Summary
Здесь мы описываем протокол для создания и культивирования человека и мыши, полученных 3-мерной organoids желудка (3D) и метод для передачи 3D organoids 2-мерной монослоя. Использование желудочного эпителиальных монослоя как Роман пробирного скретч раны для регенерации исследования также описал.
Abstract
В vitro исследования желудка рану ремонта обычно предполагает использование линий клеток рака желудка в скретч раны assay пролиферации и миграции. Одно из критических ограничений таких анализов, однако, является их однородной ассортимент клеточных типов. Ремонт — сложный процесс, который требует взаимодействия нескольких типов клеток. Таким образом для изучения культуры лишены клеточных подтипы, является опасение, что необходимо преодолеть, если мы хотим понять процесс восстановления. Желудка органоид модель может облегчить эту проблему, которой разнородной коллекции типов клеток тесно отражает эпителии желудка или другой родной тканей в естественных условиях. Продемонстрировали здесь-это роман, в пробирке скретч раны пробирного производным от человека или мыши 3-мерной organoids, которые затем могут быть переданы желудка эпителиальных монослоя, как либо нетронутыми organoids или одну ячейку перерыва в отрыве organoids. Цель Протокола заключается в создании производных органоид желудка эпителиальных монослои которые могут использоваться в системе Роман скретч раны пробирного для изучения желудка регенерации.
Introduction
Использование скретч раны анализов является популярным методом для изучения ремонта и регенерации1,2,3,4,5,6. Предлагаемая методология может использоваться специально изучать желудка регенерации и колонизации Helicobacter pylori . В прошлом линии клеток рака желудка были использованы как средство для изучения инфекции Helicobacter pylori (H. пилорусов)1,2 и до недавно желудка рак клеточных линий, таких как AGS клетки были благоприятствования1 ,2,3,4. Одним из ограничений культур клеток рака желудка является их неспособность пилки сотовой разнообразие желудка эпителия. Чтобы попытаться решить это ограничение, продемонстрировали здесь является создание и передачи первичных человека и мыши производных 3-мерной fundic желудка organoids (FGOs) для желудка эпителиальных монослоя для исцеления анализов раны сначала на основе модифицированного метода характеризуется Schlaermann и др. 7 мы продемонстрировали, что желудка эпителиальных монослои, производный от сдвиговых 3D желудочного FGOs или FGO-производные отдельные клетки сохраняют поляризованные клеточный состав, который тесно представляет что желудка эпителия в vivo. Учитывая, что линии клеток рака желудка не демонстрируют клеточный состав, который отображает эту технику, текущий протокол имеет преимущество над альтернативных скретч раны пробирного методы. Эта методология была оптимизирована, whereby монослои может быть установленным от всей organoids или одну ячейку подвеска от диссоциированных organoids и покрытием с помощью базальной мембраны матрицы или коллагена покрытием. Общая цель настоящего Протокола заключается в установить органоид производными желудка эпителиальных монослоя культур для исцеления assay Роман рану.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Чтобы избежать заражения, выполните протокол в полном объеме в стерильных культуры ткани капюшоном. Fundic тканей человека была собрана из пациентов, перенесших рукав гастрэктомии согласно утвержденным Университета Цинциннати IRB протокол (номер протокола IRB: 2015-4869).
Все мыши исследования были утверждены Университета Цинциннати институционального ухода за животными и использования Комитет (IACUC), поддерживает учреждение американской ассоциации оценки и аккредитации лабораторных исследований на животных (AAALAC).
1. Создание 3D желудочного Fundic Organoids человека производные
Примечание: Этот протокол основан на исследования, ранее опубликованные в данном практическом занятии8.
- Подготовка 3D органоид СМИ, которая состоит из 50% Wnt кондиционерами и 20% R-spondin кондиционером СМИ.
- Подготовить Wnt кондиционером СМИ, культура клетки L Wnt роста среднего (Дульбекко модифицированная Eagle среднего (DMEM), 10% плода бычьим сывороточным (ФБС), 1% пенициллина/стрептомицина) на 7 дней, средний урожай и фильтр с помощью фильтра 0.22 мкм.
- Подготовьте R-spondin кондиционером СМИ. Расти модифицированной ГЭС 293T Р-spondin секреции клеток линии в R-spondin рост среднего (Дульбекко модифицированная Eagle среднего (DMEM), 10% плода бычьим сывороточным (ФБС), 1% пенициллина/стрептомицина). После вложения через 2 ч, изменить носитель из этих клеток к OPTIMEM росту средних, 1% пенициллина/стрептомицина. Культура клетки для 7 дней. Затем урожай R-spondin кондиционером СМИ и фильтр с помощью фильтра 0.22 мкм.
Примечание: Этот протокол был опубликован ранее и для более подробного протокола обратитесь к 6,,78.
- Оттепель матрицы снижение, свободного фенола Красного базальной мембраны фактор роста для 16 h на льду при 4 ° C. Собирать ткани в ледяной Ca2 +/Mg2 +-бесплатная DBPS в большой пластиковый контейнер. Хранить на льду до начала шага 1.4.
