Summary
Aquí se describe un protocolo para el establecimiento y cultivo derivado de humano y ratón 3 dimensiones (3D) gástrico organoides y el método para la transferencia de organoides 3D a una monocapa de 2 dimensiones. También se describe el uso de la monocapa epitelial gástrica como un análisis nuevo de cero-herida para estudios de regeneración.
Abstract
Estudios in vitro de reparación de herida gástrica implica típicamente el uso de líneas celulares de cáncer gástrico en un ensayo de scratch-herida de proliferación celular y migración. Una limitación crítica de tales ensayos, sin embargo, es su surtido homogéneo de tipos celulares. La reparación es un proceso complejo que exige la interacción de varios tipos celulares. Por lo tanto estudiar una cultura desprovista de subtipos celulares, es una preocupación que debe superarse si queremos entender el proceso de reparación. El modelo de organoide gástrico puede aliviar este problema por el que la colección heterogénea de tipos de la célula refleja cerca del epitelio gástrico u otros tejidos nativos en vivo. Demostrado aquí es una novela en vitro arañazo herida ensayo derivado de humanos o ratón organitas 3-dimensional que luego pueden ser transferidos a una monocapa epitelial gástrica sea organitas intacta o como una suspensión unicelular de disociaron organoides. El objetivo del protocolo es establecer organoides derivados gástricas epiteliales monocapas que pueden utilizarse en un sistema de análisis de nuevo heridas de rasguño para el estudio de regeneración gástrica.
Introduction
El uso de scratch-herida ensayos es un método popular para el estudio de regeneración y reparación1,2,3,4,5,6. La metodología propuesta puede ser utilizada para estudiar específicamente gástrica regeneración y colonización de Helicobacter pylori . En el pasado, líneas celulares de cáncer gástrico se han utilizado como un medio para el estudio de la infección de Helicobacter pylori (H. pylori)1,2 y hasta cáncer gástrico recientemente líneas celulares como las células AGS eran favorecidos1 ,2,3,4. Una limitación de las culturas de célula de cáncer gástrico es su fracaso para recapitular la diversidad celular del epitelio gástrico. Para intentar abordar esta limitación, demostrado que aquí es la creación y transferencia de primario derivado del humano y del ratón 3-dimensional fúndica gástrica organoides (FGOs) a una monocapa epitelial gástrica para los ensayos de curación herida basado en un método modificado de primero descrito por Schlaermann et al. 7 demostrar que monocapas epiteliales gástricas derivadas de esquilan 3D FGOs gástricos o FGO-derivó las células mantienen una composición celular polarizada que representa cerca del epitelio gástrico en vivo. Dado que las líneas celulares de cáncer gástrico no demostró la composición de la célula que muestra esta técnica, el protocolo actual tiene la ventaja sobre métodos alternativos de scratch-herida. Esta metodología ha sido optimizada por el monocapas pueden ser establecido de organoides todo o de una suspensión unicelular de organoides disociado y plateado usando una matriz de la membrana basal o capa de colágeno. El objetivo general del presente Protocolo es establecer que un organoide derivados cultivos monocapa epitelial gástrico para un ensayo de novela herida curativa.
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Protocol
Para evitar la contaminación, realizar el protocolo en su totalidad dentro de una campana de cultivo estériles para tejidos. Tejido humano fundic recogió de pacientes sometidos a gastrectomía en manga según el protocolo aprobado del CRI de la Universidad de Cincinnati (número de protocolo de la IRB: 2015-4869).
Todos los estudios del ratón fueron aprobados por el cuidado Animal institucional de la Universidad de Cincinnati y el Comité uso (IACUC) que mantiene un centro de Asociación Americana de evaluación y acreditación de laboratorio Animal Care (AAALAC).
1. establecer derivados de humanos 3D gástrica fúndica organitas
Nota: Este protocolo se basa en investigaciones publicadas previamente en este laboratorio8.
- Preparar medios de organoide 3D que consiste en medios de comunicación R-spondin acondicionado acondicionado Wnt y 20% de 50%.
- Preparar medios de Wnt acondicionado, cultura L células en un medio de Wnt (Dulbecco de modificado Eagle Medium (DMEM), 10% suero bovino fetal (FBS), 1% penicilina/estreptomicina) durante 7 días, el medio de la cosecha y filtrar con un filtro de 0,22 μm.
- Preparar medios de R-spondin acondicionado. Crecer una línea modificada de HEK-293T R-spondin secretoras células en un medio de R-spondin (Dulbecco de modificado Eagle Medium (DMEM), 10% suero bovino fetal (FBS), 1% penicilina/estreptomicina). En archivo adjunto después de 2 h, cambiar el medio de estas células a crecimiento OPTIMEM mediano, 1% penicilina/estreptomicina. Las células de cultivo durante 7 días. Luego cosechar los medios R-spondin acondicionado y filtrar con un filtro de 0,22 μm.
