Summary
Nous décrivons ici un protocole pour l’établissement et la mise en culture-anthropique et souris 3 Dimensions (3D) organoïdes gastrique et la méthode de transfert d’organoïdes 3D à une monocouche 2 dimensions. L’utilisation de la couche épithéliale gastrique comme un nouveau dosage zéro-plaie pour études de régénération est également décrite.
Abstract
Des études in vitro de cicatrisation gastrique implique généralement l’utilisation de lignées cellulaires de cancer de l’estomac lors d’un essai de zéro-plaie de la prolifération cellulaire et migration. Une restriction critique de ces tests, cependant, est leur assortiment homogène des types cellulaires. La réparation est un processus complexe qui exige de l’interaction de plusieurs types de cellules. Par conséquent, afin d’étudier une culture dépourvue de sous-types cellulaires, est une préoccupation qui doit être surmontée si l'on veut comprendre le processus de réparation. Le modèle organoïde gastrique peut atténuer ce problème, auquel cas la collection hétérogène de types cellulaires reflète fidèlement celle de l’épithélium gastrique ou d’autres tissus natifs in vivo. Montré ici est un roman, un essai in vitro zéro-plaie avec dérivée de l’homme ou la souris organoïdes 3 dimensions qui peuvent ensuite être transférées à une monocouche épithélium gastrique soit organoïdes intact ou comme une suspension monocellulaire de dissocié organoïdes. L’objectif du protocole est d’établir des monocouches gastriques épithéliales dérivées organoïde qui peuvent être utilisés dans un système nouveau dosage zéro-plaie pour étudier la régénération gastrique.
Introduction
L’utilisation des dosages de zéro-plaie est une méthode populaire pour étudier la réparation et la régénération1,2,3,4,5,6. La méthodologie proposée peut servir à étudier spécifiquement la régénération gastrique et la colonisation de l’Helicobacter pylori . Dans le passé, lignées cellulaires de cancer de l’estomac ont été utilisées comme un moyen d’étudier l' Helicobacter pylori (H. pylori) infection1,2 et jusqu'à cancer gastrique récemment lignées cellulaires comme les cellules AGS étaient favorisés1 ,2,3,4. Une des limites des cultures de cellules de cancer gastrique est leur incapacité à récapituler la diversité cellulaire de l’épithélium gastrique. Pour tenter de combler cette lacune, démontré qu'ici, c’est la création et le transfert de primaire-origine humaine et souris 3-dimensional fundus gastrique organoïdes (FGOs) à une monocouche épithéliale gastrique pour blessure des dosages guérison basée sur une méthode modifiée tout d’abord décrite par Schlaermann et al. 7 nous démontrons que des monocouches épithéliales gastriques dérivés cisaillement 3D FGOs gastriques ou FGO-dérivés des cellules individuelles conservent une composition cellulaire polarisée qui représente fidèlement celle de l’épithélium gastrique in vivo. Étant donné que les lignées cellulaires de cancer de l’estomac ne démontrent pas la composition de la cellule qu'affiche cette technique, le protocole actuel a un avantage sur les méthodes alternatives zéro-plaie. Cette méthodologie a été optimisée par lequel monocouches peuvent être établie à partir d’organoïdes entier ou d’une suspension monocellulaire d’organoïdes dissocié et plaqué à l’aide d’une matrice de la membrane basale ou collagène-revêtement. L’objectif général du présent protocole est d’établir qu'un organoïde provenant des cultures monocouches épithéliales gastriques pour un dosage de guérison de blessure de roman.
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Protocol
Pour éviter toute contamination, effectuer le protocole dans son intégralité dans une hotte de vitroplants stérile. Les tissus humains fundus ont été recueillies auprès de patients subissant une gastrectomie selon le protocole approuvé de la CISR de l’Université de Cincinnati (numéro de protocole de la CISR : 2015-4869).
Toutes les études sur les souris ont été approuvés par l’Université de Cincinnati Institutional Animal Care et utilisation Comité (IACUC) qui maintient une installation Association américaine d’évaluation et d’accréditation de laboratoire Animal Care (AAALAC).
1. établissement d’origine humaine 3D organoïdes fundus gastrique
Remarque : Ce protocole repose sur les recherches publiées antérieurement dans ce laboratoire8.
- Préparer les médias organoïde 3D qui se compose de 50 % conditionnée Wnt et 20 % R-spondin conditionné médias.
- Préparer les milieux Wnt conditionné, culture les cellules L de milieu de croissance Wnt (Dulbecco modifiée milieu Eagle (DMEM), 10 % sérum fœtal (SVF), 1 % pénicilline/streptomycine) pendant 7 jours, récolter le milieu et filtrer à l’aide d’un filtre de 0,22 µm.
- Préparer les médias R-spondin conditionné. Cultiver une lignée de cellules sécrétrices de HEK-293 t R-spondin modifiée dans le milieu R-spondin (Dulbecco modifiée milieu Eagle (DMEM), 10 % sérum fœtal (SVF), 1 % pénicilline/streptomycine). Sur la pièce jointe après 2 h, changer le support de ces cellules à croissance OPTIMEM moyennes, 1 % pénicilline/streptomycine. Les cellules de la culture pendant 7 jours. Récolter les médias R-spondin conditionné, puis filtrer à l’aide d’un filtre de 0,22 µm.