Примечание: Ткани собирается из пациентов, перенесших рукавная резекция желудка. - С помощью щипцов, стирать ткани энергично в стерильных стакан, содержащие 100 мл Ca2 +/Mg2 +-бесплатно Дульбекко фосфат буфер солевой (DPBS). Стирка для примерно 30 s или до тех пор, пока мусор и кровь была удалена. Далее используя стерильную марлю, вытереть слизистая слой эпителия.
- Используя большие щипцы, твердо понять слой мышечной ткани и с силой, отчищать эпителия, используя большие изогнутые гемостатический пинцет. Соберите царапины эпителиальных фрагментов в чашку Петри стерильные, полистирола.
- Фарш эпителиальной ткани в приблизительно 2.0 x 2,0 мм2 размера фрагментов с помощью бритвы для оптимизации ткани пищеварение. Стирать фрагменты тканей с Ca2 +/Mg2 + -бесплатно DBPS дополнена антибиотиков (Ca2 +/Mg2 + -бесплатная DPBS, 1% пенициллина/стрептомицина, 0,25 мг/мл амфотерицин B 10 мг/мл гентамицин, канамицин 50 мг/мл), пока не мыть свободна от крови. Если необходимо выполните многократной стирке. Отказаться от покинуть мыть, внимательно фильтрации мыть через стерильную марлю в отходов стакан.
- Собирать промывают фрагменты в 125 мл стакан вокруг нижней колбе с 25 мм перемешать бар и подогретым инкубации СМИ (базальный СМИ с 2 мм L-глютамином, 1% пенициллина/стрептомицина, 10 мм HEPES буфера, 1 мг/мл коллагеназы типа 1, 2 мг/мл клеточной культуры класс бычий сывороточный альбумин). Уплотнением круглым дном колбу с резиновыми перегородками.
- Вставьте септы спинальной иглы 20 G и подключить его к кислородного бака с резиновых шлангов. Чтобы отфильтровать любых загрязнений, вставьте трубки для создания фильтра папиросной бумаги. Включите отток кислорода на низком уровне. Вставьте просушивать во избежание разрыва септы отток иглы 10-15.
- Безопасный набор до кольца стенд с помощью зажимов и поместите его в водяной бане, калиброванные до 37 ° C с плитой перемешать для 30-45 мин. После того, как ткани инкубации 15 мин, удалите 50 мкл инкубации СМИ и проверить визуально диссоциированных желез. Если железы не являются плотными или не отделены от ткани, оставьте еще 5-10 мин.
- Сразу же после инкубации, добавить 50 мл предварительно нагретой среде DMEM/F12 для инкубации СМИ с помощью стерильных Серологические Пипетки или наливая прямо в смесь инкубации.
- Фильтр железы смесь через стерильную марлю в четыре 50 мл конические трубы. Держите фильтрата на льду за 15 минут позволить извлеченные желез поселиться в нижней части Конические трубки. Будьте осторожны, чтобы не нарушить поселились желез, снимите и выбросьте офф-топ 40 мл супернатанта используя Серологические Пипетки. Ресуспензируйте оставшиеся 10 мл, 10 мл DPBS, дополнены с помощью антибиотиков.
- Равномерно распределите смесь в 5 мл пробирок клетки культуры. Центрифуга для 5 мин на 65 x g при 4 ° C и удалить супернатант тщательно с помощью пипетки. Ресуспензируйте железы Пелле в талой базальной мембраны матрицы с помощью пипетки или кончик широкий пипеткой 200 мкл. Смешайте до однородной.
Примечание: Важно, чтобы выполнить этот шаг на льду и избежание полимеризации базальной мембраны матрицы во время смешивания. Кроме того важно, чтобы визуально проверить плотность железы методом выборки для 50 мкл. Оптимальная плотность составляет ~ 70% confluency. - Затем пластина желез в 50 мкл базальной мембраны матрицы с помощью пипетки широкий наконечником. Избегайте любой пузырей во время покрытия.
- Чтобы разрешить базальной мембраны матрицы для полимеризации, Инкубируйте на 10-15 мин при температуре 37 ° C. Если покрытие в пластине 12-ну культуры, добавьте 1 mL hFGO СМИ (Advanced Дульбекко модифицированных Eagle среднего/F12 среднего дополнена 2 мм L-глютамин, 1% пенициллина/стрептомицина, 0,25 мг/мл амфотерицин B 10 мг/мл гентамицин, 50 мг/мл канамицин, 10 мм HEPES Буфер, 1 мм n-Acteylcystine, 1 x N2, 1 x B27, кондиционером Wnt средний 50%, 20% R-spondin кондиционером средний дополнена 100 нг/мл костный морфогенетический белок ингибитор, 1 Нм гастрина, 50 нг/мл эпидермального фактора роста, фактор роста фибробластов 200 нг/мл в 10, 10 Мм никотинамид и 10 мкм Y-27632 рок ингибитор) за хорошо. Если не с помощью культуры 12-ну тарелку добавить достаточно СМИ погружаться пузырь матрица базальной мембраны.