Nota: Este protocolo ha sido publicado previamente y un protocolo más detallado consulte a 6,7,8.
- Descongelar la matriz de la membrana basal reducida, sin rojo de fenol de factor de crecimiento para 16 h sobre el hielo a 4 º C. Recoger el tejido en el hielo frío Ca2 +/Mg2 +-libre de SPD en un recipiente grande de plástico. Almacenar en el hielo hasta el paso del principio 1.4.
Nota: El tejido se obtiene de pacientes sometidos a gastrectomía en manga. - Con unas pinzas, lave el tejido con fuerza en un recipiente estéril que contiene 100 mL Ca2 +/Mg2 +-libre fosfato tampón salino (DPBS) de Dulbecco. Lavado por aproximadamente 30 s o hasta que los escombros y la sangre se ha eliminado. A continuación, usando gasas estériles, limpie la capa mucosa del epitelio.
- Firmemente con unas pinzas grandes, sujete la capa del músculo del tejido y con fuerza, raspe el epitelio mediante las pinzas hemostáticas curvas grandes. Recoger los fragmentos epiteliales de raspado en una placa Petri estéril, poliestireno.
- Pique el tejido epitelial en unos fragmentos de2 tamaño de 2.0 x 2.0 mm con Maquinillas de afeitar para optimizar la digestión de tejido. Lavar los fragmentos de tejido con Ca2 +/Mg2 + -gratis SPD suplementado con antibióticos (Ca2 +/Mg2 + -libre DPBS, 1% de penicilina/estreptomicina, 0,25 mg/mL de anfotericina B 10 mg/mL de gentamicina, kanamicina de 50 mg/mL), hasta que el lavado está libre de la sangre. Realizar varios lavados si es necesario. Descarte de lavado cuidadosamente filtra el lavado a través de una gasa estéril en un vaso de residuos.
- Lavado recoge fragmentos en un vaso de 125 mL redondo matraz de fondo con una barra de agitación de 25 mm y media de incubación precalentado (basals medios suplementados con 2 mM L-glutamina, 1% penicilina/estreptomicina 10 mM HEPES Buffer, 1 mg/mL de colagenasa tipo 1, cultivo de células de 2 mg/mL grado de albúmina de suero bovino). El matraz de fondo redondo con tabiques de goma del sello.
- Inserte una aguja espinal 20 G en los septos y conectar a un tanque de oxígeno con manguera de goma. Para filtrar los contaminantes, inserte papel en el tubo para crear un filtro. Activar la salida de oxígeno baja. Insertar las agujas de salida de 10-15 en los tabiques para evitar la ruptura de tabiques.
- Asegure el conjunto hasta a un soporte de anillo con pinzas y colocarlo en un baño María calibrado a 37 ° C con una placa de agitación durante 30-45 minutos. Después de que el tejido ha sido incubando durante 15 min, retirar 50 μl de los medios de incubación y Revise visualmente las glándulas disociadas. Si las glándulas no son densas, o no se han separado del tejido, dejar para un 5-10 minutos adicionales.
- Inmediatamente después de la incubación, añadir 50 mL precalentado DMEM/F12 al medio de incubación con una pipeta serológica estéril o vertiendo directamente en la mezcla de incubación.
- Filtrar la mezcla de la glándula a través de una gasa estéril en cuatro tubos cónicos de 50 mL. Guardar el filtrado en el hielo durante 15 min permitir glándulas extraídas para instalarse en la parte inferior del tubo cónico. Tenga cuidado de no perturbar las glándulas colocadas, retire y deseche la tapa 40 mL del sobrenadante con una pipeta serológica. Resuspender lo restantes 10 mL en 10 mL de DPBS suplementado con antibióticos.
- Distribuya la mezcla en tubos de ensayo 5 mL de la célula cultura. Centrifugar durante 5 min a 65 x g a 4 ° C y eliminar el sobrenadante cuidadosamente con una pipeta. Resuspender el precipitado de la glándula en matriz de descongelada la membrana del sótano con una pipeta o una punta ancha de la pipeta de 200 μl. Mezclar hasta homogénea.
Nota: Es fundamental para realizar este paso en el hielo y para evitar la polimerización de la matriz de la membrana basal durante la mezcla. Además, es importante inspeccionar visualmente la densidad de la glándula por el muestreo de 50 μl. La densidad óptima es confluencia de ~ 70%. - A continuación, la placa de las glándulas en 50 μl de la matriz de la membrana del sótano con una pipeta con punta ancha. Evitar la producción de burbujas mientras chapado.
