Summary
Her beskriver vi en protokol til oprettelse og dyrkning menneskelige - og mus-afledte 3-dimensionelle (3D) gastrisk organoids, og metoden for overførslen af 3D organoids til en 2-dimensional éncellelag. Brug af gastrisk epitelial éncellelag som en roman scratch-sår assay for regenerering undersøgelser er også beskrevet.
Abstract
In vitro undersøgelser af gastrisk sår reparation indebærer typisk anvendelse af gastrisk kræft cellelinjer i bunden-sår assay cellulære spredning og migration. En kritisk begrænsning af disse analyser, er dog deres homogen sortiment af cellulære typer. Reparation er en kompleks proces, som kræver et samspil mellem flere celletyper. Derfor, for at studere en kultur cellulære undertyper, er en bekymring, der skal overvindes, hvis vi skal forstå reparationsprocessen. Gastrisk organoid model kan afhjælpe dette problem, hvorved en heterogen samling af celletyper nøje afspejler gastrisk epitel eller andre indfødte væv in vivo. Vist her er en roman, in vitro- bunden-sår assay stammer fra menneskelige eller mus 3-dimensional organoids, der kan derefter overføres til en gastrisk epitelial éncellelag, som enten intakt organoids eller som en enkelt cellesuspension af dissocieres organoids. Målet med protokollen er at etablere organoid-afledte gastrisk epitelial encellelag, der kan bruges i en roman scratch-sår assay system for at studere gastrisk regenerering.
Introduction
Brugen af bunden-sår assays er en populær metode til at studere reparation og regeneration1,2,3,4,5,6. Den foreslåede metodologi kan anvendes til specifikt studerer gastrisk regenerering og Helicobacter pylori kolonisering. I fortiden, gastrisk kræft cellelinjer har været brugt som et middel til at studere Helicobacter pylori (H. pylori) infektion1,2 og indtil for nylig gastrisk kræft cellelinjer såsom AGS celler var yndet1 ,2,3,4. En begrænsning af gastrisk kræft cellekulturer er deres undladelse af at sammenfatte den cellulære mangfoldighed af gastrisk epitel. For at forsøge at afhjælpe denne begrænsning viste her er oprettelse og overførsel af primære menneskelige - og mus-afledt 3-dimensionel fundic gastrisk organoids (FGOs) til en gastrisk epitelial éncellelag for sår healing assays baseret på en modificeret metode først beskrevet af Schlaermann al.. 7 vi påvise, gastrisk epitelial encellelag stammer fra forskydes 3D gastrisk FGOs eller FGO-afledte enkelt celler bevarer en polariseret cellulære sammensætning, der nøje repræsenterer det af gastrisk epitel in vivo. Eftersom gastrisk kræft cellelinjer ikke vise celle sammensætning denne teknik viser, har den nuværende protokol en fordel i forhold til alternative scratch-sår assay metoder. Denne metode er blevet optimeret, hvorved encellelag kan være etableret fra hele organoids eller fra en enkelt cellesuspension fra dissocierede organoids og forgyldt, ved hjælp af en basalmembran matrix eller kollagen-belægning. Det overordnede mål med denne protokol er at etablere en organoid afledt gastrisk epitelial éncellelag kulturer for en roman sår healing assay.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
For at undgå kontaminering, skal du udføre protokol i sin helhed i en steril vævskultur hætte. Menneskelige fundic væv blev indsamlet fra patienter, der gennemgår Ærme gastrektomi efter godkendte University of Cincinnati IRB protokol (IRB protokolnummer: 2015-4869).
Alle mus undersøgelser blev godkendt ved University of Cincinnati institutionelle dyrs pleje og brug udvalg (IACUC) der vedligeholder en American Association for evaluering og akkreditering af Laboratory Animal Care (AAALAC) facilitet.
1. etablering af menneske-afledte 3D gastrisk Fundic Organoids
Bemærk: Denne protokol er baseret på forskning tidligere offentliggjort i denne lab8.
- Forberede 3D organoid medier, som består af 50% Wnt-aircondition og 20% R-spondin aircondition medier.
- Forberede Wnt aircondition medier, kultur L celler i Wnt vækstmediet (Dulbecco ændrede Eagle Medium (DMEM), 10% føtal bovint serum (FBS), 1% Penicillin/streptomycin) i 7 dage, høst mediet, og filtrere ved hjælp af et 0,22 µm filter.
- Forberede R-spondin aircondition medier. Vokse en modificeret HEK-293T R-spondin secernerende cellelinie i R-spondin vækstmediet (Dulbecco ændrede Eagle Medium (DMEM), 10% føtal bovint serum (FBS), 1% Penicillin/streptomycin). Ved udlæg efter 2 h, ændre mediet fra disse celler til OPTIMEM vækst medium, 1% Penicillin/Streptomycin. Kultur cellerne i 7 dage. Derefter høste R-spondin aircondition medier og filtrere ved hjælp af et 0,22 µm filter.
Bemærk: Denne protokol har været offentliggjort tidligere og en mere detaljeret protokol finder du 6,7,8.