Remarque : Ce protocole a été publié précédemment et pour un protocole plus détaillé voir 6,7,8.
- Décongeler la facteur de croissance réduite et sans rouge de phénol membrane basale matrice pendant 16 h sur la glace à 4 ° C. Recueillir le tissu dans le Ca de glace froide2 +/Mg2 +-libre SPD dans un grand récipient en plastique. Conserver sur la glace jusqu'à l’étape de début 1.4.
NOTE : Le tissu est récolté dans les patients subissant une gastrectomie. - À l’aide de pinces, laver le tissu vigoureusement dans un bécher stérile contenant 100 mL Ca2 +/Mg2 +-libre Phosphate Buffered Saline (SPD de Dulbecco). Laver pendant environ 30 s ou jusqu'à ce que les débris et le sang a été supprimé. Ensuite, à l’aide de gaze stérile, essuyer la couche muqueuse de l’épithélium.
- À l’aide de grandes pinces, fermement saisir la couche musculaire des tissus et avec force, grattez l’épithélium à l’aide de la grande pince hémostatique incurvée. Recueillir les fragments épithéliales grattées dans une boîte de Pétri stérile, en polystyrène.
- Émincer le tissu épithélial en environ les fragments de2 taille 2.0 x 2.0 mm à l’aide de rasoirs pour optimiser la digestion des tissus. Laver les fragments tissulaires avec Ca2 +/Mg2 + -libre SPD additionné d’antibiotiques (Ca2 +/Mg2 + -libre SPD, 1 % pénicilline/streptomycine, 0,25 mg/mL amphotéricine B 10 mg/mL de gentamicine, kanamycine de 50 mg/mL), jusqu'à ce que le lavage est exempt de sang. Effectuer plusieurs lavages si nécessaire. Jeter hors du lavage en filtrant soigneusement le lavage à travers une gaze stérile dans un bécher de déchets.
- Lavé recueillir des fragments dans un verre de 125 mL avec 25 mm remuer bar et milieu d’incubation préchauffé ballon à fond rond (milieu de base additionné de 2 mM de L-glutamine, 1 % pénicilline/streptomycine, 10 mM un tampon HEPES, 1 mg/mL collagénase de Type 1, culture de cellules de 2 mg/mL qualite de l’albumine sérique Bovine). Sceller le ballon à fond rond avec septa caoutchouc.
- Insérer une aiguille spinale de 20 G dans le septum et connectez-le à un réservoir d’oxygène avec tuyau en caoutchouc. Pour filtrer les contaminants, insérer le tube pour créer un filtre papier de soie. Allumez l’écoulement de l’oxygène à faible température. Emmancher 10-15 sorties dans les septums pour éviter la rupture des septums.
- Fixer le jeu vers le haut à un support de bague à l’aide de pinces et placez-le dans un bain-marie étalonné par rapport à 37 ° C avec une plaque de remuer pendant 30-45 min. Après que le tissu a été incubant pendant 15 min, retirer 50 µL de milieu d’incubation et vérifier visuellement les glandes dissociées. Si les glandes ne sont pas denses ou n’ont pas séparés du tissu, laisser pendant un 5-10 min supplémentaire.
- Immédiatement après l’incubation, ajouter 50 mL préchauffé DMEM/F12 au milieu d’incubation à l’aide d’une pipette stérile sérologique ou en versant directement dans le milieu d’incubation.
- Filtrer le mélange de la glande à travers une gaze stérile dans quatre tubes conique de 50 mL. Conserver le filtrat sur la glace pendant 15 minutes afin de permettre des extraits de glandes se déposer au fond du tube conique. Veillez à ne pas déranger les glandes sédentarisés, enlever et jeter du haut 40 mL du surnageant à l’aide d’une pipette sérologique. Remettre en suspension les restants de 10 mL dans 10 mL de SPD additionné d’antibiotiques.
- Répartir le mélange dans 5 mL cell culture des éprouvettes. Centrifuger pendant 5 min à 65 x g à 4 ° C et retirer le surnageant soigneusement à l’aide d’une pipette. Resuspendre le culot de glande dans la matrice décongelés membrane basale en utilisant une pipette ou un 200 µL large de pipette. Mélanger jusqu'à homogénéité.
Remarque : Il est crucial d’effectuer cette étape sur la glace et éviter la polymérisation de la matrice de la membrane basale tout en mélangeant. En outre, il est important d’inspecter visuellement la densité de la glande par échantillonnage pour 50 µL. La densité optimale est confluence d’environ 70 %. - Ensuite, plaque les glandes dans 50 µL de la membrane basale de matrice à l’aide d’une pipette à embout large. Éviter les éventuelles bulles tout en placage.