- Para permitir que la matriz de la membrana del sótano polimerizar, incube durante 10-15 min a 37 ° C. Si chapado en una placa de cultivo de 12 bien, añadir 1 mL de hFGO media (medio de medio/F12 de avanzada Dulbecco modificado Eagle suplementado con 2mM L-glutamina, 1% de penicilina/estreptomicina, 0,25 mg/mL de anfotericina B 10 mg/mL gentamicina, 50 mg/mL de kanamicina, 10 mM HEPES Buffer, n-Acteylcystine de 1 mM, 1 x 1 x B27, medio de Wnt-condicionada del 50%, 20% R-spondin-acondicionado suplementado con 100 ng/mL de N2, hueso inhibidor de la proteína morfogenética 1 gastrin nM, 50 ng/mL de Factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento fibroblástico de 200 ng/mL 10 10 mM nicotinamida e inhibidor de Y-27632 ROCK de 10 μm) por pozo. Si no usando una placa de cultivo de 12 pozos Añada suficiente medios para sumergir la burbuja de la matriz de la membrana del sótano.
- Cultura de las células a 37 ° C en un incubador de cultura 5% CO2 célula humidificado. Cambiar los medios de comunicación cada 4-5 días.
2. establecer derivadas de ratón 3D gástrica fúndica organitas
Nota: Este protocolo ha sido previamente publicado 6. Matriz de la membrana del sótano en el hielo de descongelar y preparar todos los reactivos antes de comenzar.
- Sacrificio de ratones utilizando un método aprobado por la institución de investigación donde se realiza la investigación. Quite el estómago de ratón y disecar según los protocolos previamente publicados 6. Lavado en 20 mL hielo frío Ca2 +/Mg2 +-libre de SPD.
Nota: Ratones C57BL/6, de 8 a 10 semanas, se utilizan para las culturas organoide gástrica fúndica. Ratones fueron sacrificados por la inhalación de dióxido de carbono seguido de la dislocación cervical manual antes del retiro de estómago. - Tira de la capa muscular del estómago y cualquier visibles los vasos sanguíneos anteriormente publicado 6.
- Separar el fondo del antro y forestomach utilizando una hoja de afeitar estéril. Fondo cortado con tijeras quirúrgicas pequeñas en fragmentos de aproximadamente 2.0 x 2.0 mm. Usando pinzas, recoger los fragmentos en un tubo cónico de 15 mL con tampón de incubación del EDTA (Ca2 +/Mg2 +-libre DPBS, 5 mM EDTA) e incube a 4 ° C por 2 h con agitación suave.
- En una campana estéril, dejar el tubo cónico y fragmentos de hielo durante aproximadamente 5 minutos utilizan una pipeta para quitar tanta tampón de incubación posible tocar fragmentos. Añadir 5 mL agitación buffer (1 g D-Sorbitol, sacarosa 1,47 g en 100 mL Ca2 +/Mg2 +-libre DPBS) y agitar con la mano con una fuerza de 2 minutos deje que los fragmentos grandes y con prisa, con una pipeta de 1000 p, quitar los pequeños fragmentos que aún tienen que resolver en la capa superior.
- Giran los fragmentos eliminados por 5 min a 4 ° C a 65 x g.
- Evitando las burbujas de aire, eliminar el sobrenadante, resuspender en la matriz de la membrana del sótano y mezclar hasta que quede homogéneo.
- Utilice una pipeta de Punta ancha para la matriz de la membrana del sótano en 50 μL por pocillo de la placa y luego incubar a 37 ° C durante 20 minutos.
- Añadir suficiente medios de crecimiento mFGO (Advanced Dulbecco modificado Eagle medio/F12 suplementado con 2mM L-glutamina, 1% de penicilina/estreptomicina, 10 mM HEPES Buffer, n-Acteylcystine de 1mM, 1 x N2, 1 x B27, medio Wnt-condicionada del 50%, 20% R-spondin-condicionada suplementado con inhibidor de la proteína morfogenética de la hueso de 100 ng/mL, gastrina nM 10, 50ng/mL Factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento de fibroblasto 10 de 10 ng/mL e inhibidor de Y-27632 ROCK de 10 μm) para sumergir la burbuja.
- Las células a 37 ° C, 5% CO2 célula humidificado cultura la incubadora de la cultura. Cambiar el medio cada 4-5 días.
3. colágeno capa de transferencia 2D
Nota: Realice todos los procedimientos en una campana de cultivo estériles para tejidos a menos que se especifique lo contrario. Comenzar el colágeno capa 24 h antes de transferir organitas 3D para la monocapa. Mantener el colágeno de la cola de rata en el hielo y protegidos de la luz. Placas de colágeno recubierta son buenas para hasta 2 semanas. Si no se usa inmediatamente las placas cubiertas, envolver la placa en parafilm y almacenar a 4 ° C hasta que se necesite.
- Diluir el colágeno de la cola de rata a 50 μg/mL con 20 mM acético ácido.
