Summary
Aqui descrevemos um protocolo para o estabelecimento e cultivo humano e rato derivada de 3-dimensional organoids gástrica (3D) e o método de transferência de organoids 3D para um monolayer 2-dimensional. O uso da monocamada epitelial gástrica como um romance ensaio de zero-ferida para estudos de regeneração também é descrito.
Abstract
Estudos in vitro de reparação da ferida gástrico normalmente envolve o uso de linhas de células de câncer gástrico em um ensaio de zero-ferida de migração e proliferação celular. Uma limitação crítica desses ensaios, no entanto, é sua variedade homogênea de tipos celulares. Reparo é um processo complexo, que exige a interação de vários tipos de células. Portanto estudar uma cultura desprovida de subtipos celulares, é uma preocupação que deve ser superada, se quisermos entender o processo de reparação. O modelo de organoides gástrica pode aliviar esse problema pelo qual a coleção heterogênea de tipos de células intimamente reflete de epitélio gástrico ou outros tecidos nativos em vivo. Demonstrado aqui é um romance, em vitro ensaio zero-ferida derivada de humanos ou rato organoids 3-dimensional que pode então ser transferidos para uma monocamada epitelial gástrica como qualquer organoids intacta ou como uma suspensão de célula única de dissociado organoids. O objetivo do protocolo é estabelecer monocamadas de epiteliais gástricas organoides-derivados que podem ser usadas em um sistema de romance ensaio de zero-ferida para estudar regeneração gástrica.
Introduction
O uso de ensaios de zero-ferida é um método popular para o estudo de reparo e regeneração1,2,3,4,5,6. A metodologia proposta pode ser usada para estudar especificamente a regeneração gástrica e a colonização de Helicobacter pylori . No passado, linhas de células de câncer gástrico têm sido usadas como um meio para estudar de1,de infecção de Helicobacter pylori (H. pylori)2 e até câncer gástrico recentemente linhas de células como as células AGS foram favorecidos1 ,2,3,4. Uma limitação das culturas de células de câncer gástrico é sua incapacidade de recapitular a diversidade celular do epitélio gástrico. Para tentar resolver essa limitação, demonstrado que aqui é a criação e transferência de primários humanos e rato derivada de 3-dimensional gástrica gástrica organoids (FGOs) para uma monocamada epitelial gástrica para ensaios de cura ferida com base em um método modificado primeiro descrita por Schlaermann et al. 7 Nós demonstramos que gástrico monocamadas epiteliais derivadas cisalhadas 3D FGOs gástricas ou FGO-derivado de células únicas retêm uma composição celular polarizada que representa perto de epitélio gástrico in vivo. Dado que linhas de células de câncer gástrico não demonstrar a composição da célula que exibe esta técnica, o protocolo atual tem uma vantagem sobre os métodos de ensaio alternativos de zero-ferida. Esta metodologia foi otimizada pelo qual monocamadas podem ser estabelecida de toda organoids ou de uma suspensão de célula única de organoids dissociada e chapeado usando uma matriz de membrana basal ou revestimento de colágeno. O objetivo geral do presente protocolo é estabelecer que um organoides derivado de culturas de monocamada epitelial gástrica para um ensaio de cura ferida novela.
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Protocol
Para evitar contaminação, realize o protocolo na sua totalidade dentro de um capuz de cultura de tecido estéril. Tecido humano gástrica foi coletado de pacientes submetidos à gastrectomia de manga de acordo com o protocolo aprovado da Universidade de Cincinnati IRB (número de protocolo do IRB: 2015-4869).
Todos os estudos de rato foram aprovados pela Universidade de Cincinnati institucional cuidados com animais e uso Comité (IACUC) que mantém uma associação americana de avaliação e acreditação do laboratório Animal conta (AAALAC) facilidade.
1. estabelecer Organoids gástrica gástrico 3D humanos-derivado
Nota: Este protocolo é baseado em pesquisa publicada anteriormente neste laboratório8.
- Prepare a mídia de organoides 3D que consiste de mídia de R-spondin condicionado condicionado Wnt e 20% 50%.
- Preparar a mídia Wnt condicionado, cultura de células em meio de crescimento de Wnt L (Dulbecco modificada do Eagle médio (DMEM), 10% de soro fetal bovino (FBS), 1% penicilina/estreptomicina) por 7 dias, colha o médio e filtrar usando um filtro de 0,22 µm.
- Prepare a mídia R-spondin condicionado. Crescer uma modificado HEK-293T R-spondin secretando linha celular em meio de crescimento R-spondin (Dulbecco modificada do Eagle médio (DMEM), 10% de soro fetal bovino (FBS), 1% penicilina/estreptomicina). Em cima do acessório após 2 h, alterar o meio destas células para crescimento OPTIMEM médio, 1% penicilina/estreptomicina. Cultura das células durante 7 dias. Em seguida, colher os meios de comunicação de R-spondin condicionado e filtrar usando um filtro de 0,22 µm.