- Pour permettre la matrice de la membrane basale à polymériser, incuber pendant 10-15 min à 37 ° C. Si électrodéposition dans une plaque de culture de 12 puits, ajouter 1 mL de médias hFGO (milieu de moyenne/F12 Eagle modifié de Dulbecco Advanced additionné de 2mM de L-glutamine, 1 % pénicilline/streptomycine, 0,25 mg/mL amphotéricine B 10 mg/mL de gentamicine, 50 mg/mL kanamycine, 10 mM HEPES Tampon, n-Acteylcystine de 1 mM, 1 x N2, 1 x B27, moyen de Wnt-conditionné 50 %, 20 % R-spondin-conditionné additionné à 100 ng/mL d’os inhibiteur de la protéine morphogénétique 1 facteur de croissance fibroblastique 200 ng/mL 10, 10, 50 ng/mL de facteur de croissance épidermique, gastrine nM mM Nicotinamide et 10 µM Y-27632 ROCK inhibiteur) / puits. Si ce n’est pas le cas, à l’aide d’une plaque de culture de 12 puits ajouter assez médias de submerger la bulle de matrice de membrane basale.
- Les cellules à 37 ° C dans une étuve 5 % CO2 humidifié cell culture la culture. Modifier les médias tous les 4-5 jours.
2. dégager les dérivés de souris 3D organoïdes fundus gastrique
Remarque : Ce protocole a été publiée précédemment 6. Décongeler la matrice de la membrane basale sur la glace et de préparer tous les réactifs avant de commencer.
- Sacrifier la souris à l’aide d’une méthode approuvée par l’institution de recherche où la recherche est effectuée. Retirer l’estomac de la souris et disséquer selon les protocoles publiés précédemment 6. Laver à 20 mL glace froid Ca2 +/Mg2 +-libre SPD.
Remarque : Souris C57BL/6, âgés de 8 à 10 semaines, sont utilisés pour les cultures de fundus gastrique organoïde. Souris ont été euthanasiés par inhalation de dioxyde de carbone, suivie d’une dislocation cervicale manuelle avant l’enlèvement de l’estomac. - Enlever la couche musculaire de l’estomac et les vaisseaux sanguins visibles comme précédemment publié 6.
- Séparer le fond de l’antre et du préestomac à l’aide d’une lame de rasoir stérile. Fond de œil coupée à l’aide de petits ciseaux chirurgicaux en fragments environ 2,0 x 2,0 mm. à l’aide forceps, recueillir les fragments dans un tube conique 15 mL contenant du tampon d’incubation EDTA (Ca2 +/Mg2 +-libres SPD, 5 mM EDTA) et incuber à 4 ° C pendant 2 h avec agitation douce.
- Sous une hotte stérile, laisser le tube à fond conique et fragments sur la glace pendant environ 5 min. utilisent une pipette pour enlever autant tampon d’incubation que possible, laissant des fragments intact. Ajouter 5 mL de secouer le tampon (1 g D-Sorbitol, saccharose 1,47 g dans 100 mL Ca2 +/Mg2 +-libre SPD) et agiter à la main avec une force de 2 min. laisser les grands fragments de s’installer et avec précipitation, à l’aide d’une pipette de 1000P, enlever les petits fragments qui restent à régler dans la couche supérieure.
- Faites tourner les fragments enlevés pendant 5 min à 4 ° C à 65 x g.
- Tout en évitant les bulles d’air, retirer le surnageant, resuspendre dans la matrice de la membrane basale et mélanger jusqu'à ce qu’elle soit homogène.
- Utiliser une pipette de pointe large pour la matrice de la membrane basale à 50 µL / puits de la plaque et puis incuber à 37 ° C pendant 20 min.
- Ajouter suffisamment milieux de croissance mFGO (Advanced Dulbecco modification Eagle moyen/F12 additionné à 2mM de L-glutamine, 1 % pénicilline/streptomycine, 10 mM un tampon HEPES, 1mM n-Acteylcystine, 1 x N2, 1 x B27, moyen de Wnt-conditionné 50 %, 20 % R-spondin-conditionné un milieu additionné de 100 inhibiteur de protéine morphogénétique osseuse ng/mL, 10 nM gastrine, 50 ng/mL de facteur de croissance épidermique, facteur de croissance fibroblastique 10 ng/mL 10 et inhibiteur de Y-27632 ROCK 10 µM) pour submerger la bulle.
- La culture des cellules à 37 ° C, 5 % CO incubateur de culture de2 cellules humidifié. Modifier les médias tous les 4-5 jours.
3. collagène revêtement pour transfert 2D
Remarque : Effectuez toutes les procédures dans une hotte de vitroplants stérile sauf indication contraire. Commencer le collagène revêtement 24h avant le transfert du organoïdes 3D à la monocouche. Garder le collagène de queue de rat sur la glace et protégés de la lumière. Plaques de collagène enduit sont bonnes pendant 2 semaines. Si ne pas immédiatement d’utiliser les plaques revêtues, enrouler la plaque parafilm et conserver à 4 ° C jusqu'à ce que nécessaire.
- Diluer le collagène de queue de rat à 50 µg/mL à l’aide de l’acide acétique 20 mM.
- Suffisamment compte de la surface du puits avec collagène dilué. Pour un puits dans une plaque de 12 puits standard, enduisez d’environ 1 mL de collagène. Laisser une nuit à température ambiante dans une hotte stérile.
- Laver deux fois avec 1 mL Ca2 +/Mg2 +-libre SPD / puits et laisser à découvert pendant 2 h à température ambiante dans une hotte stérile.
4. Membrane basale matrice revêtement pour transfert 2D
Remarque : Effectuez toutes les procédures dans une hotte de vitroplants stérile sauf indication contraire. Commencer la matrice de la membrane basale revêtement 2 h avant de les transférer organoïdes 3D à la monocouche. Garder la matrice de la membrane basale sur glace. Plaques de revêtement doivent être utilisés immédiatement et ne peuvent être stockés pendant une période prolongée de temps.