- Suficiente cubrir la superficie del pozo con colágeno diluido. Para un pozo de una placa estándar de 12 bien, cubrir con aproximadamente 1 mL de colágeno. Dejar durante la noche a temperatura ambiente en una capucha estéril.
- Lave dos veces con 1 mL Ca2 +/Mg2 +-libre DPBS por pozo y deja al descubierto por 2 h a temperatura ambiente en una capucha estéril.
4. membrana basal capa de matriz para la transferencia de 2D
Nota: Realice todos los procedimientos en una campana de cultivo estériles para tejidos a menos que se especifique lo contrario. Comenzar a matriz de la membrana basal capa 2 h antes de transferir organitas 3D para la monocapa. Mantener la matriz de la membrana del sótano en el hielo. Placas cubiertas deben utilizarse inmediatamente y no se puede almacenar por un período prolongado de tiempo.
- Diluir la matriz de la membrana del sótano en un tubo cónico de 15 mL con agua grado cultivo celular en un 1:10 cociente. Diluir en el hielo.
- Con una pipeta agregar 100 μl de la matriz de la membrana del sótano diluido en cada pocillo de una placa de 12 pozos estándar. Con un raspador celular, distribuir bien la matriz diluido la membrana basal en el pozo de una capa uniforme.
- Incubar a 37 ° C durante 1 h.
- Eliminar el agua residual con una pipeta y secar a temperatura ambiente durante 1 h antes de transferir 3D organitas.
5. transferencia de m/hFGOs 3D a 2D monocapas de células epiteliales gástricas
- Después de 3D ratón o humano-derivados de FGOs han sido cultivados durante 6-7 días, comienza la transferencia de organoides 3D a la 2D monocapa.
Nota: Para cada pocillo de una monocapa requerida se recomienda utilizar 300 organitas intactos o células derivadas de 300 organitas. En una cultura sólida se espera obtener aproximadamente 150 organoide/bien dentro de una placa de cultivo bien 12. - Asegúrese de que las placas están recubiertas antes de transferir.
Nota: Las placas de matriz recubierta de membrana del sótano tienen una capa de gel transparente, sin embargo, las placas de colágeno recubierta no tendrá ninguna indicación evidente de la capa. - Desplazar la burbuja de matriz 3D la membrana del sótano de la placa mediante Pipeteo directamente 1 mL estéril Ca2 +/Mg2 +-libre de SPD en el centro de la burbuja.
- Usando una pipeta, recoger la mezcla de matriz y organoides de la membrana del sótano en tubos de ensayo de la cultura de célula. Recoger en una proporción de 2 burbujas de matriz de la membrana del sótano por el tubo. Centrifugar durante 5 min a 40 x g a 4 ° C.
- Utilizando un sistema de vacío, eliminar el sobrenadante y como mucho matriz de la membrana del sótano como sea posible. Resuspender en 4 mL de Ca2 +/Mg2 +-libre de SPD, eliminar el sobrenadante y repetir 2 - 3 veces. Para el protocolo de transferencia de todo organoide, proceda al paso 5.10. Continúe con el paso de 5.7 para el protocolo de suspensión unicelular.
- Precalentar la solución de la separación de células a 37 ° C y añadir 1 mL a cada tubo de ensayo. Mezcle suavemente invirtiendo los tubos o arriba y abajo el pipeteo con una pipeta. Incubar 10 min a 37 ° C.
- Añadir 2 mL de Ca2 +/Mg2 +-gratis SPD directamente a cada tubo de ensayo.
- Utilice una aguja de 26 G y jeringa de la mezcla de 2 - 3 veces. Verificar visualmente las células. La jeringuilla de 1-2 veces más si todavía hay organoides o racimos de células.
- Centrifugar a 40 x g durante 5 min a 4 ° C. Resuspender el precipitado en medios FGO 2D (medio ratón 2D FGO: medio de medio/F12 de avanzada Dulbecco modificado Eagle suplementado con 2mM L-glutamina, 10 mM penicilina/estreptomicina, 10% Suero Fetal del becerro, 10 mM HEPES Buffer, 1 x N2, 1 x B27, complementado con gastrina nM 10, 50 ng/mL de Factor de crecimiento epidérmico, inhibidor de TGF-β de 1 μm y 10 inhibidor de roca de Y-27632 μm. Medio de crecimiento de FGO humano 2D: Medio de medio/F12 avanzada de Dulbecco modificado Eagle suplementado con 2mM L-glutamina, 1% de penicilina/estreptomicina, 10 mM HEPES Buffer, 10% Suero Fetal del becerro, 10 mM nicotinamida, 1 x N2, 1 x B27, suplementado con 50 mg/mL de kanamicina, 50 ng/mL crecimiento epidérmico Factor y el inhibidor de Y-27632 ROCK de 10 μm 1 μm TGF-β inhibidor).