Nota: Este protocolo tem sido publicado anteriormente e por um protocolo mais detalhado consulte a 6,7,8.
- Descongelar o fator de crescimento reduzido, vermelho de fenol-livre da membrana basal matrix para 16 h no gelo a 4 ° C. Coletar o tecido em que o gelo frio de Ca2 +/ mg2 +-free DBPS em um grande recipiente de plástico. Armazenar no gelo até o passo de início 1.4.
Nota: O tecido é coletado de pacientes submetidos à gastrectomia de manga. - Usando fórceps, lave o tecido vigorosamente num copo estéril contendo 100ml Ca2 +/ mg2 +-livre fosfato Buffered Saline (DPBS de Dulbecco). Lave por aproximadamente 30 s ou até os detritos e o sangue foi removido. Em seguida, usando gaze estéril, limpe a camada mucosa do epitélio.
- Usando grandes pinças, firmemente agarrar a camada muscular do tecido e com força, raspar o epitélio usando a pinça hemostática curva grande. Colete os fragmentos epiteliais raspados em uma placa de Petri estéril, poliestireno.
- Picar o tecido epitelial em aproximadamente 2.0 x 2.0 mm2 tamanho fragmentos usando lâminas de barbear para otimizar a digestão do tecido. Lave os fragmentos de tecido com Ca2 +/ mg2 + -free DBPS suplementadas com antibióticos (Ca2 +/ mg2 + -livre DPBS, 1% penicilina/estreptomicina, 0,25 mg/mL de anfotericina B 10 mg/mL de gentamicina, canamicina de 50 mg/mL), até a lavagem é livre de sangue. Execute múltiplas lavagens, se necessário. Descarte fora a lavagem filtrando cuidadosamente a lavagem através de uma gaze estéril para um copo de resíduos.
- Lavado recolher fragmentos em um vidro de 125 mL redonda balão de fundo com uma barra de agitação de 25 mm e incubação pré-aquecido media (mídia basal suplementada com 2 mM L-glutamina, 1% penicilina/estreptomicina, 10 mM de tampão HEPES, 1 mg/mL colagenase tipo 1, cultura de células de 2 mg/mL grau de albumina de soro bovino). Sele o balão de fundo redondo com septos de borracha.
- Inserir uma agulha espinhal 20g os septos e conectá-lo a um tanque de oxigênio com mangueira de borracha. Para filtrar contaminantes, inserir papel de tecido para o tubo para criar um filtro. Ligue a saída de oxigênio na baixa. Inserir agulhas de saída de 10-15 os septos para evitar a ruptura dos septos.
- Fixar o conjunto acima para uma posição de anel usando grampos e colocá-lo num banho de água calibrado a 37 ° C, com uma placa de agitação por 30-45 min. Depois que o tecido tem sido incubando por 15 min, remova 50 µ l de mídia de incubação e verifique visualmente a glândulas dissociadas. Se as glândulas não são densas ou não tem separado do tecido, deixe para um adicional 5-10 min.
- Imediatamente após a incubação, adicionar 50 mL pré-aquecido DMEM/F12 para mídia de incubação usando uma pipeta estéril e serológica ou derramando diretamente na mistura de incubação.
- Filtre a mistura da glândula através de uma gaze estéril para quatro tubos de Erlenmeyer de 50 mL. Mantenha o filtrado no gelo por 15 min permitir glândulas extraídas resolver a parte inferior do tubo cónico. Tenha cuidado para não perturbar as glândulas resolvidas, remova e descarte do topo 40 mL do sobrenadante com uma pipeta sorológica. Resuspenda os restante 10 mL em 10 mL de DPBS suplementadas com antibióticos.
- Distribua a mistura uniformemente em tubos de ensaio de cultura de células de 5ml. Centrifugue por 5 min a 65 x g a 4 ° C e remover o sobrenadante cuidadosamente usando uma pipeta. Resuspenda o pellet de glândula na matriz descongeladas membrana basal usando uma pipeta ou uma ponta de pipeta ampla 200 µ l. Misture até homogênea.
Nota: É fundamental para executar essa etapa no gelo e para evitar a polimerização da matriz da membrana basal, enquanto mistura. Além disso, é importante inspecionar visualmente a densidade da glândula por amostragem para 50 µ l. A densidade ideal é a confluência de ~ 70%. - Em seguida, placa as glândulas em 50 µ l de membrana basal matriz usando uma pipeta de ponta larga. Evite produzir quaisquer bolhas enquanto chapeamento.