- Tø vækstfaktor reduceret, phenol rød-gratis basalmembranen matrix for 16t på isen ved 4 ° C. Indsamler væv i den iskolde Ca2 +/Mg2 +-gratis DBPS i en stor plastikbeholder. Gemme på isen indtil begyndelsen skridt 1.4.
Bemærk: Væv er indsamlet fra patienter, der gennemgår Ærme gastrektomi. - Brug af pincet, vaske væv kraftigt i et sterilt bæger indeholdende 100 mL Ca2 +/Mg2 +-gratis Dulbeccos phosphat bufferet saltvand (DPBS). Vask for ca 30 s eller indtil snavs og blodet er fjernet. Næste, ved hjælp af steril gaze, tørre væk de mukøse lag fra epitel.
- Brug store pincet, fast forstå muskel lag af væv og med kraft, skrabe væk epitel ved hjælp af den store buede hæmostatisk pincet. Indsamle de skrabede epitelial fragmenter i en steril, polystyren petriskål.
- Hakkekød den epitel væv til cirka 2,0 x 2,0 mm2 mellemstore fragmenter ved hjælp af barbermaskiner til at optimere væv fordøjelsen. Vaske væv fragmenter med Ca2 +/Mg2 + -gratis DBPS suppleret med antibiotika (Ca2 +/Mg2 + -gratis DPBS, 1% Penicillin/Streptomycin, 0,25 mg/mL Amphotericin B 10 mg/mL Gentamicin, 50 mg/mL Kanamycin), indtil vask er fri for blod. Udføre flere vask, hvis det er nødvendigt. Kassér off vask af omhyggeligt filtrering vask gennem en steril gaze i en affald bægerglas.
- Indsamle vasket fragmenter i en 125 mL glas runde bunden kolben med en 25 mm rør bar og pre varmede inkubation medier (basal media suppleret med 2 mM L-glutamin, 1% Penicillin/Streptomycin, 10 mM HEPES Buffer, 1 mg/mL Collagenase Type 1, 2 mg/mL cellekultur grade bovint serumalbumin). Forsegle rund bund kolben med gummi septa.
- Indsætte en 20 G spinal nål i septa og tilsluttes en ilt tank med gummi spuling. Indsæt silkepapir i slangen til at oprette et filter for at filtrere alle forurenende stoffer. Drej på ilt udstrømning på lav. Indsæt 10-15 udstrømning nåle i septa at undgå brud på septa.
- Sikre sæt op til en ring stå ved hjælp af skruetvinger og anbringes i et vandbad, kalibreret til 37 ° C med en røre pladen i 30-45 min. Når vævet har inkubere 15 minut, fjerne 50 µL af inkubation media og kontrollere visuelt for dissocierede kirtler. Hvis kirtler er ikke tætte eller har ikke separeret fra væv, forlade for en yderligere 5-10 min.
- Umiddelbart efter inkubering tilsættes 50 mL forvarmet DMEM/F12 til inkubation medier ved hjælp af en steril serologisk pipette eller ved at hælde direkte i inkubation blanding.
- Kirtel blandingen filtreres gennem en steril gaze i fire 50 mL konisk rør. Holde filtratet på isen til 15 min at tillade udpakkede kirtler til at bilægge til bunden af den koniske rør. Vær omhyggelig med ikke at forstyrre de udlignede kirtler, Fjern og kassér off top 40 mL af supernatanten ved hjælp af en serologisk pipette. Resuspend de resterende 10 mL i 10 mL af DPBS suppleret med antibiotika.
- Fordel blandingen jævnt i 5 mL celle kultur reagensglas. Der centrifugeres i 5 min. ved 65 x g ved 4 ° C og Fjern supernatanten ved hjælp af en pipette. Resuspenderes kirtel i optøede basalmembranen matrix ved hjælp af enten en pipette eller en 200 µL bred pipette tip. Bland indtil homogen.
Bemærk: Det er afgørende at udføre dette trin på isen og undgå polymerisering af basalmembranen matrix mens blanding. Desuden er det vigtigt at visuelt inspicere kirtel tæthed ved prøveudtagning for 50 µL. Optimal tæthed er ~ 70% confluency. - Næste, plade kirtler i 50 µL af basalmembranen matrix ved hjælp af wide-tippes pipette. Undgå at producere nogen bobler mens plating.
- At tillade basalmembranen matrix til at polymerisere, inkuberes i 10-15 min. ved 37 ° C. Hvis forkromning i en 12-godt kultur tallerken, tilsættes 1 mL af hFGO media (Advanced Dulbecco modificerede Eagle medium/F12 medium suppleret med 2mM L-glutamin, 1% Penicillin/Streptomycin, 0,25 mg/mL Amphotericin B 10 mg/mL Gentamicin, 50 mg/mL Kanamycin, 10 mM HEPES Buffer, 1 mM n-Acteylcystine, 1 x N2, 1 x B27, 50% Wnt-aircondition medium, 20% R-spondin-aircondition medium suppleret med 100 ng/mL ben morfogenetiske proteiner hæmmer, 1 nM gastrin, 50 ng/mL Epidermal vækstfaktor, 200 ng/mL Fibroblast vækstfaktor 10, 10 mM nicotinamid, og 10 µM Y-27632 ROCK hæmmer) pr. brønd. Hvis ikke ved hjælp af en 12-godt kultur plade tilføje nok medier at dykke basalmembranen matrix boble.
