Forsøgsmetoden på Immunofænotypning af murine orthotopic PDAC homografts sigter profilering tumor immuno-mikromiljø. Tumorer er orthotopically implanteret via kirurgi. Tumorer i 200-600 mm3 i størrelse blev høstet og adskilles for at forberede encellede suspensioner, efterfulgt af flere immun markør FACS analyse ved hjælp af forskellige fluorescently-mærket antistoffer.
Homograft (syngeneic) tumorer er arbejdshest af dagens immuno-onkologi (I/O) prækliniske forskning. Tumor mikromiljø (TME), især dens immun-komponenter, er afgørende for de prognose og forudsigelse af behandlingsresultater, især dem af immunterapi. TME immun-komponenter er sammensat af forskellige delgrupper af tumor infiltrerer immunceller vurderbare af multi-farve FACS. Pancreas duktalt adenokarcinom (PDAC) er blandt de dødeligste malignances mangler gode behandlingsmuligheder, således et presserende og udækket medicinsk behov. En vigtig årsag til dens ikke reaktionsevne på forskellige behandlinger (kemo-, målrettet, I/O) har været sin rigelige TME, bestående af fibroblaster og leukocytter, der beskytter tumorceller fra disse behandlinger. Orthotopically implanterede PDAC menes at mere præcist generobre TME af menneskelige pancreascancer end konventionelle subkutan (SC) modeller.
Homograft tumorer (KPC) er transplantationer af musen spontane PDAC stammer fra gensplejsede KPC-mus (KrasG12D / +/P53– / –/Pdx1-Cre) (KPC-CLAUSS). Den primære tumor væv er skåret i små fragmenter (~ 2 mm3) og transplanteret subkutant (SC) til de syngeneic modtagere (C57BL/6, 7-9 uger gammel). Homografts blev derefter kirurgisk orthotopically transplanteret ind på bugspytkirtlen af nye C57BL/6 mus, sammen med SC-implantation, som nåede tumor mængder af 300 – 1.000 mm3 af 17 dage. Kun tumorer af 400-600 mm3 blev høstet pr. godkendt obduktion procedure og renses for at fjerne de tilstødende ikke-tumor væv. De var dissocieres per protokol ved hjælp af en væv dissociator i én celle suspensioner, efterfulgt af farvning med udpegede paneler af fluorescently mærket antistoffer til forskellige markører for forskellige immunceller (lymfoid, myeloid og NK, DCs). De farvede prøver blev analyseret ved hjælp af multi-farve FACS til at bestemme antallet af immunceller af forskellige slægter, som deres relative procentdel i tumorer. De immun profiler af orthotopic tumorer blev derefter sammenlignet med dem af SC tumorer. Den foreløbige data demonstreret betydeligt forhøjet infiltrerer TILs/TAMs i tumorer i bugspytkirtlen, og højere B-celle infiltration i orthotopic i stedet for SC tumorer.
Pancreas duktalt adenokarcinom (PDAC) forårsager næsten halvdelen en million dødelighed over hele verden hvert år, en af top 5 cancer killers. Der er nogle effektive behandlingsmuligheder og ingen godkendte immunoterapi; Derfor er der desperat behov for nye behandlinger. Kræft er i stigende grad bliver anerkendt som immunologiske sygdomme, herunder PDAC, ud over de genetiske sygdomme, som i dag. Immunologiske og genetiske faktorer ville sandsynligvis bestemme sygdommen prognosen samt behandling resultater. Tumorer unddrage vært immun overvågning og i sidste ende fremme for at forårsage død. Mange af disse immune processer forekomme inden for tumor mikromiljø (TME)1,2,3,4 hvor forskellige typer af immunceller interagere med tumorceller, med hinanden og med andre tumor stromale komponenter, direkte eller indirekte via cytokiner, som i sidste ende bestemme sygdom resultat. Karakterisering af tumor immunkomponenter TME, og tumor Immunofænotypning, herunder subtyping, nummerering og lokalisering af forskellige slægter af immunceller, er derfor afgørende for at forstå anti-tumor immunitet. I forbindelse med PDAC, det er blevet foreslået at forhøjet tumor infiltrerer smittespredningshæmmende makrofager (TAM) og B-celler har ført til forebyggelse af T-celle infiltration og/eller aktivering og høje niveauer af fibrose5,6.