- Para permitir que a matriz da membrana basal polimerizar, incubar durante 10-15 min a 37 ° C. Se chapeamento em uma placa de cultura de 12 poços, adicionar 1 mL de mídia hFGO (modificado águia médio/F12 meio do Advanced Dulbecco suplementado com 2mM L-glutamina, 1% penicilina/estreptomicina, 0,25 mg/mL de anfotericina B 10 mg/mL de gentamicina, 50 mg/mL canamicina, 10 mM HEPES Tampão, n-Acteylcystine de 1 mM, 1 x 1 x B27, médio de Wnt-condicionados de 50%, 20% R-spondin-condicionado suplementado com 100 ng/mL de N2, osso inibidor de Proteína morfogenética, gastrina nM 1, 50 ng/mL, fator de crescimento epidérmico, fator de crescimento de fibroblastos de 200 ng/mL 10, 10 mM, nicotinamida e inibidor de Y-27632 ROCK 10 µM) por poço. Se não usando uma placa de cultura de 12 poços Adicionar suficiente mídia para submergir a bolha de matriz de membrana basal.
- Cultura das células a 37 ° C numa incubadora de cultura 5% CO2 célula umidificado. Mudar a mídia todos os dias 4-5.
2. estabelecimento de Organoids gástrica gástrico 3D Mouse-derivado
Nota: Este protocolo tem sido publicado anteriormente 6. Descongelar a matriz da membrana basal no gelo e preparar todos os reagentes antes de começar.
- Sacrificar os ratos usando um método aprovado pela instituição de pesquisa onde a pesquisa está sendo executada. Remover o estômago do rato e dissecar de acordo com os protocolos anteriormente publicados 6. Lavar em 20 mL gelo frio Ca2 +/ mg2 +-livre DBPS.
Nota: Camundongos C57BL/6, com idades entre 8-10 semanas, são utilizados para culturas de organoides gástrico gástrica. Os ratos foram sacrificados por inalação de dióxido de carbono, seguido por deslocamento cervical manual antes da remoção do estômago. - Retirar a camada muscular do estômago e qualquer vasos sanguíneos visíveis como anteriormente publicado 6.
- Separe o fundo do antro e forestomach usando uma lâmina de barbear estéril. Corte fundo usando pequenas tesouras cirúrgicas em fragmentos aproximadamente 2.0 x 2.0 mm. usando fórceps, coletar os fragmentos em um tubo cônico de 15 mL contendo EDTA buffer de incubação (Ca2 +/ mg2 +-livre DPBS, 5 mM EDTA) e incube a 4 ° C por 2 h com leve agitação.
- Em uma capa de estéril, deixar o tubo cônico e fragmentos de gelo aproximadamente 5 min. usam uma pipeta para remover tanto tampão de incubação possível deixando fragmentos intocado. Adicionar 5 mL de tampão a tremer (1 g de D-Sorbitol, sacarose 1,47 g em 100 mL Ca2 +/ mg2 +-free DPBS) e apertar à mão com uma força de 2 min. permitir que os fragmentos grandes para se estabelecer e com pressa, usando uma pipeta de 1000P, remover os pequenos fragmentos que ainda têm de resolver na camada superior.
- Gire os fragmentos removidos por 5 min a 4 ° C a 65 x g.
- Evitando as bolhas de ar, remover o sobrenadante, resuspenda na matriz da membrana basal e misture até ficar homogêneo.
- Use uma pipeta de ponta ampla para a matriz de membrana basal em 50 µ l por alvéolo da placa e então incubar a 37 ° C por 20 min.
- Adicionar mídia de crescimento bastante mFGO (Advanced Dulbecco modificado suplementado com 2mM L-glutamina, 1% penicilina/estreptomicina, 10mm médio/F12 águia tampão HEPES, 1mm n-Acteylcystine, 1 x N2, 1 x B27, meio de Wnt-condicionado 50%, 20% R-spondin-condicionado suplementado com inibidor da Proteína morfogenética óssea da 100 ng/mL, 10 gastrina nM, 50ng/mL de fator de crescimento epidérmico, fator de crescimento de fibroblastos de ng/mL 10 10 e inibidor de Y-27632 ROCK 10 µM) para submergir a bolha.
- Cultura das células a 37 ° C, a incubadora cultura 5% CO2 célula umidificado. Altere os meios de comunicação a cada 4-5 dias.
3. revestimento colágeno para transferência 2D
Nota: Execute todos os procedimentos em uma capa de cultura de tecido estéril, a menos que especificado de outra forma. Começa o revestimento 24h antes de transferir o organoids 3D para a monocamada de colágeno. Manter o colagénio de cauda de rato no gelo e protegido da luz. Placas revestida de colágeno são bons por até 2 semanas. Se não utilizar as placas revestidas imediatamente, embrulhe o prato no parafilm e loja a 4 ° C, até que seja necessário.