- Kultur celler ved 37 ° C i en 5% CO2 befugtet celle kultur inkubator. Ændre media hver 4-5 dage.
2. oprettelse af mus-afledte 3D gastrisk Fundic Organoids
Bemærk: Denne protokol har været tidligere udgivet 6. Tø basalmembranen matrix på isen og forberede alle reagenser før begyndelsen.
- Ofre mus ved hjælp af en metode, der er godkendt af forskningsinstitution hvor der udføres forskning. Fjerne maven fra mus og dissekere ifølge tidligere publicerede protokoller 6. Vask i 20 mL is koldt Ca2 +/Mg2 +-gratis Kønskirtler.
Bemærk: C57BL/6 mus, i alderen 8-10 uger, der bruges til fundic gastrisk organoid kulturer. Mus blev aflivet ved indånding af kuldioxid efterfulgt af manuel cervikal dislokation før maven fjernelse. - Strip muskel lag fra maven og nogen synlige blodkar som tidligere udgivet 6.
- Adskille fundus fra antrum og formaven ved hjælp af en steril barberblad. Cut fundus ved hjælp af små kirurgiske saks i fragmenter ca 2.0 x 2,0 mm. brug af pincet, indsamle fragmenter i en 15 mL konisk slange der indeholder EDTA inkubation buffer (Ca2 +/Mg2 +-gratis DPBS, 5 mM EDTA) og inkuberes ved 4 ° C i 2 timer med blid agitation.
- I en steril hætte, efterlade koniske rør og fragmenter på is til ca 5 min. Brug en pipette til at fjerne så meget inkubation buffer som muligt forlader fragmenter urørt. Der tilsættes 5 mL ryster buffer (1 g D-Sorbitol, 1,47 g saccharose i 100 mL Ca2 +/Mg2 +-gratis DPBS) og ryste i hånden med en kraft, for 2 min. tillader de store fragmenter til at bosætte sig og med hastværk, ved hjælp af en 1000 p pipette, fjerne de små fragmenter, der skal afregnes i det øverste lag.
- Spin de fjernede fragmenter i 5 min. ved 4 ° C på 65 x g.
- Samtidig undgå luftbobler, Fjern supernatanten, resuspend i matrixen basalmembranen og bland indtil det er homogen.
- Bruge et bredt tip pipette til plade basalmembranen matrix på 50 µL pr. brønd og derefter inkuberes ved 37 ° C i 20 min.
- Tilføje nok mFGO vækst medier (Advanced Dulbecco ændret Eagle medium/F12 medium suppleret med 2mM L-glutamin, 1% Penicillin/Streptomycin, 10 mM HEPES Buffer, 1mM n-Acteylcystine, 1 x N2, 1 x B27, 50% Wnt-aircondition medium, 20% R-spondin-aircondition medium suppleret med 100 ng/mL ben morfogenetiske proteiner hæmmer, 10 nM gastrin, 50ng/mL Epidermal vækstfaktor, 10 ng/mL Fibroblast vækstfaktor 10 og 10 µM Y-27632 ROCK hæmmer) at oversvømme boblen.
- Kultur celler ved 37 ° C, 5% CO2 befugtet celle kultur inkubator. Ændre medierne hver 4-5 dage.
3. kollagen belægning for 2D overførsel
Bemærk: Udføre alle procedurer i et sterilt vævskultur hood, medmindre andet er angivet. Begynd kollagen belægning 24 timer før du overfører 3D organoids til éncellelag. Holde rotte hale kollagen på isen og beskyttet mod lys. Kollagen overtrukne plader er god i op til 2 uger. Hvis ikke benytter de overtrukne plader straks, wrap plade i parafilm og opbevares ved 4 ° C indtil det skal bruges.
- Fortyndet rotte hale kollagen til 50 µg/mL ved hjælp af 20 mM eddikesyre.
- Tilstrækkeligt dække overfladen af godt med fortyndet kollagen. For et godt i en standard 12-godt plade, frakke med ca. 1 mL af kollagen. Lad natten ved stuetemperatur i en steril hætte.
- Vaskes to gange med 1 mL Ca2 +/Mg2 +-gratis DPBS pr. brønd og forlade udækket i 2 timer ved stuetemperatur i en steril hætte.
4. basalmembranen Matrix belægning for 2D overførsel
Bemærk: Udføre alle procedurer i et sterilt vævskultur hood, medmindre andet er angivet. Begynde basalmembranen matrix belægning 2 h før du overfører 3D organoids til éncellelag. Holde basalmembranen matrix på is. Overtrukne plader anvendes umiddelbart og kan opbevares i en længere periode.