- Культура клетки при 37 ° C в инкубатор культуры 5% CO2 увлажненные клеток. Изменить СМИ каждые 4-5 дней.
2. Создание 3D желудочного Fundic Organoids мыши производные
Примечание: Этот протокол был ранее опубликованной 6. Оттепель базальной мембраны матрицы на льду и подготовить все реагенты до начала.
- Пожертвуйте мышей, с помощью метода утвержденных научно-исследовательское учреждение, где проводятся исследования. Удаление желудка от мыши и вскрыть согласно ранее опубликованные протоколы 6. Мыть в 20 мл лед холодной Ca2 +/Mg2 +-свободный DBPS.
Примечание: Мышей C57BL/6, в возрасте 8-10 недель, используются для fundic желудка органоид культур. Мышей были умерщвлены при вдыхании двуокиси углерода, следуют ручной шейки матки дислокации до удаления желудка. - Полосы мышцы слой из желудка и любые видимые сосуды как ранее опубликована 6.
- Отделите глазного дна от антрального и немутогенных, используя стерильные лезвия бритвы. Вырежьте дно, используя малые хирургические ножницы на фрагменты приблизительно 2.0 x 2.0 мм. Использование щипцы, собирать фрагменты в 15 мл Конические трубки, содержащие ЭДТА инкубации буфера (Ca2 +/Mg2 +-бесплатная DPBS, 5 мм ЭДТА) и Инкубируйте на 4 ° C на 2 ч с Нежный агитации.
- В стерильные капот оставить Конические трубки и фрагменты на льду для приблизительно 5 минут использовать пипетки удалить столько инкубации буфера как можно скорее, оставляя нетронутыми фрагментов. Добавьте 5 мл, пожимая буфера (1 g D-сорбит, 1.47 г сахарозы в 100 мл Ca2 +/Mg2 +-бесплатная DPBS) и Встряхните руками с силой 2 мин позволить большие фрагменты урегулировать и с поспешностью, с помощью пипетки 1000 p, удалить мелкие фрагменты, которые предстоит решить в верхнем слое.
- Спиновые удаленные фрагменты для 5 мин при температуре 4 ° C на 65 x g.
- Избегая пузырьки воздуха, удалить супернатант, Ресуспензируйте в матрице базальной мембраны и перемешать до однородной.
- Используйте широкий наконечник пипетки для пластины базальной мембраны матрицы в 50 мкл на колодец и затем инкубации при 37 ° C в течение 20 мин.
- Добавить медиа роста достаточно mFGO (Advanced Дульбекко изменение среднего среднего/F12 орла с 2 мм L-глютамин, 1% пенициллина/стрептомицина, 10 мм HEPES буфера, 1 мм n-Acteylcystine, 1 x N2, 1 x B27, кондиционером Wnt средний 50%, 20% R-spondin кондиционером Средний дополняется 100 нг/мл костный морфогенетический белок ингибитор, 10 Нм гастрина, 50ng/мл эпидермального фактора роста, фактор роста фибробластов 10 нг/мл 10 и 10 мкм Y-27632 рок ингибитор) погружаться пузырь.
- Культура клетки при 37 ° C, 5% CO2 увлажненные клетки культуры инкубатора. Измените СМИ каждые 4-5 дней.
3. коллаген покрытие для 2D передачи
Примечание: Выполните все процедуры в стерильных культуры ткани капот, если не указано иное. Начните коллагена, покрытие 24 h перед передачей 3D organoids монослоя. Держите коллаген хвост крысы на льду и защищены от света. Коллаген покрытием плиты хороши для до 2 недель. Если не сразу же с помощью пластины с покрытием, оберните пластины в парафина и хранить при 4 ° C до тех пор, пока требуется.
- Разбавьте коллаген хвост крысы до 50 мкг/мл, с использованием уксусной кислоты 20 мм.
- Достаточно покрывают поверхность хорошо с разбавленным коллагена. Для одной скважины в стандартной пластине 12-ну пальто с приблизительно в 1 мл раствора коллагена. Оставьте на ночь при комнатной температуре в стерильных Худ.
- Мыть дважды с 1 мл Ca2 +/Mg2 +-бесплатная DPBS в колодец и оставить открытые втечение 2 ч при комнатной температуре в стерильных Худ.
4. базальной мембраны покрытие матрицы для 2D передачи
Примечание: Выполните все процедуры в стерильных культуры ткани капот, если не указано иное. Начните матрица базальной мембраны, покрытие 2 ч перед передачей 3D organoids монослоя. Держите базальной мембраны матрицы на льду. Пластины с покрытием должны использоваться сразу же и не может храниться в течение длительного периода времени.
- Разбавить базальной мембраны матрицы в 15 мл Конические трубки с водой класса культуры клеток в 1:10 соотношение. Развести на льду.