- Dilua o colágeno de cauda de rato para 50 µ g/mL com 20 mM de ácido acético.
- Cobrir suficientemente a superfície do poço com colágeno diluído. Para um bem em uma placa padrão de 12, casaco com aproximadamente 1 mL de colágeno. Deixe durante a noite à temperatura ambiente em um capuz estéril.
- Lave duas vezes com 1 mL Ca2 +/ mg2 +-livre DPBS por alvéolo e deixar descobertos para 2 h à temperatura ambiente em um capuz estéril.
4. membrana basal revestimento de matriz para transferência 2D
Nota: Execute todos os procedimentos em uma capa de cultura de tecido estéril, a menos que especificado de outra forma. Matriz de membrana basal revestimento 2 h antes de transferir o organoids 3D para a monocamada de começar. Manter a matriz da membrana basal no gelo. Placas revestidas devem ser usados imediatamente e não podem ser armazenadas por um período prolongado de tempo.
- Diluir a matriz da membrana basal em um tubo cônico de 15 mL, com uma água de grau de cultura de célula em uma 01:10 proporção. Dilua no gelo.
- Usando uma pipeta adicionar 100 µ l de matriz diluídos membrana basal a cada poço de uma placa padrão de 12. Com uma espátula de célula, distribua uniformemente a matriz diluídos da membrana basal em todo o poço para um casaco mesmo.
- Incube a 37 ° C, durante 1 h.
- Remover a água residual com uma pipeta e secar à temperatura ambiente durante 1 h antes de transferir o organoids 3D.
5. transferência de m/hFGOs 3D para 2D monocamadas de células epiteliais gástricas
- Depois 3D mouse ou humanos derivada de que fgos têm sido cultivadas por 6-7 dias, iniciar a transferência de organoids 3D para a 2D monocamada.
Nota: Para cada poço de uma monocamada exigido é recomendável usar 300 organoids intactas ou única células derivadas de 300 organoids. Em uma robusta cultura espera-se obter aproximadamente 150 organoides/poço dentro de uma placa de cultura bem 12. - Certifique-se de que as placas são revestidas antes da transferência.
Nota: As placas de matriz revestido de membrana basal tem uma camada de gel transparente, no entanto, placas de colágeno revestida não terá qualquer indicação óbvia do revestimento. - Deslocar a bolha de matriz 3D da membrana basal da placa pipetando diretamente 1ml estéril Ca2 +/ mg2 +-free DBPS para o centro da bolha.
- Utilizando uma pipeta, recolha a mistura de matrix e organoides membrana basal em tubos de ensaio de cultura de células. Recolha a uma proporção de 2 bolhas de matriz de membrana basal por tubo. Centrifugue por 5 min em 40 x g e 4 ° C.
- Usando um sistema de vácuo, remover o sobrenadante e quanto muito matriz de membrana basal quanto possível. Resuspenda em 4 mL de Ca2 +/ mg2 +-livre DBPS, remover o sobrenadante e repita 2 - 3 vezes. Para o protocolo de transferência de organoides inteiro, vá para a etapa 5.10. Vá para a etapa 5.7 para o protocolo de suspensão de célula única.
- Pré-aquecer a solução de desprendimento celular a 37 ° C e adicionar 1 mL de cada tubo de ensaio. Misture suavemente por inversão de tubos ou pipetagem para cima e para baixo com uma pipeta. Incubar durante 10 minutos a 37 ° C.
- Adicionar 2 mL de Ca2 +/ mg2 +-livre DBPS diretamente para cada tubo de ensaio.
- Use uma agulha 26G e seringa de mistura de 2 - 3 vezes. Verifique visualmente para células individuais. Seringa de 1-2 vezes mais se ainda houver organoids ou aglomerados de células.
- Centrifugar 40 x g por 5 min a 4 ° C. Resuspenda o pellet em 2D mídia FGO (meio de crescimento do mouse 2D FGO: meio de médio/F12 Eagle modificado do Dulbecco avançado suplementado com 2mM L-glutamina, 10 mM penicilina/estreptomicina, 10% soro Fetal do bezerro, 10mm tampão HEPES, 1 x N2, 1 x B27, suplementado com 10 gastrina nM, fator de crescimento epidérmico de 50 ng/mL, 1 inibidor de TGF-β µM e inibidor de Y-27632 ROCK 10 µM. 2D meio de crescimento humano FGO: Meio de médio/F12 Eagle modificado de Dulbecco avançada suplementado com 2mM L-glutamina, 1% penicilina/estreptomicina, 10mm tampão HEPES, 10% soro Fetal do bezerro, 10mm nicotinamida, 1 x N2, 1 x B27, suplementado com 50mg/mL canamicina, 50 ng/mL crescimento epidérmico Fator e inibidor de Y-27632 ROCK 10 µM, 1 µM TGF-β inibidor).