- Fortynd basalmembranen matrix i en 15 mL konisk slange med en celle kultur grade vand på en 1:10 ratio. Fortynd på is.
- Ved hjælp af en pipette Tilsæt 100 µL fortyndede basalmembranen matrix til hver brønd med en standard 12-godt plade. Bruger en celle skraber, jævnt distribuere den fortyndede basalmembran matrix i hele godt for et jævnt lag.
- Der inkuberes ved 37 ° C i 1 time.
- Fjern de resterende vand ved hjælp af en pipette og tørt ved stuetemperatur i 1 time før overførsel af 3D organoids.
5. overdragelsen til 2D gastrisk epitelial celle encellelag af 3D m/hFGOs
- Efter 3D mus - eller menneske-afledte FGOs har været kulturperler for 6-7 dage, Begynd overførslen af 3D organoids til den 2D éncellelag.
Bemærk: Til hver brønd af et éncellelag kræves det anbefales at bruge 300 intakt organoids eller enkelte celler stammer fra 300 organoids. I et robust kultur forventes det at få ca 150 organoid/godt inden for en 12 godt kultur plade. - Sørg for plader belægges inden flytningen.
Bemærk: Basalmembranen matrix overtrukne plader har en gennemsigtig gel lag, dog, kollagen overtrukne plader vil ikke have nogen indlysende indikation af belægningen. - Løsne 3D basalmembranen matrix boble fra pladen direkte når der afpipetteres 1 mL sterilt Ca2 +/Mg2 +-gratis DBPS på midten af boblen.
- Ved hjælp af en pipette, indsamle basalmembranen matrix og organoid blandingen i celle kultur reagensglas. Indsamle i forholdet 2 basalmembranen matrix bobler pr tube. Der centrifugeres i 5 min på 40 x g og 4 ° C.
- Ved hjælp af et vakuum system, Fjern supernatanten og som meget basalmembranen matrix som muligt. Resuspend i 4 mL af Ca2 +/Mg2 +-gratis Kønskirtler, Fjern supernatanten, og Gentag 2 - 3 gange. For hele organoid transfer protocol, Fortsæt til trin 5.10. Fortsæt til trin 5.7 enkelt celle suspension-protokollen.
- Pre varm celle detachement løsning til 37 ° C og tilsættes 1 mL til hvert reagensglas. Forsigtigt blandes ved at vende rør eller pipettering op og ned med en pipette. Der inkuberes i 10 min. ved 37 ° C.
- Der tilsættes 2 mL af Ca2 +/Mg2 +-gratis DBPS direkte til hvert reagensglas.
- Bruge en 26 G kanyle og sprøjten blandingen 2 - 3 gange. Visuelt kontrollere for enkelte celler. Sprøjten 1-2 gange mere, hvis der stadig er organoids eller klynger af celler.
- Der centrifugeres ved 40 x g i 5 min. ved 4 ° C. Resuspenderes i 2D FGO medier (2D mus FGO vækstmediet: avanceret Dulbecco modificerede Eagle medium/F12 medium suppleret med 2mM L-glutamin, 10 mM Penicillin/Streptomycin, 10% føtalt kalveserum, 10 mM HEPES Buffer, 1 x N2, 1 x B27, suppleret med 10 nM gastrin, 50 ng/mL Epidermal vækstfaktor, 1 µM TGF-β inhibitor og 10 µM Y-27632 ROCK inhibitor. 2D menneskelige FGO vækstmediet: Avanceret Dulbecco modificerede Eagle medium/F12 medium suppleret med 2mM L-glutamin, 1% Penicillin/Streptomycin, 10 mM HEPES Buffer, 10% føtalt kalveserum, 10 mM nicotinamid, 1 x N2, 1 x B27, suppleret med 50 mg/mL Kanamycin, 50 ng/mL Epidermal vækst Faktor, og 10 µM Y-27632 ROCK inhibitor, 1 µM TGF-β-hæmmer).
- Plade ophvirvling på overtrukne plader. Inkuber plader ved 37 ° C. Udskift media hver 4 dage eller tidligere, hvis medierne bliver gul. Éncellelag kræver ca. 4 dage til form.
6. Skrab sår analyse ved hjælp af 2D gastrisk epitelcelle encellelag
- Éncellelag bruger et barberblad, scratch, når kulturen har nået 100% confluency.
- Fix encellelag med 3,7% formaldehyd i 15 min. ved stuetemperatur. Permeabilize med 0,5% nonionisk detergent/PBS i 20 min. ved stuetemperatur.
- Næste blokere encellelag med 2% æsel serum i 1 time ved stuetemperatur, og der inkuberes med 1:1000 fortynding af H+, K+-ATPase primære antistof natten over ved 4 ° C, vask med 0,1% nonionisk detergent/PBS og inkuberes med 1: 100 fortynding af æsel anti-mus 488 sekundær antistof og 10μg/mL af Hoechst cellekerner pletten i 1 time ved stuetemperatur.
- For at identificere de overflade slimhinderne pit celler i 2D menneske-afledte gastrisk éncellelag kulturer, pletten celler med 20 μg /mL af Ulex europaeus (UEAI) FITC-konjugat. Billede encellelag på en Konfokal mikroskop.