- С помощью пипетки добавить 100 мкл разбавленного базальной мембраны матрицы в каждой скважине стандартной плиты 12-хорошо. Используя ячейки скребок, равномерно распределять разреженных базальной мембраны матрицы во всем и даже пальто.
- Инкубируйте при 37 ° C в течение 1 ч.
- Удалите остатки воды с помощью пипетки и сушат при комнатной температуре в течение 1 ч перед передачей 3D organoids.
5. Передача 3D м/hFGOs 2D желудка эпителиальных клеток монослои
- После 3D мыши - или человека производные FGOs были культивировали для 6-7 дней, начать передачу 3D organoids 2D монослоя.
Примечание: Для каждой скважины монослоя требуется рекомендуется использовать 300 нетронутыми organoids или одной клетки, полученные из 300 organoids. В культуре, надежные ожидается получить приблизительно 150 органоид/хорошо в течение 12 хорошо культуры тарелку. - Убедитесь, что пластины покрыты перед передачей.
Примечание: Базальной мембраны матрица покрытием плиты имеют слой полупрозрачный гель, однако, коллаген покрытием пластин не будет иметь каких-либо очевидных признаков покрытия. - Выбить пузырь матрица 3D базальной мембраны от плиты, непосредственно закупорить 1 мл стерильного Ca2 +/Mg2 +-бесплатная DBPS на центр пузырь.
- С помощью пипетки, соберите базальной мембраны матрицы и органоид смесь в ячейку культуры пробирки. Соберите в соотношении 2 базальной мембраны матрица пузырьков в трубку. Центрифуги для 5 мин при 40 x g и 4 ° C.
- С помощью вакуумной системы, удалить супернатант и как много базальной мембраны матрица как можно скорее. Ресуспензируйте в 4 мл Ca2 +/Mg2 +-свободный DBPS, удалить супернатант и повторять 2 - 3 раза. Для протокола передачи всей органоид переходите к шагу 5.10. Перейдите к шагу 5.7 для протокола подвески одной ячейки.
- Предварительно теплой мобильный отряд решение до 37 ° C и добавить 1 мл в каждую пробирку. Аккуратно перемешать инвертирование трубы или закупорить вверх и вниз с пипеткой. Инкубировать в течение 10 минут при 37 ° C.
- Добавить 2 мл Ca2 +/Mg2 +-бесплатная DBPS непосредственно в каждую пробирку.
- Используйте 26 G иглы и шприца смеси 2 - 3 раза. Визуально проверьте для одиночных клеток. Шприц 1-2 раза, если есть еще organoids или кластеры клеток.
- Центрифуга на 40 x g 5 мин при 4 ° C. Ресуспензируйте гранулы в 2D FGO СМИ (2D мыши FGO роста средних: Advanced Дульбекко модифицированных Eagle среднего/F12 среднего дополнена 2 мм L-глютамином, 10 пенициллина/стрептомицина, 10% плода телячьей сыворотки, 10 мм HEPES буфера, 1 x N2, 1 x B27, дополнены 10 Нм гастрина, 50 нг/мл эпидермального фактора роста, 1 ингибитор TGF-β мкм и 10 мкм Y-27632 рок ингибитора. 2D человека среднего роста FGO: Расширенные Дульбекко модифицированных Eagle среднего/F12 среднего дополнена 2 мм L-глютамин, 1% пенициллина/стрептомицина, 10 мм HEPES буфера, 10% плода телячьей сыворотки, 10 мм никотинамид, 1 x N2, 1 x B27, дополнена 50 мг/мл канамицин, 50 нг/мл эпидермального роста Фактор и ингибитор Y-27632 рок 10 мкм, 1 мкм TGF-β ингибитора).
- Пластина ресуспендирования на пластины с покрытием. Инкубировать пластин при 37 ° C. Замените СМИ каждые 4 дней или менее если СМИ желтеет. Однослойная требует около 4 дней в форме.
6. поцарапать Assay раны с помощью 2D желудка эпителиальных клеток монослои
- С помощью лезвия бритвы, поцарапайте монослоя, когда культура достигла 100% confluency.
- Исправьте монослои, используя 3,7% формальдегида для 15 мин при комнатной температуре. Разрушения с 0,5% неионные моющего средства/PBS для 20 мин при комнатной температуре.
- Следующий блок монослои сывороткой 2% осла за 1 ч при комнатной температуре и проинкубируйте с разведении 1: 1000 H+, K+-АТФазы основное антитело на ночь при 4 ° C, мыть с 0.1% неионные моющего средства/PBS и инкубировать с 1: 100 разрежения осла Вторичное антитело против мыши 488 и 10μg/мл Hoechst клеточных ядер пятно на 1 ч при комнатной температуре.
- Чтобы определить поверхности слизистой яму клетки в 2D человека производные желудка монослоя культур, пятно клетки с 20 мкг/мл по конъюгата FITC Утёсник европейский (UEAI). Монослои изображения на конфокального микроскопа.