- A ressuspensão em placas revestidas de chapa. Incubar as placas a 37 ° C. Substitua a mídia cada 4 dias ou mais cedo se a mídia fica amarela. Monocamada requer aproximadamente 4 dias para o formulário.
6. Raspe ferida ensaio usando monocamadas de células epiteliais gástricas 2D
- Usando uma lâmina de barbear, arranhe a monocamada, quando a cultura chegou a confluência de 100%.
- Corrigi monocamadas usando formol 3,7% durante 15 minutos à temperatura ambiente. Permeabilize com detergente não-iônico 0,5% / PBS por 20 min em temperatura ambiente.
- Em seguida, bloquear monocamadas com soro de burro de 2% por 1h à temperatura ambiente e incubar com diluição de 1: 1000 de H+, K+-ATPase anticorpo primário durante a noite a 4 ° C, lavar com detergente não-iônico de 0.1% / PBS e incubar com diluição de 1: 100 de burro anticorpo secundário anti-rato 488 e 10μg/mL de núcleos de células de Hoechst mancham por 1h à temperatura ambiente.
- Para identificar as células de superfície mucosa poço em culturas 2D monocamada gástrico humano-derivado, mancha de células com 20 μg /mL de conjugado FITC Ulex europaeus (UEAI). Monocamadas de imagem em um microscópio confocal.
- Com imagens da ferida cada poucos h. zero será re-epithelialize entre 24-48 h, dependendo da qualidade da monocamada e variação entre os pacientes.
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Representative Results
Organoids foram derivadas do corpo/corpo do ser humano ou do fundo dos tecidos estômago do rato (figura 1A). Depois da digestão de EDTA de humanos ou do mouse derivada de tecido de estômago ou colagenase respectivamente, glândulas são incorporadas em matriz da membrana basal e cultivadas por 6-7 dias (figura 1A). Figura 1B demonstra a formação de derivados humanos gástrica organoids (huFGOs) que em seguida foram transferidos para uma monocamada epitelial gástrica (huGEM) em slides de câmara matriz-revestido de membrana basal. Após 4 dias de cultura, confluentes huGEMs foram utilizadas para ensaios de ferida zero (figura 1B). Imagens recolhidas de uma análise de lapso de tempo da huGEM mostrou o fechamento da ferida dentro da cultura ao longo de um período de 24 horas (Figura 2).
HuGEMs foram encontradas expressar as linhagens de células principais encontrados no tecido nativo do estômago. Mancha da imunofluorescência revelou a expressão de uma monocamada de caderina-positivo E polarizada que consistia o parietal (Figura 3B, C) e a superfície mucosa (Figura 3B, D) células. Análise PCR usando RNA colhido estes monocamadas confirmou a expressão das células mucosas parietais e superfície, além das células de pescoço chefe e mucosas (Figura 3E). Confluentes huGEMs expressa também algumas pilhas proliferating (Figura 3F). Análise destas linhagens de células grandes dentro o ensaio da ferida zero revelou expressão sustentado de células mucosas da superfície parietal, chefe, mucosa do pescoço ao longo de um período de tempo (Figura 4A, B) de 24 horas. Coletivamente, estes dados demonstram o uso de huGEMs como sistema de cultura de romance para estudar regeneração gástrica em vitro.