- Tage billeder af såret hvert par h. bunden vil re epithelialize mellem 24-48 h afhængigt af kvaliteten af éncellelag og variation mellem patienter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Organoids blev afledt fra corpus/kroppen af menneskelige eller fundus i mus mave væv (figur 1A). Efter enten collagenase eller EDTA fordøjelsen af menneske - eller mus-afledte mave væv henholdsvis er kirtler indlejret i basalmembranen matrix og kulturperler i 6-7 dage (figur 1A). Figur 1B viser dannelsen af menneske-afledte gastrisk organoids (huFGOs) der er derefter overført til en gastrisk epitelial éncellelag (huGEM) på basalmembranen matrix-belagt kammer dias. Efter 4 dage af kultur, blev sammenflydende huGEMs brugt til scratch sår assays (figur 1B). Billeder indsamlet fra en tid bortfalder analyse af huGEM viste sår lukning inden for kulturen over en periode på 24 timer (figur 2).
HuGEMs blev fundet, til at udtrykke de store celle lineages fundet i native mave-væv. Immunfluorescens farvning afslørede udtryk for en polariseret E cadherin-positive éncellelag, som bestod af parietale (figur 3B, C) og overfladen slimhinderne (figur 3B, D) celler. PCR analyse ved hjælp af RNA indsamlet fra disse encellelag bekræftet udtryk af parietal og overflade mukøse celler, ud over chef og mukøse hals celler (figur 3). Konfluerende huGEMs udtrykte også få prolifererende celler (figur 3F). Analyse af disse store celle lineages i scratch sår Analysen viste vedvarende udtryk af parietal, chef, slimhinderne hals overflade mukøse celler over en 24 timers periode (figur 4A, B). Kollektivt, viser disse data brugen af huGEMs som roman kultur system at studere gastrisk regenerering i vitro.
Figur 1: Generation af menneske-afledte gastrisk organoids (huFGO) og primære gastrisk epitelial encellelag (huGEM). (A) repræsentative billeder af menneskelige gastrisk væv og mus mave bruges til at generere kirtler for organoid kultur. Skitseret område angiver fundic område af musen maven. (B) Generation af menneske-afledte gastrisk organoids (huFGOs), der bruges til kulturen af menneske-afledte gastrisk epitelial encellelag (huGEMs). Repræsentativt billede af huGEM efter bunden viser det sårede område. Skalalinjen = 500 μm venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Scratch-sår assay. Repræsentative billeder indsamlet fra en tid bortfalder eksperiment ved hjælp af huGEM 0, 8, 16 og 24 timer efter bunden sår. Skalalinjen = 500 μm venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: udtryk for store celle lineages i huGEM kulturer. Immunfluorescens farvning af huGEM kulturer demonstrere udtryk for (A) E cadherin (Ecad, red), overflade mukøse celler (UEAI, grønne) og kerner (Hoechst, blå), og (B) E cadherin (Ecad, red), parietalcellerne (HK, grønne) og kerner () Hoechst, blå). Separate kanaler er vist i (C) og (D). (E) RT-PCR blev udført ved hjælp af RNA ekstraheret fra huGEMs til udtryk for H+K+-ATPase (ATP4a), pepsinogen C (PgC), MUC5AC og MUC6. (F) Proliferating celler inden for den huGEM kultur bestemmes af EdU (rød) optagelsen. Skalere bar (A-D) = 50 μm, skala bar (F) = 100 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: ændringer i celle lineage udtryk i bunden-sår assay. Immunfluorescens farvning af huGEM kulturer demonstrere udtryk for E cadherin (Ecad, red) eller overflade mukøse celler (UEAI, grønne) eller parietalcellerne (HK, grønne) og kerner (Hoechst, blå) ved hjælp af dias indsamlet fra huGEM kulturer 0, 8, 16 og 24 timer post Scratch-sår. Bkgrd = baggrund farvning af basalmembranen matrix på dias. XY-akse skalalinjen fra 0 - 400 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Musen 3D medier | Stamopløsningen | Arbejder koncentration |
| nAcetylcysteine | Pulver | 1 mM |
| Gastrin | 10 ΜM | 10 nM |
| EGF | 500 µg/mL | 50 ng/mL |
| Noggin | 100 µg/mL | 100 ng/mL |
| FGF10 | 100 µg/mL | 100 ng/mL |
| YCMD | 10 mM | 10 ΜM |
| B27 | 50 x | 1 x |
| N2 | 100 x | 1 x |
| Pen/Strep | 1 M | 10 mM |
| HEPES | 1 M | 10 mM |
| Glutamax | 200 mM | 2 mM |
| WNT | 50% v/v | |
| R-Spondin | 10% v/v |
Tabel 1: Mus 3D medier komponenter.