- Diluer la matrice de la membrane basale dans un tube conique de 15 mL avec une eau de qualité de culture cellulaire à un 01:10 ratio. Diluer sur la glace.
- À l’aide d’une pipette ajouter 100 µL de matrice de membrane de sous-sol dilué dans chaque puits d’une plaque de 12 puits standard. À l’aide d’un grattoir de cellules, répartir uniformément la matrice dilué membrane basale dans le puits pour une couche uniforme.
- Incuber à 37 ° C pendant 1 h.
- Enlever l’eau résiduelle à l’aide d’une pipette et sécher à température ambiante pendant 1 h avant le transfert du organoïdes 3D.
5. transfert de m/hFGOs 3D à 2D monocouches de cellules épithéliales gastriques
- Après 3D souris - ou anthropique FGOs ont été cultivées pendant 6 à 7 jours, commencer le transfert d’organoïdes 3D à la 2D monocouche.
NOTE : Pour chaque puits d’une monocouche requise, il est recommandé d’utiliser 300 organoïdes intacts ou cellules individuelles provenant de 300 organoïdes. Dans une solide culture, il est prévu d’obtenir environ 150 organoïde/puits dans une plaque de culture bien 12. - Assurez-vous que les plaques sont enduites avant le transfert.
Remarque : Les plaques de matrice enduite de membrane basale ont une couche de gel translucide, cependant, plaques de collagène enduit n’aura pas une indication évidente de l’enduit. - Déloger la bulle de matrice 3D membrane basale de la plaque en pipettant également, directement 1 mL stérile Ca2 +/Mg2 +-libre SPD sur le centre de la bulle.
- À l’aide d’une pipette, prélever le mélange de matrix et organoïde membrane basale dans cell culture tubes à essai. Recueillir à un ratio de 2 bulles de matrice de membrane basale par tube. Centrifuger pendant 5 min à 40 x g et 4 ° C.
- À l’aide d’un système de vide, retirez le surnageant et comme beaucoup matrice de membrane basale que possible. Resuspendre dans 4 mL de Ca2 +/Mg2 +-libérer SPD, éliminer le surnageant et répéter 2 - 3 fois. Pour le protocole de transfert organoïde ensemble, passez à l’étape 5.10. Passez à l’étape 5,7 pour le protocole de suspension monocellulaire.
- Réchauffez la solution détachement cellulaire à 37 ° C et ajouter 1 mL dans chaque tube à essai. Mélanger doucement en retournant les tubes ou pipetage de haut en bas avec une pipette. Incuber pendant 10 min à 37 ° C.
- Ajouter 2 mL de Ca2 +/Mg2 +-libre SPD directement dans chaque éprouvette.
- Utiliser une aiguille 26 G et injecter le mélange 2 ou 3 fois. Examinez-le pour les cellules individuelles. Seringue de 1-2 fois plus s’il y a toujours des organoïdes ou des amas de cellules.
- Centrifuger à 40 x g pendant 5 min à 4 ° C. Resuspendre le culot dans média FGO 2D (milieu de croissance FGO souris 2D : milieu de moyenne/F12 Eagle modifié de Dulbecco Advanced additionné de 2mM de L-glutamine, 10 mM la pénicilline/streptomycine, 10 % de sérum de veau foetal, 10 mM un tampon HEPES, 1 x N2, 1 x B27, additionné de 10 gastrine nM, 50 ng/mL de facteur de croissance épidermique, inhibiteur de TGF-β 1 µM et 10 µM Y-27632 ROCK inhibiteur. 2D milieu humain FGO : Milieu de moyenne/F12 Eagle modifié de Dulbecco avancée additionné de 2mM de L-glutamine, 1 % pénicilline/streptomycine, 10 mM un tampon HEPES, 10 % de sérum de veau foetal, 10 mM, Nicotinamide, 1 x N2, 1 x B27, additionné de 50 mg/mL, kanamycine, 50 ng/mL de croissance épidermique Facteur et 10 µM Y-27632 ROCK inhibiteur, 1µm TGF-β inhibiteur).
- La remise en suspension sur des plaques de revêtement de la plaque. Incuber les plaques à 37 ° C. Remplacer le support tous les 4 jours ou plus tôt si les médias se colore en jaune. Monocouche nécessite environ 4 jours à se former.
6. Si vous grattez aide monocouches de cellules épithéliales gastriques 2D sur des plaies
- À l’aide d’une lame de rasoir, gratter la couche lorsque la culture a atteint 100 % confluence.
- Difficulté monocouches utilisant 3,7 % de formaldéhyde pendant 15 min à température ambiante. Permeabilize avec 0,5 % de détergent non ionique/PBS pendant 20 min à température ambiante.
- Bloquer ensuite monocouches avec sérum âne 2 % pendant 1 h à température ambiante et incuber avec dilution de 1/1000 de H+, K+-ATPase anticorps primaire pendant la nuit à 4 ° C, laver avec 0,1 % de détergent non ionique/PBS et incuber avec dilution au 1/100 d’âne anticorps secondaire anti-souris 488 et 10 μg/mL de noyaux de cellules de Hoechst tachent pendant 1 h à température ambiante.