- Placa de la resuspensión en placas cubiertas. Incube las placas a 37 ° C. Sustituir los medios de comunicación cada 4 días o antes si los medios de comunicación se vuelve amarillo. Monocapa requiere aproximadamente 4 días a la forma.
6. Análisis de la herida con monocapas de células epiteliales gástricas 2D del rasguño
- Usando una cuchilla de afeitar, raspar la monocapa cuando el cultivo haya alcanzado 100% de confluencia.
- Fijar capas monomoleculares con 3,7% de formaldehído durante 15 min a temperatura ambiente. Permeabilizar con 0.5% de detergente no iónico/PBS por 20 min a temperatura ambiente.
- Siguiente bloque de monocapas con suero de burro 2% durante 1 h a temperatura ambiente e incubar con dilución 1: 1000 de H+, K+-anticuerpo primario ATPasa durante la noche a 4 º C, lavar con 0,1% detergente no-iónico/PBS e incubar con dilución 1: 100 de burro anticuerpo secundario de anti-ratón 488 y 10μg/mL de núcleos de célula del Hoechst manchan por 1 h a temperatura ambiente.
- Para identificar las células de la superficie mucosa hoyo en cultivos monocapa gástrico derivados humanos 2D, se tiñen las células con 20 μg/ml de conjugado FITC de Ulex europaeus (UEAI). Monocapas de imagen en un microscopio confocal.
- Tomar imágenes de la herida cada pocas h. cero será volver a epithelialize entre 24-48 h dependiendo de la calidad de la monocapa y la variación entre pacientes.
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Representative Results
Organoides se derivaron del corpus/cuerpo del ser humano o del fondo de los tejidos del estómago del ratón (figura 1A). Después de colagenasa o digestión de EDTA de tejido del estómago derivados humanos o ratón respectivamente, las glándulas son embebidas en matriz de la membrana del sótano y cultivadas durante 6-7 días (figura 1A). Figura 1B se muestra la formación de derivados humanos gástrico organoides (huFGOs) que han sido transferidos a una monocapa epitelial gástrica (huGEM) en diapositivas de cámara matriz recubierta de membrana basal. Después de 4 días de la cultura, huGEMs confluentes fueron utilizados para los ensayos de rayado de la herida (figura 1B). Imágenes recogieron de un análisis del lapso de tiempo de la huGEM demostrada el cierre de la herida dentro de la cultura durante un período de 24 horas (figura 2).
HuGEMs se encontraron expresar los linajes principales de la célula encontrado en el tejido del estómago nativo. La coloración de la inmunofluorescencia reveló la expresión de una monocapa de cadherin-positiva E polarizada que consistió en el parietal (figura 3B, C) y la superficie mucosa (figura 3B, D) las células. Análisis de la polimerización en cadena usando RNA obtenido Estas monocapas confirmó la expresión de células mucosas superficiales y parietales, además de las células principales y mucosas del cuello (figura 3E). HuGEMs confluente también expresó algunas células proliferantes (figura 3F). Análisis de estos linajes de células principales en el ensayo de rayado herida revelaron la expresión sostenida de las células mucosas superficiales parietales, principales, mucosas del cuello sobre 24 horas período de tiempo (Figura 4A, B). Colectivamente, estos datos demuestran el uso de huGEMs como sistema de cultivo nuevo regeneración gástrico en vitro.