- Возьмите изображения рану каждые несколько часов нуля будет повторно epithelialize между 24-48 ч в зависимости от качества монослоя и вариации между пациентами.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Organoids были получены от корпус/тело человека или глазного дна желудка тканей мыши (рис. 1A). Соответственно, после ЭДТА пищеварения человека или мыши, полученных ткани желудка или коллагеназы железы внедренные в матрицу базальной мембраны и культивировали для 6-7 дней (рис. 1A). Рисунок 1B демонстрирует формирование человека производные желудка organoids (huFGOs), затем были переданы желудка эпителиальных монослоя (huGEM) на слайдах с покрытием матрицы камеры базальной мембраны. После 4 дней культуры вырожденная huGEMs были использованы для нуля рану анализов (рис. 1B). Изображений собраны из анализа промежуток времени huGEM, показал закрытия ран в рамках культуры в течение 24 часов (рис. 2).
HuGEMs были найдены выразить линий крупных клеток найдены в родной желудка ткани. Пятнать иммунофлюоресценции показали выражение поляризованные монослоя Кадгерины позитивных E, которая состояла из париетальных (рис. 3B, C) и на поверхности слизистой оболочки (рис. 3B, D) клетки. ПЦР анализ с использованием РНК, собранные из этих монослои подтвердила выражение теменной и поверхности слизистой оболочки клеток, помимо главного и слизистые оболочки шеи клетки (Рисунок 3E). Вырожденная huGEMs также выразил несколько пролиферирующих клеток (Рисунок 3F). Анализ этих крупных клеток линий в assay скретч рану показал устойчивый выражение теменной, главный, слизистые шеи поверхности слизистой оболочки клеток за 24-часовой период времени (рис. 4A, B). Вместе эти данные демонстрируют использование huGEMs как Роман культуры системы для изучения желудка регенерации в пробирке.
Рисунок 1: поколение человека производные желудка organoids (huFGO) и основной желудочный эпителиальных монослои (huGEM). (A) представитель изображения человеческого желудка желудок ткани и мышь используется для создания желез органоид культуры. Изложил области показывает fundic региона мыши желудка. (B) формирование человека производные желудка organoids (huFGOs), которые используются для культуры человека производные желудка эпителиальных монослои (huGEMs). Представитель изображение huGEM после нуля показаны области раненых. Шкалы бар = 500 мкм пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: скретч раны пробирного. Представитель изображений собраны от эксперимента промежуток времени с помощью huGEM 0, 8, 16 и 24 ч после нуля раны. Шкалы бар = 500 мкм пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: выражение основных клеток линий в культурах huGEM. Иммунофлюоресценции окрашивания культур huGEM, демонстрируя выражение (A) E Кадгерины (Ecad, красный), поверхности слизистой клетки (UEAI, зеленый) и ядра (Hoechst, синий) и (B) E Кадгерины (Ecad, красный), париетальных клеток (HK, зеленый) и ядра () Hoechst, синий). Отдельные каналы будут отсортированы в (C) и (D). (E) ПЦР-была выполнена с использованием РНК, извлеченные из huGEMs для выражения H+K+-АТФазы (ATP4a), пепсиногена C (PgC), MUC5AC и MUC6. (F) Proliferating клеток в культуре huGEM, определяется поглощение Эду (красный). Масштаб бар (A-D) = 50 мкм, шкалы бар (F) = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: изменения в выражении линии клеток в assay скретч раны. Иммунофлюоресценции окрашивания культур huGEM, демонстрируя выражение E Кадгерины (Ecad, красный) или поверхности слизистой клетки (UEAI, зеленый) или париетальных клеток (HK, зеленый) и ядра (Hoechst, синий) с использованием слайдов, собранные из huGEM культур, 0, 8, 16 и 24 часов поста скретч раны. Bkgrd = фон окраски матрицы базальной мембраны на слайдах. XY-оси линейки шкалы от 0 - 400 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Мышь 3D СМИ | Стоковый раствор | Рабочая концентрация |
| nAcetylcysteine | Порошок | 1 мм |
| Гастрин | 10 МКМ | 10 Нм |
| EGF | 500 мкг/мл | 50 нг/мл |
| Башка | 100 мкг/мл | 100 нг/мл |
| FGF10 | 100 мкг/мл | 100 нг/мл |
| YCMD | 10 мм | 10 МКМ |
| B27 | 50 x | 1 x |
| N2 | 100 x | 1 x |
| Ручка/стрептококк | 2. | 10 мм |
| HEPES | 2. | 10 мм |
| Glutamax | 200 мм | 2 мм |
| WNT | 50% v/v | |
| R-Spondin | 10% v/v |
Таблица 1: Мышь 3D СМИ компонентов.