- Pour identifier les cellules de surface fosse muqueuses dans les cultures 2D anthropique gastrique monocouche, tacher les cellules avec 20 μg/ml de conjugué FITC Ulex europaeus (UEAI). Monocouches d’image sur un microscope confocal.
- Prendre des photos de plaie chaque h. quelques rayures seront ré-epithelialize entre 24 à 48 h selon la qualité de la monocouche et la variation entre les patients.
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Representative Results
Organoïdes provenaient de corpus/corps de l’homme ou du fond de œil des tissus souris estomac (Figure 1 a). Après digestion d’EDTA de dérivés de l’homme ou de la souris le tissu stomacal ou collagénase respectivement, glandes sont incorporés dans la matrice de la membrane basale et cultivées pendant 6 à 7 jours (Figure 1 a). Figure 1 b montre la formation d’origine humaine gastrique organoïdes (huFGOs) qui ont ensuite été transférés à une monocouche épithéliale gastrique (huGEM) sur des lames de matrice-enduit chambre de membrane basale. Après 4 jours de culture, confluentes huGEMs ont été utilisés pour gratter plaie des dosages (Figure 1 b). Images récoltées dans une analyse de laps de temps de la huGEM a montré la fermeture de la plaie au sein de la culture sur une période de 24 heures (Figure 2).
HuGEMs ont été trouvés pour exprimer les lignées cellulaires importants trouvés dans les tissus de l’estomac native. Immunofluorescence souillant révèle l’expression d’une monocouche de positif-cadhérine E polarisée qui comprenait le pariétaux (Figure 3 b, C) et la surface muqueuse (Figure 3 b, D) des cellules. Analyse PCR utilisant l’ARN prélevé dans ces monocouches ont confirmé l’expression du pariétales et la surfaces des cellules muqueuses, outre les cellules du col de chef et de la muqueuse (Figure 3E). HuGEMs confluentes exprimé également quelques cellules en prolifération (Figure 3F). L’analyse de ces lignées cellulaires majeurs dans le dosage zéro blessure a révélé une expression durable de cellules muqueuses surface pariétale, chef, muqueuses cou au cours d’une période de temps (Figure 4 a, B) de 24 heures. Collectivement, ces résultats démontrent l’utilisation du huGEMs comme système de culture nouvelle pour étudier gastrique régénération in vitro.
Figure 1 : génération d’origine humaine gastrique organoïdes (huFGO) et primaires monocouches épithéliales gastriques (huGEM). (A) des images représentatives de l’estomac humain gastrique de tissu et de la souris utilisé pour générer des glandes organoïde culture. La zone décrite indique région fundue de l’estomac de souris. (B) la production d’origine humaine gastrique organoïdes (huFGOs) qui sont utilisés pour la culture d’origine humaine monocouches épithéliales gastriques (huGEMs). Image représentative de huGEM après zéro indiquant la zone blessée. Echelle = 500 μm s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : dosage zéro-plaie. Images représentatives recueillies d’une expérience de laps de temps à l’aide de huGEM 0, 8, 16 et 24 h après zéro blessure. Echelle = 500 μm s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Expression de lignées cellulaires majeurs dans les cultures huGEM. Immunofluorescence souillant des cultures huGEM démontrant l’expression de la cadhérine (A) E (Ecad, rouge), la surface des cellules muqueuses (UEAI, vert) et noyaux (Hoechst, bleu) et (B) E cadhérine (Ecad, rouge), les cellules pariétales (HK, vert) noyaux () Hoechst, bleu). Canaux séparés apparaissent en (C) et (D). (E) RT-PCR a été réalisée à l’aide d’ARN extrait de huGEMs pour l’expression de H+K+-ATPase (ATP4a), pepsinogène C (PgC), MUC5AC et MUC6. (F) des cellules dans la culture huGEM déterminé par absorption EdU (rouge). L’échelle bar (A-D) = 50 μm, échelle bar (F) = 100 μm. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : changements dans l’expression de lignée cellulaire dans le dosage zéro-plaie. Immunofluorescence souillant des cultures huGEM démontrant l’expression de la E-cadhérine (Ecad, rouge) ou cellules muqueuses superficielles (UEAI, vert) ou de cellules pariétales (HK, vert) et de noyaux (Hoechst, bleu) à l’aide de diapositives prélevés huGEM cultures 0, 8, 16 et 24 heures post zéro-plaie. Bkgrd = coloration de fond de la matrice de la membrane basale sur diapositives. Barre d’échelle de l’axe XY de 0 - 400 μm. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Souris 3D multimédia | Solution mère | Travail de Concentration |
| nAcetylcysteine | Poudre | 1 mM |
| Gastrine | 10 ΜM | 10 nM |
| EGF | 500 µg/mL | 50 ng/mL |
| Caboche | 100 µg/mL | 100 ng/mL |
| FGF10 | 100 µg/mL | 100 ng/mL |
| YCMD | 10 mM | 10 ΜM |
| B27 | 50 x | 1 x |
| N2 | x 100 | 1 x |
| Stylo/Strep | 1 M | 10 mM |
| HEPES | 1 M | 10 mM |
| Glutamax | 200 mM | 2 mM |
| WNT | 50 % v/v | |
| R-Spondin | 10 % v/v |
Tableau 1 : Souris 3D Media Components.