Figura 1: geração de humanos-derivado organoids gástrica (huFGO) e monocamadas epiteliais gástricas primárias (huGEM). (A) imagens representativas de estômago gástrico humano tecido e mouse usado para gerar as glândulas para cultura de organoides. Área delineada indica região gástrica do estômago do rato. (B) geração de humanos-derivado gástrica organoids (huFGOs) que são usados para a cultura de monocamadas epiteliais gástricas humanos-derivado (huGEMs). Imagem representativa da huGEM após arranhão, mostrando a área de feridos. Barra de escala = 500 μm clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: ensaio de zero-ferida. Imagens representativas coletaram de um experimento de lapso de tempo usando o huGEM 0, 8, 16 e 24 h após o risco de ferimento. Barra de escala = 500 μm clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: expressão de linhagens de células grandes em culturas de huGEM. Mancha da imunofluorescência de huGEM culturas demonstrando a expressão de caderina (A) E (Ecad, vermelho), de superfície células mucosas (UEAI, verde) e núcleos (Hoechst, azul) e (B) E caderina (Ecad, vermelho), células parietais (HK, verde) e núcleos ( Hoechst, azul). Canais separados são mostrados em (C) e (D). (E) RT-PCR foi realizada utilizando RNA extraído de huGEMs para a expressão de H+K+-ATPase (ATP4a), pepsinogénio C (PgC), MUC5AC e MUC6. (F) Proliferating células dentro da cultura de huGEM determinada pela captação de EdU (vermelho). Escala da barra (A-D) = 50 μm, escala bar (F) = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: mudanças na expressão de linhagem celular no ensaio de zero-ferida. Mancha da imunofluorescência de huGEM culturas demonstrando a expressão de E-caderina (Ecad, vermelho) ou células mucosas da superfície (UEAI, verde) ou células parietais (HK, verde) e núcleos (Hoechst, azul) usando slides coletados de huGEM culturas 0, 8, 16 e 24 hrs post zero-ferida. Bkgrd = fundo de coloração da membrana basal matriz nos slides. Barra de escala do eixo XY de 0 - 400 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Mouse 3D Media | Solução-mãe | Trabalho de concentração |
| nAcetylcysteine | Em pó | 1 mM |
| Gastrina | 10 ΜM | 10 nM |
| FEG | 500 µ g/mL | 50 ng/mL |
| Cabeça | 100 µ g/mL | 100 ng/mL |
| FGF10 | 100 µ g/mL | 100 ng/mL |
| YCMD | 10 mM | 10 ΜM |
| B27 | 50 x | 1 x |
| N2 | 100 x | 1 x |
| Caneta/Strep | 1 M | 10 mM |
| HEPES | 1 M | 10 mM |
| Glutamax | 200 mM | 2 mM |
| WNT | 50% v/v | |
| R-Spondin | 10% v/v |
Tabela 1: Componentes de mídia 3D Mouse.
| Mouse 2D mídia | Solução-mãe | Trabalho de concentração |
| FCS | 100% | 10% |
| YCMPD | 10 mM | 10 ΜM |
| Gastrina | 10 ΜM | 10 nM |
| FEG | 500 µ g/mL | 50 ng/mL |
| B27 | 50 x | 1 x |
| N2 | 100 x | 1 x |
| Caneta/Strep | 1 M | 10 mM |
| HEPES | 1 M | 10 mM |
| Glutamax | 200 mM | 2 mM |
| Inibidor de TGF-β | 10 mM | 1 ΜM |
Tabela 2: Componentes de mídia 2D de Mouse.
| Mídia 3D humana | Solução-mãe | Trabalho de concentração |
| Nicotinamida | Em pó | 10 mM |
| nAcetylcysteine | Em pó | 1 mM |
| Gastrina | 10 ΜM | 1 nM |
| FEG | 500 µ g/mL | 50 ng/mL |
| Cabeça | 100 µ g/mL | 100 ng/mL |
| FGF10 | 100 µ g/mL | 200 ng/mL |
| YCMD | 10 mM | 10 ΜM |
| B27 | 50 x | 1 x |
| N2 | 100 x | 1 x |
| Caneta/Strep | 1 M | 10 mM |
| HEPES | 1 M | 10 mM |
| Glutamax | 200 mM | 2 mM |
| Canamicina | 1 M | 10 mM |
| Anfotericina B/gentamicina | 125 µ g/mL | 1 mM |
| WNT | 50% v/v | |
| R-Spondin | 10% v/v |
Tabela 3: Componentes de mídia 3D humana.
| Humana mídia 2D | Solução-mãe | Trabalho de concentração |
| FCS | 100% | 10% |
| YCMPD | 10 mM | 10 ΜM |
| Gastrina | 10 ΜM | 1 nM |
| FEG | 500 µ g/mL | 50 ng/mL |
| B27 | 50 x | 1 x |
| N2 | 100 x | 1 x |
| Caneta/Strep | 1 M | 10 mM |
| HEPES | 1 M | 10 mM |
| Glutamax | 200 mM | 2 mM |
| Inibidor de TGF-β | 10 mM | 1 ΜM |
| Nicotinamida | Em pó | 10 mM |
| Canamicina | 1 M | 10 mM |
Tabela 4: Componentes de mídia 2D humana.