| Мышь 2D СМИ | Стоковый раствор | Рабочая концентрация |
| FCS | 100% | 10% |
| YCMPD | 10 мм | 10 МКМ |
| Гастрин | 10 МКМ | 10 Нм |
| EGF | 500 мкг/мл | 50 нг/мл |
| B27 | 50 x | 1 x |
| N2 | 100 x | 1 x |
| Ручка/стрептококк | 1 M | 10 мм |
| HEPES | 1 M | 10 мм |
| Glutamax | 200 мм | 2 мм |
| TGF-β ингибитор | 10 мм | 1 МКМ |
Таблица 2: Мышь 2D СМИ компонентов.
| Человека 3D СМИ | Стоковый раствор | Рабочая концентрация |
| Никотинамид | Порошок | 10 мм |
| nAcetylcysteine | Порошок | 1 мм |
| Гастрин | 10 МКМ | 1 Нм |
| EGF | 500 мкг/мл | 50 нг/мл |
| Башка | 100 мкг/мл | 100 нг/мл |
| FGF10 | 100 мкг/мл | 200 нг/мл |
| YCMD | 10 мм | 10 МКМ |
| B27 | 50 x | 1 x |
| N2 | 100 x | 1 x |
| Ручка/стрептококк | 2. | 10 мм |
| HEPES | 2. | 10 мм |
| Glutamax | 200 мм | 2 мм |
| Канамицин | 2. | 10 мм |
| Амфотерицин B/гентамицин | 125 мкг/мл | 1 мм |
| WNT | 50% v/v | |
| R-Spondin | 10% v/v |
Таблица 3: Человека 3D СМИ компонентов.
| Человека 2D СМИ | Стоковый раствор | Рабочая концентрация |
| FCS | 100% | 10% |
| YCMPD | 10 мм | 10 МКМ |
| Гастрин | 10 МКМ | 1 Нм |
| EGF | 500 мкг/мл | 50 нг/мл |
| B27 | 50 x | 1 x |
| N2 | 100 x | 1 x |
| Ручка/стрептококк | 1 M | 10 мм |
| HEPES | 1 M | 10 мм |
| Glutamax | 200 мм | 2 мм |
| TGF-β ингибитор | 10 мм | 1 МКМ |
| Никотинамид | Порошок | 10 мм |
| Канамицин | 1 M | 10 мм |
Таблица 4: Человека 2D СМИ компонентов.
| Экспериментальные проблема | Совет по устранению неполадок |
| Монослои не формы от organoids | 1) оптимальные условия культивирования для этого протокола варьируются между экспериментальной потребности. Человека и мыши монослои, производный от organoids следует культивируемых с использованием матрицы разреженных базальной мембраны при использовании стекла или пластика культуры блюда. Однако крысы хвост Коллаген является оптимальным для экспериментов монослоя мыши или вставляет человеческого происхождения, которые требуют полиэстер мембраны. 2) оптимальные условия культивирования зависимости экспериментальный набор вверх. Культур, используя одну ячейку подвеска идеально культивированный с 3D FGO СМИ тогда как нетронутыми organoids культивируемых с 2D FGO СМИ. |
| Монослои, производный от старческого возраста (> 55 лет) или мышей (> 18 месяцев) удалось расти и достигнет confluency | Если с помощью ткани желудка собранные от возрасте мышей (> 18 месяцев) или больных (> 55 лет) плотность organoids используется для генерации монослое следует удвоить, учитывая, что рост эффективности organoids уменьшается. |
| Organoids не формы из желез | Рекомендуется, что свежие (если возможно недавно приобрели) использоваться гастрина. Используйте свежую вновь приостановлено гастрина каждые 4 месяца. |
| Organoids не прикрепить и формируют монослои | Убедитесь, что эффективное удаление базальной мембраны матрицы был достигнут после сбора урожая organoids для передачи культуры пластины для монослои. |
| Культур, полученных от больных пожилого возраста (> 55 лет) или мышей (> 18 месяцев) сбой | Периоды пищеварение и инкубации 15-30 мин первоначальных инкубации, следуют с интервалом 5 минут инкубации при необходимости достаточно. Следует отметить, что пациенты более чем 55 лет могут иметь желез, которые являются более легко отделить и поэтому требуют меньше пищеварение. Аналогично FGOs, производного от возраста пациентов проявили медленнее время роста и повышенная чувствительность к центрифугирования. Чтобы получить наилучшие результаты, ограничить любой избыток центрифугированием при работе с возрасте ткани и заменить средства массовой информации своевременно. |
Таблица 5: советы по устранению неполадок. Возникающие проблемы и Рекомендуемые разрешения для создания оптимального и культуры человека или желудка монослои мыши.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Текущий протокол подробности создания человека и мыши, полученных желудка эпителиальных монослои которые могут использоваться для анализов скретч раны. Протокол зависит от концепции резидентов стволовых клеток тканей изоляции от первичного человека (или мыши) и измененный Протокол впервые публикуется Schlaermann et al7. В частности мы оптимизированный протокол здесь создать притока и поляризованных желудка эпителиальных монослоя, которое выражается основных мобильных линий, которые могут быть найдены внутри желудка эпителия в естественных условиях. Язва желудка ремонт-это сложный процесс, который включает в себя ткани эпителизация, регенерации и распространения9,10,11. В частности наша лаборатория сообщила, что регенерация эпителия желудка совпадает с появлением спазмолитическое полипептид/трилистник фактор (TFF) 2-выражая метаплазия (SPEM) на язвы разницы в пределах восстанавливающий желудочных желез 12,13. SPEM определяется как transdifferentiation линии главного клеток в метаплазия слизистой клетки14 , что выходит с травмой и исчезает, когда слизистая оболочка возвращается к своей нормальной клеточный состав12. Таким образом для изучения такого механизма в системе в пробирке , важно, что крупные ячейки линий, таких как главный клетки, присутствуют в рамках культуры.