| Souris multimédia 2D | Solution mère | Travail de Concentration |
| FCS | 100 % | 10 % |
| YCMPD | 10 mM | 10 ΜM |
| Gastrine | 10 ΜM | 10 nM |
| EGF | 500 µg/mL | 50 ng/mL |
| B27 | 50 x | 1 x |
| N2 | x 100 | 1 x |
| Stylo/Strep | 1 M | 10 mM |
| HEPES | 1 M | 10 mM |
| Glutamax | 200 mM | 2 mM |
| Inhibiteur de TGF-β | 10 mM | 1 ΜM |
Tableau 2 : Souris 2D Media Components.
| Media 3D humaine | Solution mère | Travail de Concentration |
| Nicotinamide | Poudre | 10 mM |
| nAcetylcysteine | Poudre | 1 mM |
| Gastrine | 10 ΜM | 1 nM |
| EGF | 500 µg/mL | 50 ng/mL |
| Caboche | 100 µg/mL | 100 ng/mL |
| FGF10 | 100 µg/mL | 200 ng/mL |
| YCMD | 10 mM | 10 ΜM |
| B27 | 50 x | 1 x |
| N2 | x 100 | 1 x |
| Stylo/Strep | 1 M | 10 mM |
| HEPES | 1 M | 10 mM |
| Glutamax | 200 mM | 2 mM |
| Kanamycine | 1 M | 10 mM |
| Amphotéricine B/gentamicine | 125 µg/mL | 1 mM |
| WNT | 50 % v/v | |
| R-Spondin | 10 % v/v |
Tableau 3 : Humain 3D Media Components.
| Les médias 2D humaines | Solution mère | Travail de Concentration |
| FCS | 100 % | 10 % |
| YCMPD | 10 mM | 10 ΜM |
| Gastrine | 10 ΜM | 1 nM |
| EGF | 500 µg/mL | 50 ng/mL |
| B27 | 50 x | 1 x |
| N2 | x 100 | 1 x |
| Stylo/Strep | 1 M | 10 mM |
| HEPES | 1 M | 10 mM |
| Glutamax | 200 mM | 2 mM |
| Inhibiteur de TGF-β | 10 mM | 1 ΜM |
| Nicotinamide | Poudre | 10 mM |
| Kanamycine | 1 M | 10 mM |
Tableau 4 : Les composants de médias 2D humaine.
| Problème expérimental | Conseil dépannage |
| Monocouches ne parviennent pas à la forme d’organoïdes | 1) les conditions de culture optimales pour ce protocole varient entre besoins expérimentaux. Humaine et monocouches de souris provenant d’organoïdes devraient être cultivées à l’aide de matrice dilué membrane basale lors de l’utilisation de verre ou en plastique Pétri. Cependant, collagène de queue de rat est optimale pour des expériences de monocouche de souris ou insère d’origine humaine nécessitant une membrane polyester. 2) les conditions de culture optimales varient selon le jeu expérimental vers le haut. Cultures à l’aide de suspension monocellulaire sont idéalement cultivées avec 3D médias FGO tandis qu’organoïdes intacts sont cultivées avec média FGO 2D. |
| Âgés de monocouches provenant de patients (> 55 ans) ou des souris (> 18 mois) n’a pas pu se développer et atteindre la confluence | Si à l’aide de tissus de l’estomac collectés des souris âgées (> 18 mois) ou de patients (> 55 ans) devrait doubler la densité des organoïdes utilisées pour la production de la monocouche étant donné que l’efficacité de la croissance d’organoïdes est diminué. |
| Organoïdes ne parviennent pas à la forme des glandes | Il est recommandé que fraîches (nouvellement achetés si possible) utiliser la gastrine. Utilisez la gastrine fraîchement re-suspendue tous les 4 mois. |
| Organoïdes ne parviennent pas à joindre et former des monocouches | Veiller à ce que l’élimination efficace de la matrice de la membrane basale est parvenue après la récolte des organoïdes pour le transfert de plaques de culture de monocouches. |
| Cultures d’origine âgés de patients (> 55 ans) ou des souris (> 18 mois) ne parviennent pas | Pendant les périodes d’incubation et de digestion, 15 à 30 min d’incubation initiale suivie par intervalles de 5 min d’incubation nécessaire est suffisant. Il est à noter que les patients de plus de 55 ans peuvent avoir des glandes qui sont plus facilement dissociées et nécessitent donc moins la digestion. De même, les FGOs provenant de patients âgés ont affiché des temps de croissance plus lent et une sensibilité accrue à une centrifugation. Pour obtenir les meilleurs résultats, limiter tout excès centrifugation lorsque vous travaillez avec des tissus âgés et remplacer le support dans un délai raisonnable. |
Tableau 5 : conseils de dépannage. Problèmes rencontrés et les résolutions recommandées pour la mise en place optimale et de la culture de l’homme ou monocouches gastrique de la souris.
