perinatal and Pulmonary Biology, Cincinnati Children's Hospital Medical Centre and The University of Cincinnati College of Medicine, Cincinnati, USA ). | N/A | |
| HK-ATPase Primary Antibody | Invitrogen | SC-374094 | |
| E-Cadherinn | SantaCruz | sc-59778 | |
| UEA1 | Sigma Aldrich | L9006 | |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher | H3570 | |
| Alexafluor 488 secondary antibody (Donkey anti-mouse 488 secondary antibody) | ThermoFisher Scientific | R37114 |
References
- Nagy, T. A., et al. Helicobacter pylori regulates cellular migration and apoptosis by activation of phosphatidylinositol 3-kinase signaling. J Infect Dis. 199 (5), 641-651 (2009).
- Mnich, E., et al. Impact of Helicobacter pylori on the healing process of the gastric barrier. World J Gastroenterol. 22 (33), 7536-7558 (2016).
- Zhang, Y., et al. Bm-TFF2, a toad trefoil factor, promotes cell migration, survival and wound healing. Biochem Biophys Res Commun. 398 (3), 559-564 (2010).
- Crabtree, J. Role of cytokines in pathogenesis of Helicobacter pylori-induced mucosal damage. Dig Dis Sci. 43 (Supplement), 46S-53S (1998).
- Riahi, R., Yang, Y., Zhang, D. D., Wong, P. K. Advances in wound-healing assays for probing collective cell migration. J Lab Autom. 17 (1), 59-65 (2012).
- Zhang, M., Li, H., Ma, H., Qin, J. A simple microfluidic strategy for cell migration assay in an in vitro wound-healing model. Wound Repair Regen. 21 (6), 897-903 (2013).
- Schlaermann, P., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. 65 (2), 202-213 (2016).
- Bertaux-Skeirik, N., et al. CD44 plays a functional role in Helicobacter pylori-induced epithelial cell proliferation. PLoS Pathog. 11 (2), e1004663 (2015).
- Tarnawski, A. S. Cellular and molecular mechanisms of gastrointestinal ulcer healing. Dig Dis Sci. 50 (Suppl 1), S24-S33 (2005).
- Wright, N. A., Pike, C., Elia, G. Induction of a novel epidermal growth factor-secreting cell lineage by mucosal ulceration in human gastrointestinal stem cells. Nature. 343, 82-85 (1990).
- Wright, C. L., Riddell, R. H. Histology of the stomach and duodenum in Crohn's disease. Am J Surg Pathol. 22 (4), 383-390 (1998).
- Engevik, A. C., et al. The Development of Spasmolytic Polypeptide/TFF2-Expressing Metaplasia (SPEM) During Gastric Repair Is Absent in the Aged Stomach. CMGH. , In Press (2016).
- Bertaux-Skeirik, N., et al. CD44 variant isoform 9 emerges in response to injury and contributes to the regeneration of the gastric epithelium. Journal of Pathology. 242 (4), 463-475 (2017).
- Nam, K. T., et al. Mature chief cells are cryptic progenitors for metaplasia in the stomach. Gastroenterology. 139 (6), 2028-2037 (2010).