Figura 1: generación de derivados humanos gástrico organoides (huFGO) y monocapas epiteliales gástricas primarias (huGEM). (A) imágenes representativas del estómago de ratón y tejido gástrico humano utilizan para generar las glándulas para la cultura de organoide. Área indica la región fúndica del estómago del ratón. (B) generación de derivados humanos gástrico organoides (huFGOs) que se utilizan para el cultivo de monocapas epiteliales gástricos derivados de humanos (huGEMs). Imagen representativa de huGEM después de scratch que muestra el área herido. Barra de escala = 500 μm haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: ensayo de Scratch-herida. Imágenes representativas recogieron de un experimento de lapso de tiempo con huGEM 0, 8, 16 y 24 h después de cero de la herida. Barra de escala = 500 μm haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: expresión de linajes de células principales de las culturas huGEM. Tinción de inmunofluorescencia de las culturas huGEM que demuestra la expresión de cadherina (A) E (Ecad, rojo), superficie de células mucosas (UEAI, verde) y núcleos (Hoechst, azul) y (B) E caderina (Ecad, rojo), las células parietales (HK, verde) y núcleos () Hoechst, azul). Canales separados se muestran en (C) y (D). (E) RT-PCR se realizó mediante ARN extraído de huGEMs para la expresión de H+K+-ATPasa (ATP4a), pepsinógeno C (PgC), MUC5AC y MUC6. (F) proliferación células dentro de la cultura de huGEM determinado por la absorción de EdU (rojo). Escala (A-D) de la barra = 50 μm, escala de la barra (F) = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: cambios en la expresión de linaje celular en el ensayo de herida cero. Tinción de inmunofluorescencia de las culturas huGEM que demuestra la expresión de cadherina (Ecad, rojo) o células mucosas superficiales (UEAI, verde) o las células parietales (HK, verde) y núcleos (Hoechst, azul) usando las diapositivas de huGEM culturas 0, 8, 16 y 24 horas post Scratch-herida. Bkgrd = tinción de fondo de la matriz de la membrana del sótano en las diapositivas. Barra de escala de eje XY de 0 - 400 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Ratón 3D Media | Solución madre de | Concentración de trabajo |
| nAcetylcysteine | Polvo | 1 mM |
| Gastrina | 10 ΜM | 10 nM |
| FG % | 500 μg/mL | 50 ng/mL |
| Noggin | 100 μg/mL | 100 ng/mL |
| FGF10 | 100 μg/mL | 100 ng/mL |
| YCMD | 10 mM | 10 ΜM |
| B27 | x 50 | 1 x |
| N2 | x 100 | 1 x |
| Pluma/Strep | 1 M | 10 mM |
| HEPES | 1 M | 10 mM |
| Glutamax | 200 mM | 2 mM |
| WNT | 50% v/v | |
| R-Spondin | 10% v/v |
Tabla 1: Componentes de Media 3D de ratón.
| Mouse multimedia 2D | Solución madre de | Concentración de trabajo |
| FCS | 100% | 10% |
| YCMPD | 10 mM | 10 ΜM |
| Gastrina | 10 ΜM | 10 nM |
| FG % | 500 μg/mL | 50 ng/mL |
| B27 | x 50 | 1 x |
| N2 | x 100 | 1 x |
| Pluma/Strep | 1 M | 10 mM |
| HEPES | 1 M | 10 mM |
| Glutamax | 200 mM | 2 mM |
| Inhibidor del TGF-β | 10 mM | 1 ΜM |
Tabla 2: Componentes de medios 2D de ratón.
| Human Media 3D | Solución madre de | Concentración de trabajo |
| Nicotinamida | Polvo | 10 mM |
| nAcetylcysteine | Polvo | 1 mM |
| Gastrina | 10 ΜM | 1 nM |
| EGF | 500 μg/mL | 50 ng/mL |
| Noggin | 100 μg/mL | 100 ng/mL |
| FGF10 | 100 μg/mL | 200 ng/mL |
| YCMD | 10 mM | 10 ΜM |
| B27 | x 50 | 1 x |
| N2 | x 100 | 1 x |
| Pluma/Strep | 1 M | 10 mM |
| HEPES | 1 M | 10 mM |
| Glutamax | 200 mM | 2 mM |
| Kanamicina | 1 M | 10 mM |
| Anfotericina B/gentamicina | 125 μg/mL | 1 mM |
| WNT | 50% v/v | |
| R-Spondin | 10% v/v |
Tabla 3: Componentes de Human Media 3D.
| Human Media 2D | Solución madre de | Concentración de trabajo |
| FCS | 100% | 10% |
| YCMPD | 10 mM | 10 ΜM |
| Gastrina | 10 ΜM | 1 nM |
| EGF | 500 μg/mL | 50 ng/mL |
| B27 | x 50 | 1 x |
| N2 | x 100 | 1 x |
| Pluma/Strep | 1 M | 10 mM |
| HEPES | 1 M | 10 mM |
| Glutamax | 200 mM | 2 mM |
| Inhibidor del TGF-β | 10 mM | 1 ΜM |
| Nicotinamida | Polvo | 10 mM |
| Kanamicina | 1 M | 10 mM |
Tabla 4: Componentes de humanos medios 2D.