| Musen 2D medier | Stamopløsningen | Arbejder koncentration |
| FCS | 100% | 10% |
| YCMPD | 10 mM | 10 ΜM |
| Gastrin | 10 ΜM | 10 nM |
| EGF | 500 µg/mL | 50 ng/mL |
| B27 | 50 x | 1 x |
| N2 | 100 x | 1 x |
| Pen/Strep | 1 M | 10 mM |
| HEPES | 1 M | 10 mM |
| Glutamax | 200 mM | 2 mM |
| TGF-β-hæmmer | 10 mM | 1 ΜM |
Tabel 2: Musen 2D medier komponenter.
| Menneskelige 3D medier | Stamopløsningen | Arbejder koncentration |
| Nicotinamid | Pulver | 10 mM |
| nAcetylcysteine | Pulver | 1 mM |
| Gastrin | 10 ΜM | 1 nM |
| EGF | 500 µg/mL | 50 ng/mL |
| Noggin | 100 µg/mL | 100 ng/mL |
| FGF10 | 100 µg/mL | 200 ng/mL |
| YCMD | 10 mM | 10 ΜM |
| B27 | 50 x | 1 x |
| N2 | 100 x | 1 x |
| Pen/Strep | 1 M | 10 mM |
| HEPES | 1 M | 10 mM |
| Glutamax | 200 mM | 2 mM |
| Kanamycin | 1 M | 10 mM |
| Amphotericin B/phosphatbufferet | 125 µg/mL | 1 mM |
| WNT | 50% v/v | |
| R-Spondin | 10% v/v |
Tabel 3: Menneskelige 3D medier komponenter.
| Menneskelige 2D medier | Stamopløsningen | Arbejder koncentration |
| FCS | 100% | 10% |
| YCMPD | 10 mM | 10 ΜM |
| Gastrin | 10 ΜM | 1 nM |
| EGF | 500 µg/mL | 50 ng/mL |
| B27 | 50 x | 1 x |
| N2 | 100 x | 1 x |
| Pen/Strep | 1 M | 10 mM |
| HEPES | 1 M | 10 mM |
| Glutamax | 200 mM | 2 mM |
| TGF-β-hæmmer | 10 mM | 1 ΜM |
| Nicotinamid | Pulver | 10 mM |
| Kanamycin | 1 M | 10 mM |
Tabel 4: Menneskelige 2D medier komponenter.
| Eksperimentelle Problem | Fejlfinding Tip |
| Encellelag undlader at form fra organoids | 1) optimale dyrkningsbaserede betingelser for denne protokol varierer mellem eksperimentelle behov. Menneskelige og mus encellelag afledt af organoids bør være kulturperler ved hjælp af fortyndet basalmembranen matrix, når du bruger glas eller plastik kultur retter. Dog rotte hale kollagen er optimal til éncellelag forsøg på mus eller menneskelig oprindelse, der kræver polyester membran indsætter. 2) optimale dyrkningsbaserede betingelser varierer afhængigt af den eksperimentelle sæt op. Kulturer ved hjælp af enkelt cellesuspension er ideelt kulturperler med 3D FGO medier, mens intakt organoids er kulturperler med 2D FGO medier. |
| Encellelag afledt af alderen patienter (> 55 år) eller mus (> 18 måneder) har undladt at vokse og nå confluency | Hvis du bruger mave væv indsamlet fra alderen mus (> 18 måneder) eller patienter (> 55 år) tætheden af organoids anvendes til at frembringe af éncellelag bør fordobles, eftersom vækst effektiviteten af organoids er faldet. |
| Organoids undlader at form fra kirtler | Det anbefales at frisk (nyligt købt hvis det er muligt) gastrin bruges. Brug frisk igen suspenderede gastrin hver 4 måned. |
| Organoids undlader at vedhæfte og danne encellelag | Sikre, at effektiv fjernelse af basalmembranen matrix er opnået efter høst organoids for overførsel til kultur plader til monolag. |
| Kulturer afledt af alderen patienter (> 55 år) eller mus (> 18 måneder) mislykkes | Perioder fordøjelse og inkubering 15-30 min indledende inkubation efterfulgt af 5 min. mellemrum inkubation som nødvendigt er tilstrækkelig. Det skal bemærkes, at patienter større end 55 år kan have kirtler, der er mere let adskilles og derfor kræver mindre fordøjelsen. Ligeledes har FGOs stammer fra ældre patienter vises langsommere vækst tid og øget følsomhed for centrifugering. For at opnå de bedste resultater, begrænse eventuelle overskydende centrifugering, når du arbejder med alderen væv og erstatte medier i tide. |
Tabel 5: fejlfindingstip. Der opstod problemer og anbefalede resolutioner for optimal etablering og kultur af human eller mus gastrisk monolag.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den nuværende protokol detaljer oprettelse af human - og mus-afledte gastrisk epitelial encellelag, der kan bruges til bunden-sår assays. Protokollen afhænger af begrebet bopæl stamceller isoleret fra primære menneskelige (eller mus) væv og er en modificeret protokol først udgivet af Schlaermann al.7. Vi har især optimeret protokol her til at etablere en sammenflydende og polariseret gastrisk epitelial éncellelag udtrykt som store celle slægter, som kan findes inden for gastrisk epitel i vivo. Mavesår reparation er en kompleks proces, der involverer væv re epithelialization, regenerering og spredning9,10,11. Især har vores laboratorium rapporteret, at regenerering af gastrisk epitel falder sammen med fremkomsten af spasmolytiske polypeptid/kløverblad faktor (TFF) 2-udtrykker metaplasi (SPEM) på såret margen inden for regenererende gastrisk kirtler 12,13. SPEM er defineret som transdifferentiation for den øverste celle afstamning i en SLIM celle metaplasi14 , der kommer med skade og forsvinder når slimhinden vender tilbage til sin normale cellulære sammensætning12. For at studere sådan mekanisme i en in vitro- system, er det således vigtigt at store celle slægter, som de ledende celler, er til stede i kulturen.