Использования скретч раны анализы широко использовались для изучения ремонта и регенерации, и до недавнего времени линии клеток рака желудка были используемые1,2,3,4. В то время как основные механизмы были выявлены с помощью линий клетки рака желудка, эти культуры преобразуются и отсутствие сотовой разнообразие ткани собственного желудка. Показано, что HuGEMs сохранить поляризованные и разнообразных клеточный состав, который тесно резюмирует желудка эпителия в естественных условиях. Кроме того после достижения confluency huGEM, которые культур может быть сохранен на срок до одного месяца в оптимальных условиях. Расширенные культур позволяют долгосрочных экспериментов. Таким образом будущие приложения huGEMs, которые могут считаться включают монослоя/иммунной клетки совместно культур и долгосрочных экспериментов для изучения патогенеза Helicobacter pylori .
Существуют важные технические аспекты отметить в протоколе текущей. Первая техническая точка является, что выбор компонента базальной мембраны варьируется в зависимости от поверхности культуры клеток, которая должна использоваться для экспериментов. Для достижения оптимального монослоя условий, рекомендуется что коллаген используется, когда эксперименты с монослои требуют пластины со вставками полиэстер мембраны. Однако если монослоя эксперименты требуют стеклянных или пластиковых культуры поверхностей, разбавленным базальной мембраны матрица является оптимальный выбор покрытия. Во-вторых плотность organoids, необходимых для достижения вырожденная монослоя должны быть скорректированы в зависимости от возраста пациента, из которых собирается желудка ткани. Для тканей, собранных от возрасте мышей (> 18 месяцев) или больных (> 55 лет), плотность органоид используется должно быть увеличение вдвое при передаче монослоя за снижение роста потенциала в возрасте людей. Во время пищеварения и инкубации человеческой ткани, производный от возраста пациентов, желез могут быть более восприимчивы к диссоциации и центрифугирования и таким образом: 1) должны быть центрифугировали как экономно, как возможно, 2) средства массовой информации заменил старательно и 3) во время пищеварения инкубаций 15-30 минут с добавочной пищеварения 5 минут после этого уменьшится вероятность над пищеварение. Наконец при формировании монослои от органоид производные одного клеточных суспензий, 3D FGO СМИ наиболее оптимальным для правильного формирования монослои, тогда как при культивировании с нетронутыми organoids, 2D FGO СМИ наблюдается приносить высокую эффективность.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана на низ (NIDDK) 5 R01 DK083402-07 Грант (YZ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced Dulbecco's modified Eagle/F12 medium (basal media) | Life Technologies | 12634-010 | |
| GlutaMAX (L-glutamine) | Life Technologies | 25030-081 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Scientific | SV30010 | |
| Amphotericin B/Gentamicin | Thermo Scientific | R01510 | |
| Kanamycin | Thermo Fisher | RO1510 | |
| HEPES Buffer | Sigma Aldrich | H0887 | |
| n-Acetylcystine | Sigma Aldrich | A9165 | |
| N2 | Life Technologies | 17502-048 | |
| B27 | Life Technologies | 12587-010 | |
| BMP Inhibitor (Noggin) | Pepro Tech | 250-38 | |
| Gastrin | Tocris | 3006 | |
| EGF | Pepro Tech | 315-09 | |
| FGF10 | Pepro Tech | 100-26 | |
| Nicotinamide | Sigma Aldrich | N0636 | |
| Y-27632 ROCK Inhibitor | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| TGF-β Inhibitor | Tocris | 2939 | |
| Ca2+/Mg2+ -free DPBS | Fisher | 21-031CV | |
| Dulbecco's modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 12634-010 | |
| Fetal Bovine Serum | FBS | ||
| OPTIMEM | Invitrogen | ||
| 0.22µM filter | Fisher | 099-720-004 | |
| 37 °C Water Bath | |||
| Collagenase Type 1 | Worthington | LS004214 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9418 | |
| Kimwipes (tissue paper) | Fischer Scientific | 06-666C | |
| 125 mL round bottom flask | |||
| 1 in (25 mm) stir bar | |||
| Rubber Septa | |||
| Sterile Gauze | |||
| Stir Plate | |||
| Ring Stand | |||
| Ring Stand Clamps | |||
| Sterile petri dish | |||