| Problema experimental | Solución de problemas de punta |
| Monocapas no forma de organoides | 1) óptimas condiciones de cultivo para este protocolo varían entre necesidades experimentales. Humano y se deben cultivar utilizando matriz de la membrana del sótano diluido cuando se utiliza vidrio o plástico cultura platos monocapas de ratón derivadas de organoides. Sin embargo, colágeno de cola de rata es óptimo para los experimentos de monocapa de ratón o inserciones de origen humano que requieren de membrana de poliéster. 2) óptimas condiciones de cultivo varían dependiendo del sistema experimental para arriba. Culturas mediante suspensión unicelular idealmente se cultivan con los medios de comunicación FGO 3D mientras que intacto organitas son cultivadas con medios FGO 2D. |
| Derivado de las monocapas de edad pacientes (> 55 años) o los ratones (> 18 meses) no ha podido crecer y llegar a la confluencia | Si utilizando tejido del estómago obtenidos de ratones envejecidos (> 18 meses) o en pacientes (> 55 años) la densidad de organoides que se utiliza para la generación de la monocapa debe doblarse ya que se disminuye la eficiencia de crecimiento de los organoides. |
| Organoides no forma de las glándulas | Se recomienda que fresco (recién comprado si es posible) utilizar gastrina. Uso de gastrina recién suspende de nuevo cada 4 meses. |
| Organoides no conectar y formar monocapas | Asegúrese de que eficiente remoción de la matriz de la membrana basal se ha logrado después de la cosecha de organoides para la transferencia a placas para monocapas. |
| Cultivos derivados de pacientes de edad (> 55 años) o los ratones (> 18 meses) fallan | Durante los períodos de incubación y digestión, 15-30 min de incubación inicial seguido por intervalos de 5 min de incubación según sea necesario es suficiente. Cabe señalar que los pacientes mayores de 55 años de edad pueden tener glándulas que son más fácilmente disociadas y por lo tanto requieren menos digestión. Del mismo modo, FGOs derivados de pacientes envejecidos han mostrado tiempo de crecimiento más lento y mayor sensibilidad a centrifugación. Para obtener los mejores resultados, limite cualquier centrifugación excesiva cuando se trabaja con tejido envejecido y reemplazar los medios de comunicación en tiempo y forma. |
Tabla 5: consejos para resolver problemas. Encontró problemas y resoluciones recomendadas para el óptimo establecimiento y cultivo de humanos o monocapas gástrico de ratón.
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Discussion
El actual protocolo de detalles de la creación de derivados de humanos y de ratón gástricas epiteliales monocapas que se puede utilizar para los ensayos de cero-herida. El protocolo depende el concepto de células madre residentes tejidos de aislamiento de humanos primarios (o ratón) y es un protocolo modificado publicado por primera vez por Schlaermann et al7. En particular, hemos optimizado el protocolo aquí para establecer un confluente y polarizado monocapa epitelial gástrica que expresa los principales linajes que pueden encontrarse en el epitelio gástrico en vivode la célula. Reparación de la úlcera gástrica es un proceso complejo que involucra tejido re-epithelialization, regeneración y proliferación9,10,11. En particular, nuestro laboratorio ha informado de que la regeneración del epitelio gástrico coincide con la aparición de polipéptido purgativo/trébol factor (TFF) 2-expresando la metaplasia (SPEM) en el margen de la úlcera dentro de las glándulas gástricas regeneración 12,13. SPEM se define como el transdifferentiation del linaje principal de la célula en una célula mucosa metaplasia14 que emerge con lesión y desaparece cuando la mucosa vuelve a su composición celular normal12. Así, para estudiar este mecanismo en un sistema in vitro , es esencial que los linajes principales de la célula, como las células principales, están presentes dentro de la cultura.
El uso de scratch-herida ensayos se han utilizado para el estudio de la reparación y regeneración, y hasta hace poco, las líneas celulares de cáncer gástrico fueron usadas1,2,3,4. Mientras que los mecanismos fundamentales se han revelado con líneas de células de cáncer gástrico, estas culturas se transforman y carecen de la diversidad celular del tejido del estómago nativo. HuGEMs demostrados que retener una polarizado y diversa composición celular que recapitula cerca el epitelio gástrico en vivo. Además, tras llegar a confluency huGEM culturas se pueden mantener durante un mes en óptimas condiciones. Las culturas extendidas permiten experimentos de largo plazo. Así, futuras aplicaciones de la huGEMs que pueden considerarse incluyen co-cultivos de células de inmune monocapa y experimentos a largo plazo para el estudio de la patogenia de los píloros de Helicobacter .