Brugen af bunden-sår assays har været flittigt brugt til studiet af reparation og regeneration, og indtil for nylig, gastrisk kræft cellelinjer var brugte1,2,3,4. Mens grundlæggende mekanismer er blevet afsløret ved hjælp af gastrisk kræft celler linjer, disse kulturer er forvandlet og mangler den cellulære mangfoldighed af indfødte mave-væv. HuGEMs er vist at bevare en polariseret og forskellige cellulære sammensætning, der nøje sammenfatter gastrisk epitel in vivo. Derudover nåede efter confluency huGEM kulturer kan opretholdes i op til en måned i optimale betingelser. Udvidet kulturer mulighed for langsigtet eksperimenter. Således, fremtidige anvendelser af den huGEMs, der kan betragtes som omfatter éncellelag/immun celle Co kulturer og langsigtet eksperimenter for studiet af Helicobacter pylori patogenese.
Der er vigtige tekniske aspekter at bemærke i den nuværende protokol. Den første tekniske punkt er, at valget af basalmembranen komponent varierer afhængigt af kultur celleoverfladen, der skal bruges til forsøg. For at sikre, at optimale éncellelag betingelser er nået, anbefales det, at kollagen bruges når eksperimenter med encellelag kræver plader med polyester membran skær. Men hvis éncellelag eksperimenter kræver glas eller plastik kultur overflader, fortyndede basalmembranen matrix er det optimale valg af belægning. Andet, tætheden af organoids kræves for at nå en sammenflydende éncellelag skal justeres afhængigt af alder af patienten som gastrisk væv er indsamlet. For væv indsamlet fra alderen mus (> 18 måneder) eller patienter (> 55 år), organoid massefylde anvendes bør øget dobbelt når overførsel til en éncellelag på grund af nedsat vækst kapacitet i alderen individer. Under fordøjelsen og inkubering menneskeligt væv stammer fra ældre patienter, kirtler kan være mere modtagelige for dissociation og centrifugering og derfor: 1) bør være centrifugeres som sparsomt som muligt, 2) medier erstattet flittigt, og 3) under fordøjelsen inkubationer 15 til 30 minutter med trinvis digestions 5 minutter bagefter vil mindske sandsynligheden for over fordøjelsen. Endelig, når danner encellelag fra organoid-afledte enkelt celle suspensioner, 3D FGO medier er mest optimalt for ordentlig dannelsen af encellelag, hvorimod når dyrkning fra intakt organoids, 2D FGO medier er blevet observeret for at give den højeste effektivitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af NIH (NIDDK) 5 R01 DK083402-07 yde (YZ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced Dulbecco's modified Eagle/F12 medium (basal media) | Life Technologies | 12634-010 | |
| GlutaMAX (L-glutamine) | Life Technologies | 25030-081 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Scientific | SV30010 | |
| Amphotericin B/Gentamicin | Thermo Scientific | R01510 | |
| Kanamycin | Thermo Fisher | RO1510 | |
| HEPES Buffer | Sigma Aldrich | H0887 | |
| n-Acetylcystine | Sigma Aldrich | A9165 | |
| N2 | Life Technologies | 17502-048 | |
| B27 | Life Technologies | 12587-010 | |
| BMP Inhibitor (Noggin) | Pepro Tech | 250-38 | |
| Gastrin | Tocris | 3006 | |
| EGF | Pepro Tech | 315-09 | |
| FGF10 | Pepro Tech | 100-26 | |
| Nicotinamide | Sigma Aldrich | N0636 | |
| Y-27632 ROCK Inhibitor | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| TGF-β Inhibitor | Tocris | 2939 | |
| Ca2+/Mg2+ -free DPBS | Fisher | 21-031CV | |
| Dulbecco's modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 12634-010 | |
| Fetal Bovine Serum | FBS | ||
| OPTIMEM | Invitrogen | ||
| 0.22µM filter | Fisher | 099-720-004 | |
| 37 °C Water Bath | |||
| Collagenase Type 1 | Worthington | LS004214 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9418 | |
| Kimwipes (tissue paper) | Fischer Scientific | 06-666C | |
| 125 mL round bottom flask | |||
| 1 in (25 mm) stir bar | |||
| Rubber Septa | |||
| Sterile Gauze | |||
| Stir Plate | |||
| Ring Stand | |||
| Ring Stand Clamps | |||
| Sterile petri dish | |||
| 18 G needles of 1.5 in length | Thermo Fisher | 305196 | |
| 20 G spinal needles of 3.5 in length | Thermo Fisher | 405182 | |