| 18 G needles of 1.5 in length | Thermo Fisher | 305196 | |
| 20 G spinal needles of 3.5 in length | Thermo Fisher | 405182 | |
| 12-well cell culture treated plate | Midwest Scientific | 92012 | |
| Growth Factor Reduced, Phenol Red-free MatrigelTM (Basement membrane matrix) | Fisher | CB-40230C | |
| Sterile Razor Blades | |||
| Wide-tip tweezers | |||
| Curved Hemostatic Forceps | |||
| 200 µL wide pipette tips | Thermo Fisher | 02-707-134 | |
| 5 mL cell culture test tubes | Fisher | 14-956-3C | |
| Oxygen Tank with rubber hosing | |||
| 1 g D-Sorbitol | |||
| Sucrose | Fisher | SS-500 | |
| Dissecting microscope | |||
| Dissecting Tray | |||
| Rocking Table | |||
| Rat Tail Collagen Type 1 | Life Technologies | A10483-01 | |
| Cell culture grade glacial acetic acid | Fisher | A38-212 | |
| Cell culture grade water | Corning | 25-055-CV | |
| 2-well chamber slide | Thermo Fisher | 155380 | |
| 12-well Transwell (polyester membrane inserts) | Corning | 3460 | |
| Cell scraper | Corning | 353086 | |
| Accutase (cell detachment solution) | Stemcell Technologies | 7920 | |
| 263/8 G syringe | Thermo Fisher | 309625 | |
| Razor blade | |||
| L Cells | L cells, a Wnt3a producing cell line, were received as a gift from Dr. Hans Clevers (Hubrecht Institute for Developmental Biology and Stem Cell Research, Netherlands). | N/A | |
| HEK-293T Rspondin secreting cells | A modified HEK-293T R-spondin secreting cell line was obtained from Dr. Jeff Whitsett (Section of Neonatology, Perinatal and Pulmonary Biology, Cincinnati Children's Hospital Medical Centre and The University of Cincinnati College of Medicine, Cincinnati, USA ). | N/A | |
| HK-ATPase Primary Antibody | Invitrogen | SC-374094 | |
| E-Cadherinn | SantaCruz | sc-59778 | |
| UEA1 | Sigma Aldrich | L9006 | |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher | H3570 | |
| Alexafluor 488 secondary antibody (Donkey anti-mouse 488 secondary antibody) | ThermoFisher Scientific | R37114 |
References
- Nagy, T. A., et al. Helicobacter pylori regulates cellular migration and apoptosis by activation of phosphatidylinositol 3-kinase signaling. J Infect Dis. 199 (5), 641-651 (2009).
- Mnich, E., et al. Impact of Helicobacter pylori on the healing process of the gastric barrier. World J Gastroenterol. 22 (33), 7536-7558 (2016).
- Zhang, Y., et al. Bm-TFF2, a toad trefoil factor, promotes cell migration, survival and wound healing. Biochem Biophys Res Commun. 398 (3), 559-564 (2010).
- Crabtree, J. Role of cytokines in pathogenesis of Helicobacter pylori-induced mucosal damage. Dig Dis Sci. 43 (Supplement), 46S-53S (1998).
- Riahi, R., Yang, Y., Zhang, D. D., Wong, P. K. Advances in wound-healing assays for probing collective cell migration. J Lab Autom. 17 (1), 59-65 (2012).
- Zhang, M., Li, H., Ma, H., Qin, J. A simple microfluidic strategy for cell migration assay in an in vitro wound-healing model. Wound Repair Regen. 21 (6), 897-903 (2013).
- Schlaermann, P., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. 65 (2), 202-213 (2016).
- Bertaux-Skeirik, N., et al. CD44 plays a functional role in Helicobacter pylori-induced epithelial cell proliferation. PLoS Pathog. 11 (2), e1004663 (2015).
- Tarnawski, A. S. Cellular and molecular mechanisms of gastrointestinal ulcer healing. Dig Dis Sci. 50 (Suppl 1), S24-S33 (2005).
- Wright, N. A., Pike, C., Elia, G. Induction of a novel epidermal growth factor-secreting cell lineage by mucosal ulceration in human gastrointestinal stem cells. Nature. 343, 82-85 (1990).
- Wright, C. L., Riddell, R. H. Histology of the stomach and duodenum in Crohn's disease. Am J Surg Pathol. 22 (4), 383-390 (1998).
- Engevik, A. C., et al. The Development of Spasmolytic Polypeptide/TFF2-Expressing Metaplasia (SPEM) During Gastric Repair Is Absent in the Aged Stomach. CMGH. , In Press (2016).
- Bertaux-Skeirik, N., et al. CD44 variant isoform 9 emerges in response to injury and contributes to the regeneration of the gastric epithelium. Journal of Pathology. 242 (4), 463-475 (2017).
- Nam, K. T., et al. Mature chief cells are cryptic progenitors for metaplasia in the stomach. Gastroenterology. 139 (6), 2028-2037 (2010).