| Problema experimental | Solucionando problemas de ponta |
| Monocamadas falharem a forma de organoids | 1) condições de cultivo ideais para este protocolo variam entre necessidades experimentais. Humano e monocamadas de rato, derivadas de organoids devem ser cultivadas usando matriz diluídos da membrana basal ao usar vidro ou pratos de plástico de cultura. No entanto, colágeno de cauda de rato é ideal para experimentos de monocamadas de rato ou inserções de origem humana que exigem a membrana de poliéster. 2) óptimas condições de cultivo variam dependendo do conjunto experimental acima. As culturas usando suspensão única célula idealmente são cultivadas com 3D mídia FGO Considerando que organoids intactas são cultivadas com 2D mídia FGO. |
| Monocamadas derivadas envelhecido pacientes (> 55 anos) ou ratos (> 18 meses) não conseguiram crescer e chegar a confluência | Se usar tecido de estômago coletados de ratos envelhecidos (> 18 meses) ou pacientes (> 55 anos) a densidade do organoids usado para a geração da monocamada deve ser duplicada, dado que a eficiência do crescimento de organoids é diminuída. |
| Organoids falhar a forma das glândulas | É recomendável que fresco (se possível o recém-comprado) gastrina ser usado. Use a gastrina recém re-suspensa em 4 meses. |
| Organoids deixar de anexar e formam monocamadas | Certifique-se de que remoção eficiente de matriz da membrana basal foi alcançada após a colheita de organoids para a transferência de placas de cultura de monocamadas. |
| Derivado de culturas com idades entre pacientes (> 55 anos) ou ratos (> 18 meses) falhar | Durante os períodos de incubação e digestão, 15-30 min de incubação inicial, seguida de intervalos de 5 min de incubação como necessário é suficiente. Deve notar-se que os pacientes superiores a 55 anos de idade podem ter glândulas que são mais facilmente dissociadas e, portanto, exigem menos digestão. Da mesma forma, FGOs derivados de pacientes idosos têm exibido tempo mais lento de crescimento e aumento da sensibilidade a centrifugação. Para obter os melhores resultados, limitar qualquer excesso centrifugação quando trabalhar com tecido envelhecido e substituir a mídia em tempo hábil. |
Tabela 5: solução de problemas dicas. Encontrou problemas e resoluções recomendadas para estabelecimento ideal e cultura de humanos ou monocamadas gástrica do mouse.
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Discussion
O atual protocolo detalha a criação de monocamadas de epitelial gástrica humanos e rato-derivados que podem ser usados para ensaios de zero-ferida. O protocolo depende do conceito de células-tronco residentes tecidos de isolamento de humanos primários (ou mouse) e é um protocolo modificado publicado pela primeira vez por Schlaermann et al.7. Em particular, temos otimizado o protocolo aqui para estabelecer uma confluente e polarizada gástrica monocamada epitelial que expressa o major celular linhagens que podem ser encontradas no epitélio gástrico na vivo. Reparação de úlcera gástrica é um processo complexo que envolve o tecido re-epitelização, regeneração e proliferação9,10,11. Em particular, nosso laboratório tem relatado que a regeneração do epitélio gástrico coincide com o surgimento de polipeptídeo/trevo spasmolytic fator (TFF) 2-expressando o metaplasia (SPEM) à margem da úlcera dentro das glândulas gástricas regeneradora 12,13. SPEM é definida como a transdiferenciação celular da linhagem celular chefe em uma célula mucosa metaplasia14 que surge com a lesão e desaparece quando a mucosa retorna para sua composição celular normal12. Assim, para estudar esse mecanismo em um sistema in vitro , é essencial que as linhagens de células grandes, tais como as células chefe, estão presentes em uma cultura.
O uso do zero-ferida ensaios têm sido extensivamente usados para o estudo de reparo e regeneração, e até recentemente, linhas de células de câncer gástrico foram usados1,2,3,4. Enquanto mecanismos fundamentais foram revelados usando linhas de células de câncer gástrico, essas culturas são transformadas e faltam a diversidade celular do tecido nativo do estômago. HuGEMs são mostradas para reter uma composição celular polarizada e diversificada que intimamente recapitula o epitélio gástrico em vivo. Além disso, depois atingindo a confluencia huGEM culturas podem ser mantidas por até um mês em condições ideais. Culturas estendidas permitem experimentos de longo prazo. Assim, futuras aplicações as huGEMs que podem ser consideradas incluem monocamada/imune celular co culturas e experiências de longo prazo para o estudo da patogênese de Helicobacter pylori .