| 12-well cell culture treated plate | Midwest Scientific | 92012 | |
| Growth Factor Reduced, Phenol Red-free MatrigelTM (Basement membrane matrix) | Fisher | CB-40230C | |
| Sterile Razor Blades | |||
| Wide-tip tweezers | |||
| Curved Hemostatic Forceps | |||
| 200 µL wide pipette tips | Thermo Fisher | 02-707-134 | |
| 5 mL cell culture test tubes | Fisher | 14-956-3C | |
| Oxygen Tank with rubber hosing | |||
| 1 g D-Sorbitol | |||
| Sucrose | Fisher | SS-500 | |
| Dissecting microscope | |||
| Dissecting Tray | |||
| Rocking Table | |||
| Rat Tail Collagen Type 1 | Life Technologies | A10483-01 | |
| Cell culture grade glacial acetic acid | Fisher | A38-212 | |
| Cell culture grade water | Corning | 25-055-CV | |
| 2-well chamber slide | Thermo Fisher | 155380 | |
| 12-well Transwell (polyester membrane inserts) | Corning | 3460 | |
| Cell scraper | Corning | 353086 | |
| Accutase (cell detachment solution) | Stemcell Technologies | 7920 | |
| 263/8 G syringe | Thermo Fisher | 309625 | |
| Razor blade | |||
| L Cells | L cells, a Wnt3a producing cell line, were received as a gift from Dr. Hans Clevers (Hubrecht Institute for Developmental Biology and Stem Cell Research, Netherlands). | N/A | |
| HEK-293T Rspondin secreting cells | A modified HEK-293T R-spondin secreting cell line was obtained from Dr. Jeff Whitsett (Section of Neonatology, Perinatal and Pulmonary Biology, Cincinnati Children's Hospital Medical Centre and The University of Cincinnati College of Medicine, Cincinnati, USA ). | N/A | |
| HK-ATPase Primary Antibody | Invitrogen | SC-374094 | |
| E-Cadherinn | SantaCruz | sc-59778 | |
| UEA1 | Sigma Aldrich | L9006 | |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher | H3570 | |
| Alexafluor 488 secondary antibody (Donkey anti-mouse 488 secondary antibody) | ThermoFisher Scientific | R37114 |
References
- Nagy, T. A., et al. Helicobacter pylori regulates cellular migration and apoptosis by activation of phosphatidylinositol 3-kinase signaling. J Infect Dis. 199 (5), 641-651 (2009).
- Mnich, E., et al. Impact of Helicobacter pylori on the healing process of the gastric barrier. World J Gastroenterol. 22 (33), 7536-7558 (2016).
- Zhang, Y., et al. Bm-TFF2, a toad trefoil factor, promotes cell migration, survival and wound healing. Biochem Biophys Res Commun. 398 (3), 559-564 (2010).
- Crabtree, J. Role of cytokines in pathogenesis of Helicobacter pylori-induced mucosal damage. Dig Dis Sci. 43 (Supplement), 46S-53S (1998).
- Riahi, R., Yang, Y., Zhang, D. D., Wong, P. K. Advances in wound-healing assays for probing collective cell migration. J Lab Autom. 17 (1), 59-65 (2012).
- Zhang, M., Li, H., Ma, H., Qin, J. A simple microfluidic strategy for cell migration assay in an in vitro wound-healing model. Wound Repair Regen. 21 (6), 897-903 (2013).
- Schlaermann, P., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. 65 (2), 202-213 (2016).
- Bertaux-Skeirik, N., et al. CD44 plays a functional role in Helicobacter pylori-induced epithelial cell proliferation. PLoS Pathog. 11 (2), e1004663 (2015).
- Tarnawski, A. S. Cellular and molecular mechanisms of gastrointestinal ulcer healing. Dig Dis Sci. 50 (Suppl 1), S24-S33 (2005).
- Wright, N. A., Pike, C., Elia, G. Induction of a novel epidermal growth factor-secreting cell lineage by mucosal ulceration in human gastrointestinal stem cells. Nature. 343, 82-85 (1990).
- Wright, C. L., Riddell, R. H. Histology of the stomach and duodenum in Crohn's disease. Am J Surg Pathol. 22 (4), 383-390 (1998).
- Engevik, A. C., et al. The Development of Spasmolytic Polypeptide/TFF2-Expressing Metaplasia (SPEM) During Gastric Repair Is Absent in the Aged Stomach. CMGH. , In Press (2016).
- Bertaux-Skeirik, N., et al. CD44 variant isoform 9 emerges in response to injury and contributes to the regeneration of the gastric epithelium. Journal of Pathology. 242 (4), 463-475 (2017).
- Nam, K. T., et al. Mature chief cells are cryptic progenitors for metaplasia in the stomach. Gastroenterology. 139 (6), 2028-2037 (2010).