Den fælles tilgang at undersøge immun TMEs eksperimentelt ville bruge surrogat tumor prækliniske dyremodeller, hovedsageligt relevante mus tumor modeller7, især mus syngeneic (homograft) eller genetisk modificerede musemodeller (CLAUSS) af kræft, på den formodede lighed af mus og mennesker for tumorer og immunitet8,9. Det er forstået i virkeligheden, at der er iboende forskelle mellem to arter10,11.
Transplanterede mus tumorer har betydelige driftsmæssige fordele over spontane tumorer7, nemlig synkroniserede tumor udvikling i modsætning til forældrenes CLAUSS spontan tumor udvikling. Homografts af spontan murine tumorer betragtes som primære tumorer har aldrig været manipuleret i in vitro, og spejling oprindelige mus tumor Histò- / Molekylær Patologi7, samt mulige immun profiler. Disse murine homografts er ofte anset for at være “en mus version af patient-afledte xenografts (PDXs)”. De har derfor sandsynligvis en bedre translatability end konventionelle syngeneic cell line-afledte mus tumorer12. Især er mange homografts afledt af specifikke CLAUSS hvor specifikke menneskelige sygdomsmekanismer, fx muterede driver mutationer, er manipuleret, og disse homografts bør derfor have fordele til deres kliniske relevans. Især udvikle KPC GEMM mus PDAC inden for 15 – 20 ugers-alderen, som morfologisk sammenfatter menneskelige sygdommen med overvejende godt – til moderat-opdelte glandulær arkitektur og højt beriget stroma. Denne model indeholder også de mest almindelige genetiske egenskaber i menneskets PDAC, nemlig Kras aktivering mutation og P53 tab af funktion, som forekommer i 90% og 75% af menneskelig PDAC, henholdsvis5,6.
Lokaliteter af transplantation er også blevet foreslået til at spille en rolle i model translatability. Det specifikke omkringliggende væv miljø, som en tilsvarende orthotopic miljø, kunne være en niche for specifikke tumorer til fremskridt, i modsætning til den ensartede subkutan (SC) miljøer for almindeligt transplanterede tumorer. Det ville være af særlig interesse, hvis og/eller, hvad forskel der findes mellem de to transplantation sites, immun-mikromiljø og relevans for menneskers kræft, fx. i forbindelse med PDAC.
En af de vigtigste aspekter af immun profilering, eller Immunofænotypning, er at bestemme tumor infiltrerer immunceller af forskellige slægter, tal, relative procentdel i tumorer, samt deres aktivering stater og steder. Dette omfatter tumor-infiltratrating lymphoctyes (TILs, både T- og B-), tumor infiltrerer makrofager (TAMs), tumor infiltrerer naturlige dræberceller (NKs) og tumor-resident dendritiske celler3,13,14 , 15 , 16 , 17, og subcellulært lokaliseringen af visse celler18,19,20, osv. Fluorescens aktiveret celle sortering (FACS) eller flow flowcytometri er en enkelt celle detection teknologi, der er almindeligt anvendt til at måle de specifikke parametre for en celle. Multi-farve flow flowcytometri foranstaltninger flere markører på en enkelt celle3,4,21 og er den mest anvendte metode til at bestemme de tal og relative procentdel af forskellige delmængder af immunceller, herunder dem, inden tumorer.
Denne rapport beskriver procedurer for profilering tumor infiltrerer immunceller: 1) Implantation af orthotopic PDAC mus tumor homografts, sammen med SC implantation; 2) tumor væv høst og enkelt celle forberedelse via tumor dissociation; 3) flow flowcytometri analyse af alle de celler, der stammer fra tumorer som en baseline; 4) sammenligning af baseline profiler af både transplantation tilgange.