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Discussion
Le protocole actuel détaille la mise en place de monocouches gastrique épithéliales-anthropique et souris qui peut être utilisé pour des dosages de zéro-plaie. Le protocole repose sur le concept des tissus d’isolement primaire humain (ou souris) résident de cellules souches et est un protocole modifié publié par Schlaermann et al.7. En particulier, nous avons optimisé le protocole ici pour établir un confluent et polarisé gastrique monocouche épithélial qui exprime les grandes cellules lignées qui se trouve au sein de l’épithélium gastrique en vivo. Réparation de l’ulcère gastrique est un processus complexe qui implique des tissus réépithélialisation, régénération et prolifération9,10,11. En particulier, notre laboratoire a rapporté que la régénération de l’épithélium gastrique coïncide avec l’émergence de polypeptide/trèfle spasmolytique facteur (des territoires FFT) 2 exprimant une métaplasie (SPEM) à la marge de l’ulcère dans les glandes gastriques régénérants 12,,13. SPEM est définie comme la transdifférenciation de la lignée cellulaire chef dans une métaplasie de cellules muqueuses14 qui émerge avec blessures et disparaît lorsque la muqueuse est retournée à sa composition cellulaire normale12. Ainsi, pour étudier un tel mécanisme dans un système in vitro , il est essentiel que les lignées cellulaires majeurs, tels que les cellules principales, sont présentes au sein de la culture.
L’utilisation de scratch-plaie dosages ont été largement utilisés pour l’étude de la réparation et la régénération, et jusqu'à tout récemment, lignées cellulaires de cancer de l’estomac ont été utilisés1,2,3,4. Alors que les mécanismes fondamentaux ont été révélées à l’aide de lignées cellulaires de cancer de l’estomac, ces cultures sont transformés et manquent la diversité cellulaire du tissu estomac native. HuGEMs semblent conserver une composition cellulaire polarisée et diversifiée qui récapitule étroitement l' épithélium gastrique in vivo. En outre, après avoir atteint confluency huGEM cultures peuvent être maintenues pendant environ un mois dans des conditions optimales. Cultures étendues permettent des expériences à long terme. Ainsi, les applications futures de la huGEMs qui peut être considéré comme incluent monocouche/immunitaire cellulaire co-cultures et expériences à long terme pour l’étude de la pathogenèse de l’Helicobacter pylori .
Il y a des aspects techniques importants à noter dans le protocole actuel. Le premier point technique est que le choix du composant de la membrane basale varie en fonction de la surface de culture cellulaire qui doit être utilisé pour des expériences. Afin d’assurer que les conditions optimales monocouche sont atteints, il est recommandé que ce collagène est utilisé lorsque les expériences avec les monocouches exigent plaques à membrane polyester amovibles. Toutefois, si des expériences monocouche besoin de verre ou des surfaces de culture en plastique, dilués membrane basale matrix est le choix optimal du revêtement. Deuxièmement, la densité des organoïdes nécessaires pour atteindre une monocouche confluente doit être ajustée selon l’âge du patient dont le tissu gastrique est collecté. Pour les tissus prélevés chez des souris âgées (> 18 mois) ou de patients (> 55 ans), la densité d’organoïde utilisée doit être doublé lorsque transférant à une monocouche en raison de la capacité de croissance baisse à ans personnes. Au cours de la digestion et l’incubation des tissus humains provenant de patients âgés, les glandes peuvent être plus sensibles à la dissociation et la centrifugation et, par conséquent : 1) doivent être centrifugés aussi parcimonieusement que possibles, 2) médias remplacés avec diligence et 3) lors de la digestion incubations de 15 à 30 minutes avec digestions incrémentielles de 5 minutes par la suite vont diminuer la probabilité d’au cours de la digestion. Enfin, lors de la formation de monocouches de suspensions cellulaires simples dérivés organoïde, 3D FGO media est plus optimal pour une formation adéquate des monocouches considérant que lorsque la mise en culture d’organoïdes intacte, média FGO 2D a été observée pour obtenir le rendement le plus élevé.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le NIH (NIDDK) 5 R01 DK083402-07 accorder (YZ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced Dulbecco's modified Eagle/F12 medium (basal media) | Life Technologies | 12634-010 | |
| GlutaMAX (L-glutamine) | Life Technologies | 25030-081 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Scientific | SV30010 | |
| Amphotericin B/Gentamicin | Thermo Scientific | R01510 | |
| Kanamycin | Thermo Fisher | RO1510 | |
| HEPES Buffer | Sigma Aldrich | H0887 | |
| n-Acetylcystine | Sigma Aldrich | A9165 | |
| N2 | Life Technologies | 17502-048 | |
| B27 | Life Technologies | 12587-010 | |
| BMP Inhibitor (Noggin) | Pepro Tech | 250-38 | |
| Gastrin | Tocris | 3006 | |
| EGF | Pepro Tech | 315-09 | |