Existem aspectos técnicos importantes anotar no protocolo atual. O primeiro ponto de técnico é que a escolha do componente da membrana basal varia de acordo com a superfície de cultura de célula a ser usado para experiências. Para garantir que as condições óptimas monocamada são alcançadas, recomenda-se que o colágeno é usado quando experimentos com monocamadas exigem placas com inserções de membrana de poliéster. No entanto, se experiências monocamada exigem vidro ou superfícies de plástico cultura, matriz diluídos da membrana basal é a escolha ideal do revestimento. Em segundo lugar, a densidade de organoids necessária para alcançar uma monocamada confluente deve ser ajustada dependendo da idade do paciente de que o tecido gástrico é coletado. Para tecidos coletados de ratos envelhecidos (> 18 meses) ou pacientes (> 55 anos), a densidade de organoides usada deve ser dupla aumentada quando transferir para um monolayer devido a capacidade de diminuição do crescimento em idade indivíduos. Durante a digestão e incubação de tecido humano, derivado de pacientes idosos, as glândulas podem ser mais suscetíveis a dissociação e centrifugação e portanto: 1) devem ser centrifugadas com moderação como possível, 2) media substituído diligentemente e 3) durante a digestão incubação de 15 a 30 minutos com digestões incrementais de 5 minutos depois irá diminuir a probabilidade de sobre a digestão. Finalmente, quando formando monocamadas de suspensões celulares único derivado de organoides, 3D FGO media é mais ideal para a formação adequada de monocamadas, Considerando que quando o cultivo de organoids intacto, 2D mídia FGO tem sido observada para produzir a mais alta eficiência.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo NIH (NIDDK) 5 R01 DK083402-07 conceder (YZ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced Dulbecco's modified Eagle/F12 medium (basal media) | Life Technologies | 12634-010 | |
| GlutaMAX (L-glutamine) | Life Technologies | 25030-081 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Scientific | SV30010 | |
| Amphotericin B/Gentamicin | Thermo Scientific | R01510 | |
| Kanamycin | Thermo Fisher | RO1510 | |
| HEPES Buffer | Sigma Aldrich | H0887 | |
| n-Acetylcystine | Sigma Aldrich | A9165 | |
| N2 | Life Technologies | 17502-048 | |
| B27 | Life Technologies | 12587-010 | |
| BMP Inhibitor (Noggin) | Pepro Tech | 250-38 | |
| Gastrin | Tocris | 3006 | |
| EGF | Pepro Tech | 315-09 | |
| FGF10 | Pepro Tech | 100-26 | |
| Nicotinamide | Sigma Aldrich | N0636 | |
| Y-27632 ROCK Inhibitor | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| TGF-β Inhibitor | Tocris | 2939 | |
| Ca2+/Mg2+ -free DPBS | Fisher | 21-031CV | |
| Dulbecco's modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 12634-010 | |
| Fetal Bovine Serum | FBS | ||
| OPTIMEM | Invitrogen | ||
| 0.22µM filter | Fisher | 099-720-004 | |
| 37 °C Water Bath | |||
| Collagenase Type 1 | Worthington | LS004214 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9418 | |
| Kimwipes (tissue paper) | Fischer Scientific | 06-666C | |
| 125 mL round bottom flask | |||
| 1 in (25 mm) stir bar | |||
| Rubber Septa | |||
| Sterile Gauze | |||
| Stir Plate | |||
| Ring Stand | |||
| Ring Stand Clamps | |||
| Sterile petri dish | |||
| 18 G needles of 1.5 in length | Thermo Fisher | 305196 | |
| 20 G spinal needles of 3.5 in length | Thermo Fisher | 405182 | |
| 12-well cell culture treated plate | Midwest Scientific | 92012 | |
| Growth Factor Reduced, Phenol Red-free MatrigelTM (Basement membrane matrix) | Fisher | CB-40230C | |
| Sterile Razor Blades | |||
| Wide-tip tweezers | |||
| Curved Hemostatic Forceps | |||
| 200 µL wide pipette tips | Thermo Fisher | 02-707-134 | |
| 5 mL cell culture test tubes | Fisher | 14-956-3C | |
| Oxygen Tank with rubber hosing | |||
| 1 g D-Sorbitol | |||
| Sucrose | Fisher | SS-500 | |
| Dissecting microscope | |||
| Dissecting Tray | |||
| Rocking Table | |||
| Rat Tail Collagen Type 1 | Life Technologies | A10483-01 | |
| Cell culture grade glacial acetic acid | Fisher | A38-212 | |
| Cell culture grade water | Corning | 25-055-CV | |
| 2-well chamber slide | Thermo Fisher | 155380 | |
| 12-well Transwell (polyester membrane inserts) | Corning | 3460 | |
| Cell scraper | Corning | 353086 | |
| Accutase (cell detachment solution) | Stemcell Technologies | 7920 | |
| 263/8 G syringe | Thermo Fisher | 309625 | |
| Razor blade | |||
| L Cells | L cells, a Wnt3a producing cell line, were received as a gift from Dr. Hans Clevers (Hubrecht Institute for Developmental Biology and Stem Cell Research, Netherlands). | N/A | |
| HEK-293T Rspondin secreting cells | A modified HEK-293T R-spondin secreting cell line was obtained from Dr. Jeff Whitsett (Section of Neonatology, Perinatal and Pulmonary Biology, Cincinnati Children's Hospital Medical Centre and The University of Cincinnati College of Medicine, Cincinnati, USA ). | N/A | |
| HK-ATPase Primary Antibody | Invitrogen | SC-374094 | |
| E-Cadherinn | SantaCruz | sc-59778 | |
| UEA1 | Sigma Aldrich | L9006 | |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher | H3570 | |
| Alexafluor 488 secondary antibody (Donkey anti-mouse 488 secondary antibody) | ThermoFisher Scientific | R37114 |
References
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