Selv om undersøgelser ved hjælp af SC tumorer er mere let udført, orthotopically implanteret tumorer modeller kan potentielt være mere relevante for prækliniske farmakologiske undersøgelser (især I/O undersøgelser) at give øget translatability. Denne betænkning sigter mod at hjælpe interesserede læsere/publikum til at være i stand til direkte visualisere de tekniske procedurer, der kan bruges i deres respektive forskning. Vores protokoller viser denne orthotopic implantation af PDAC kan resultere i effektiv …
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke Dr. Jody Barbeau – kritisk læsning og redigering af håndskriftet, og takke Ralph Manuel for at designe kunstværker. Forfatterne vil også gerne takke Crown Bioscience onkologi Immuno-onkologi biomarkør team og onkologi In Vivo team, for deres store tekniske indsats.
Anesthesia machine | SAS3119 | ||
Trocar 20 | 2mm | ||
Petri dish | 20mm | ||
100x antibiotic and antimycotic | |||
Iodophor swabs | Daily pharmacy purchase | ||
Alcohol swabs | Daily pharmacy purchase | ||
Liquid nitrogen | Air chemical | ||
Biosafety hood | AIRTECH | BSC-1300IIA2 | |
FACS machine LSRFortessa X-20 | BD | LSR Fortessa | |
antibodies | BD | ||
Trevigen MD or BD Matrigel Basement Membrane Matrix High concentration | BD | 354248 | |
FACS buffers | BD | 554656 | Mincing buffer |
Brilliant Staining Buffer | BD | 563794 | |
Mouse BD Fc Block | BD | 553142 | |
cell filters | BD-Falcon | 352350 | 70µm |
routine blood tube | BD-Vacutainer | 365974 | 2mL |
Kaluza | Beckman | vs 1.5 | |
6-well plates | Corning | 3516 | |
Foxp3 Fix/Perm kit | ebioscience | 00-5523-00 | |
UltraComp eBeads | ebioscience | 01-2222-42 | |
Centrifuge | eppendorf | 5810R,5920R | |
FlowJo software | FlowJo LLC | vs 10.0 | |
PBS | Hyclone | SH30256.01 | 50mL |
RPMI 1640 | Hyclone | SH30809.01 | |
Disposable, sterile scalpels | Jin zhong | J12100 | 11# |
knife handle | Jin zhong | J11010 | |
eye scissors and tweezers | Jin zhong | Y00030 | Eye scissors 10cm |
eye scissors and tweezers | Jin zhong | JD1060 | Eye tweezers 10cm with teeth |
Portable liquid nitrogen tank | Jinfeng | YDS-175-216 | |
Electronic balance | Metter Toledo | AL204 | 0-100g |
Miltenyi C-tubes | Miltenyi | 130-096-334 | |
Miltenyi Gentle MACS with heater blocks | Miltenyi | 120-018-306 | |
Tumor Dissociation Kit | Miltenyi | 130-096-730 | |
Cell counter | Nexcelom | Cellometer | Cellometer Auto T4 |
cryopreservation tube | Nunc | 375418 | 1.8ml |
Cultrex High Protein Concentration (HC20+) BME | PathClear | 3442-005-01 | |
syringes | Shanghai MIWA medical industry | 1-5mL | |
Studylog software | Studylog | software | |
Studylog-Balance and supporting USB | OHAUS | SE601F | Balance and supporting USB |
Studylog-Data line of vernier calipers | Sylvac | 926.6721 | Data line of vernier calipers |
Caliper | Sylvac | 910.1502.10 | Sylvac S-Cal pro |
Sterilized centrifuge tubes | Thermo | 339653 | 50mL |
Sterilized centrifuge tubes | Thermo | 339651 | 15mL |
Ice bucket | Thermo | KLCS-288 | 4°C |
Ice bucket | Thermo | PLF-276 | —20°C |
Ice bucket | Thermo | DW-862626 | —80°C |
RNAlater | Thermo | am7021 |