| FGF10 | Pepro Tech | 100-26 | |
| Nicotinamide | Sigma Aldrich | N0636 | |
| Y-27632 ROCK Inhibitor | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| TGF-β Inhibitor | Tocris | 2939 | |
| Ca2+/Mg2+ -free DPBS | Fisher | 21-031CV | |
| Dulbecco's modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 12634-010 | |
| Fetal Bovine Serum | FBS | ||
| OPTIMEM | Invitrogen | ||
| 0.22µM filter | Fisher | 099-720-004 | |
| 37 °C Water Bath | |||
| Collagenase Type 1 | Worthington | LS004214 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9418 | |
| Kimwipes (tissue paper) | Fischer Scientific | 06-666C | |
| 125 mL round bottom flask | |||
| 1 in (25 mm) stir bar | |||
| Rubber Septa | |||
| Sterile Gauze | |||
| Stir Plate | |||
| Ring Stand | |||
| Ring Stand Clamps | |||
| Sterile petri dish | |||
| 18 G needles of 1.5 in length | Thermo Fisher | 305196 | |
| 20 G spinal needles of 3.5 in length | Thermo Fisher | 405182 | |
| 12-well cell culture treated plate | Midwest Scientific | 92012 | |
| Growth Factor Reduced, Phenol Red-free MatrigelTM (Basement membrane matrix) | Fisher | CB-40230C | |
| Sterile Razor Blades | |||
| Wide-tip tweezers | |||
| Curved Hemostatic Forceps | |||
| 200 µL wide pipette tips | Thermo Fisher | 02-707-134 | |
| 5 mL cell culture test tubes | Fisher | 14-956-3C | |
| Oxygen Tank with rubber hosing | |||
| 1 g D-Sorbitol | |||
| Sucrose | Fisher | SS-500 | |
| Dissecting microscope | |||
| Dissecting Tray | |||
| Rocking Table | |||
| Rat Tail Collagen Type 1 | Life Technologies | A10483-01 | |
| Cell culture grade glacial acetic acid | Fisher | A38-212 | |
| Cell culture grade water | Corning | 25-055-CV | |
| 2-well chamber slide | Thermo Fisher | 155380 | |
| 12-well Transwell (polyester membrane inserts) | Corning | 3460 | |
| Cell scraper | Corning | 353086 | |
| Accutase (cell detachment solution) | Stemcell Technologies | 7920 | |
| 263/8 G syringe | Thermo Fisher | 309625 | |
| Razor blade | |||
| L Cells | L cells, a Wnt3a producing cell line, were received as a gift from Dr. Hans Clevers (Hubrecht Institute for Developmental Biology and Stem Cell Research, Netherlands). | N/A | |
| HEK-293T Rspondin secreting cells | A modified HEK-293T R-spondin secreting cell line was obtained from Dr. Jeff Whitsett (Section of Neonatology, Perinatal and Pulmonary Biology, Cincinnati Children's Hospital Medical Centre and The University of Cincinnati College of Medicine, Cincinnati, USA ). | N/A | |
| HK-ATPase Primary Antibody | Invitrogen | SC-374094 | |
| E-Cadherinn | SantaCruz | sc-59778 | |
| UEA1 | Sigma Aldrich | L9006 | |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher | H3570 | |
| Alexafluor 488 secondary antibody (Donkey anti-mouse 488 secondary antibody) | ThermoFisher Scientific | R37114 |
References
- Nagy, T. A., et al. Helicobacter pylori regulates cellular migration and apoptosis by activation of phosphatidylinositol 3-kinase signaling. J Infect Dis. 199 (5), 641-651 (2009).
- Mnich, E., et al. Impact of Helicobacter pylori on the healing process of the gastric barrier. World J Gastroenterol. 22 (33), 7536-7558 (2016).
- Zhang, Y., et al. Bm-TFF2, a toad trefoil factor, promotes cell migration, survival and wound healing. Biochem Biophys Res Commun. 398 (3), 559-564 (2010).
- Crabtree, J. Role of cytokines in pathogenesis of Helicobacter pylori-induced mucosal damage. Dig Dis Sci. 43 (Supplement), 46S-53S (1998).
- Riahi, R., Yang, Y., Zhang, D. D., Wong, P. K. Advances in wound-healing assays for probing collective cell migration. J Lab Autom. 17 (1), 59-65 (2012).
- Zhang, M., Li, H., Ma, H., Qin, J. A simple microfluidic strategy for cell migration assay in an in vitro wound-healing model. Wound Repair Regen. 21 (6), 897-903 (2013).
- Schlaermann, P., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. 65 (2), 202-213 (2016).
- Bertaux-Skeirik, N., et al. CD44 plays a functional role in Helicobacter pylori-induced epithelial cell proliferation. PLoS Pathog. 11 (2), e1004663 (2015).
- Tarnawski, A. S. Cellular and molecular mechanisms of gastrointestinal ulcer healing. Dig Dis Sci. 50 (Suppl 1), S24-S33 (2005).
- Wright, N. A., Pike, C., Elia, G. Induction of a novel epidermal growth factor-secreting cell lineage by mucosal ulceration in human gastrointestinal stem cells. Nature. 343, 82-85 (1990).
- Wright, C. L., Riddell, R. H. Histology of the stomach and duodenum in Crohn's disease. Am J Surg Pathol. 22 (4), 383-390 (1998).
- Engevik, A. C., et al. The Development of Spasmolytic Polypeptide/TFF2-Expressing Metaplasia (SPEM) During Gastric Repair Is Absent in the Aged Stomach. CMGH. , In Press (2016).
- Bertaux-Skeirik, N., et al. CD44 variant isoform 9 emerges in response to injury and contributes to the regeneration of the gastric epithelium. Journal of Pathology. 242 (4), 463-475 (2017).
- Nam, K. T., et al. Mature chief cells are cryptic progenitors for metaplasia in the stomach. Gastroenterology. 139 (6), 2028-2037 (2010).