Hay importantes aspectos técnicos en el protocolo actual. El primer punto técnico es que la elección de los componentes de la membrana basal varía en función de la superficie de cultivo celular que debe ser utilizado para los experimentos. Para asegurar que se alcanzan las condiciones óptimas de monocapa, se recomienda que el colágeno se utiliza cuando requieren de experimentos con monocapas de placas con insertos de membrana de poliéster. Sin embargo, si experimentos monocapa requieren vidrio o superficies de plástico de la cultura, matriz de la membrana del sótano diluido es la opción óptima de la capa. En segundo lugar, la densidad de organoides necesarios para llegar a una monocapa confluente debe ajustarse dependiendo de la edad del paciente desde la que se recoge el tejido gástrico. De tejido Obtenido de ratones (> 18 meses) o en pacientes (> 55 años), la densidad de organoide utilizada debe ser doble aumento cuando transferir a una monocapa debido a la capacidad de crecimiento disminuido en años particulares. Durante la digestión y la incubación de tejido humano derivado de pacientes envejecidos, las glándulas pueden ser más susceptibles a la disociación y centrifugación y por lo tanto: 1) deben centrifugarse tan como sea posible, 2) substituido con diligencia y el 3) durante la digestión incubaciones de 15 a 30 minutos con digestiones incrementales de 5 minutos luego disminuirá la probabilidad de que durante la digestión. Finalmente, cuando formando monocapas de suspensiones de células solo organoide, medios FGO 3D es más óptimo para la adecuada formación de monocapas Considerando que al cultivo de organoides intacto, medios FGO 2D se ha observado para obtener la mayor eficiencia.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por el NIH (NIDDK) 5 DK083402-07 R01 grant (YZ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced Dulbecco's modified Eagle/F12 medium (basal media) | Life Technologies | 12634-010 | |
| GlutaMAX (L-glutamine) | Life Technologies | 25030-081 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Scientific | SV30010 | |
| Amphotericin B/Gentamicin | Thermo Scientific | R01510 | |
| Kanamycin | Thermo Fisher | RO1510 | |
| HEPES Buffer | Sigma Aldrich | H0887 | |
| n-Acetylcystine | Sigma Aldrich | A9165 | |
| N2 | Life Technologies | 17502-048 | |
| B27 | Life Technologies | 12587-010 | |
| BMP Inhibitor (Noggin) | Pepro Tech | 250-38 | |
| Gastrin | Tocris | 3006 | |
| EGF | Pepro Tech | 315-09 | |
| FGF10 | Pepro Tech | 100-26 | |
| Nicotinamide | Sigma Aldrich | N0636 | |
| Y-27632 ROCK Inhibitor | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| TGF-β Inhibitor | Tocris | 2939 | |
| Ca2+/Mg2+ -free DPBS | Fisher | 21-031CV | |
| Dulbecco's modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 12634-010 | |
| Fetal Bovine Serum | FBS | ||
| OPTIMEM | Invitrogen | ||
| 0.22µM filter | Fisher | 099-720-004 | |
| 37 °C Water Bath | |||
| Collagenase Type 1 | Worthington | LS004214 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9418 | |
| Kimwipes (tissue paper) | Fischer Scientific | 06-666C | |
| 125 mL round bottom flask | |||
| 1 in (25 mm) stir bar | |||
| Rubber Septa | |||
| Sterile Gauze | |||
| Stir Plate | |||
| Ring Stand | |||
| Ring Stand Clamps | |||
| Sterile petri dish | |||
| 18 G needles of 1.5 in length | Thermo Fisher | 305196 | |
| 20 G spinal needles of 3.5 in length | Thermo Fisher | 405182 | |
| 12-well cell culture treated plate | Midwest Scientific | 92012 | |
| Growth Factor Reduced, Phenol Red-free MatrigelTM (Basement membrane matrix) | Fisher | CB-40230C | |
| Sterile Razor Blades | |||
| Wide-tip tweezers | |||
| Curved Hemostatic Forceps | |||
| 200 µL wide pipette tips | Thermo Fisher | 02-707-134 | |
| 5 mL cell culture test tubes | Fisher | 14-956-3C | |
| Oxygen Tank with rubber hosing | |||
| 1 g D-Sorbitol | |||
| Sucrose | Fisher | SS-500 | |
| Dissecting microscope | |||
| Dissecting Tray | |||
| Rocking Table | |||
| Rat Tail Collagen Type 1 | Life Technologies | A10483-01 | |
| Cell culture grade glacial acetic acid | Fisher | A38-212 | |
| Cell culture grade water | Corning | 25-055-CV | |
| 2-well chamber slide | Thermo Fisher | 155380 | |
| 12-well Transwell (polyester membrane inserts) | Corning | 3460 | |
| Cell scraper | Corning | 353086 | |
| Accutase (cell detachment solution) | Stemcell Technologies | 7920 | |
| 263/8 G syringe | Thermo Fisher | 309625 | |
| Razor blade | |||
| L Cells | L cells, a Wnt3a producing cell line, were received as a gift from Dr. Hans Clevers (Hubrecht Institute for Developmental Biology and Stem Cell Research, Netherlands). | N/A | |
| HEK-293T Rspondin secreting cells | A modified HEK-293T R-spondin secreting cell line was obtained from Dr. Jeff Whitsett (Section of Neonatology, Perinatal and Pulmonary Biology, Cincinnati Children's Hospital Medical Centre and The University of Cincinnati College of Medicine, Cincinnati, USA ). | N/A | |
| HK-ATPase Primary Antibody | Invitrogen | SC-374094 | |
| E-Cadherinn | SantaCruz | sc-59778 | |
| UEA1 | Sigma Aldrich | L9006 | |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher | H3570 | |
| Alexafluor 488 secondary antibody (Donkey anti-mouse 488 secondary antibody) | ThermoFisher Scientific | R37114 |
References
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