Immunophenotyping de ortotópico Homograft (Syngeneic) de murino KPC primário de Adenocarcinoma Ductal do pâncreas por citometria de fluxo
Summary
O procedimento experimental sobre o immunophenotyping de stent de murino ortotópico PDAC visa perfilação a imuno-microambiente do tumor. Os tumores são orthotopically implantado através de cirurgia. Tumores de 200-600 mm3 no tamanho foram colhidos e dissociados para preparar suspensões de célula única, seguidas de análise multi imune marcador FACS usando diferentes anticorpos fluorescente-etiquetadas.
Abstract
Homograft (syngeneic) tumores são o carro-chefe de pesquisa pré-clínica do hoje imuno-Oncologia (i/o). O microambiente do tumor (TME), particularmente seus componentes-imunológico, é vital para o prognóstico e previsão de resultados dos tratamentos, especialmente aqueles de imunoterapia. TME imune-componentes são compostos de diferentes subconjuntos de tumor infiltrando as células imunes avaliável por multi cor FACS. Adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) está entre os mais mortíferos malignances falta de opções de tratamento bom, assim, uma necessidade urgente e insatisfeita médica. Uma razão importante para a sua não-capacidade de resposta às diversas terapias (quimioterapia-, alvo, I/O) tem sido seu TME abundante, composta por fibroblastos e leucócitos que protegem as células do tumor destas terapias. Orthotopically implantado PDAC acredita-se que mais precisão recapturar o TME de cânceres pancreáticos humanos do que os modelos convencionais de subcutânea (SC).
Tumores homograft (KPC) são transplantes de rato espontânea PDAC originários de KPC-ratos geneticamente modificados (K-rasG12D / +/P53– / –/Pdx1-Cre) (KPC-GEMM). O tecido do tumor primário é cortado em pequenos fragmentos (~ 2 mm3) e transplantado por via subcutânea (SC) para os destinatários syngeneic (C57BL/6, 7-9 semanas de idade). O stent foram então cirurgicamente orthotopically transplantado para o pâncreas de novos camundongos C57BL/6, juntamente com SC-implantação, que atingiram volumes de tumor de 300 – 1.000 mm3 por 17 dias. Somente os tumores de 400 – 600 mm3 foram colhidos por procedimento aprovado autópsia e limpo para remover os tecidos de tumor não adjacentes. Eles foram dissociados por protocolo usando um dissociador tecido em suspensões de célula única, seguidas por coloração com painéis designados de fluorescente etiquetado anticorpos para os vários marcadores de diferentes células do sistema imunológico (linfoide, mieloide e NK, DCs). As amostras coradas foram analisadas usando FACS multi cor para determinar o número de células do sistema imunológico de linhagens diferentes, bem como a sua percentagem relativa dentro de tumores. Os perfis imunes de ortotópico tumores foram então comparados dos tumores do SC. Os dados preliminares demonstraram TILs/TAMs infiltrante significativamente elevados em tumores sobre o pâncreas e infiltração de células B maior ortotópico em vez de tumores do SC.
Introduction
Adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) faz com que quase a metade um milhão mortalidade mundial anualmente, um dos top 5 câncer assassinos. Há poucas opções de tratamento eficazes e imunoterapias não aprovadas; Portanto, novos tratamentos são desesperadamente necessários. Cancros são cada vez mais sendo reconhecidos como doenças imunológicas, incluindo PDAC, além das doenças genéticas, como conhecido hoje. Fatores imunológicos e genéticos provavelmente iria determinar o prognóstico da doença, bem como tratamento os resultados. Tumores de iludir a vigilância imune hospedeiro e eventualmente avançam para causar a morte. Muitos destes processos imunes ocorrerem dentro o microambiente do tumor (TME)1,2,3,4 onde diferentes tipos de células do sistema imunológico interagem com células tumorais, com o outro e com outro tumor componentes do estroma, diretamente ou indiretamente através de citocinas que, finalmente, determinar o resultado de doença. Portanto, a caracterização dos componentes imunes tumor da TME ou tumor immunophenotyping, incluindo subtipos, numeração e localização de diferentes linhagens de células do sistema imunológico, é fundamental para compreensão imunidade anti-tumoral. No caso do PDAC, foi proposto que elevou o tumor infiltrando supressivos macrófagos (TAM) e células B conduziram a prevenção da infiltração de células T e/ou ativação e níveis elevados de fibrose5,6.
A abordagem comum para TMEs imunes a investigar experimentalmente estaria usando modelos animais pré-clínicos de substituto tumor, tumor de rato principalmente relevante os modelos7, particularmente do mouse syngeneic (homograft) ou modelos de rato geneticamente modificados (GEMM) de câncer, na similaridade assumida de rato e humanos para tumores e imunidade8,9. Entende-se na realidade que existem diferenças inerentes entre as duas espécies de10,11.
Transplantado rato tumores têm vantagens operacionais significativas sobre tumores espontânea7, ou seja desenvolvimento de tumor sincronizado, em contraste com o desenvolvimento de tumor espontânea GEMM parental. Stent de tumores murino espontâneas é considerados tumores primários nunca tendo sido manipularam in vitroe espelhamento original rato tumor histo – molecular patologia7, bem como possíveis perfis imunes. Estes murino stent é muitas vezes consideradas ser “uma versão do mouse do paciente-derivado xenografts (PDXs)”. Portanto eles provavelmente têm um melhor Traduzibilidade próprios que cela syngeneic convencional linha-derivado do mouse tumores12. Em particular, muitos stent é derivadas do GEMM específico onde mecanismos de doenças humanas específicas, por exemplo, as mutações de motorista oncogênica, são projetados, e estes stent, portanto, deve ter vantagens para sua relevância clínica. Em particular, a KPC GEMM desenvolver rato PDAC dentro de 15-20 semanas de idade, que recapitula morfologicamente a doença humana com predominantemente bem a moderadamente-diferenciadas de arquitetura glandular e altamente enriquecido o estroma. Este modelo também recapitula as características genéticas mais comuns de PDAC humana, nomeadamente Kras ativando mutação e perda-de-função P53, que ocorrem em 90% e 75% do PDAC humana, respectivamente de5,6.
Sites de transplante também sugeridos que desempenham um papel na Traduzibilidade próprios do modelo. Específicos do ambiente circundante de tecido, como um ambiente ortotópico correspondente, poderia ser um nicho para tumores específicos para ambientes de progresso, em oposição a uniforme subcutânea (SC) para tumores comumente transplantados. Seria de particular interesse se, e/ou, que diferença existe entre os dois locais de transplante, em termos de microambiente imunológico e a relevância para câncer humano, por exemplo. no caso do PDAC.
Um dos aspectos mais importantes da criação de perfil imune, ou immunophenotyping, é determinar o tumor infiltrando as células imunes de linhagens diferentes, os números, percentual relativo dentro tumores, bem como seus Estados de ativação e locais. Isso inclui o tumor-infiltratrating lymphoctyes (TILs, ambos T – e B-), tumor infiltrando macrófagos (TAMs), tumor infiltrando células assassinas naturais (NKs) e residente em tumor dendrítica células3,13,14 , 15 , 16 , 17e a Localização subcellular de certas células18,19,20, etc. Fluorescência citometria de fluxo ou classificação de celular ativado (FACS) é uma tecnologia de deteção de célula única que é comumente usada para medir os parâmetros específicos de uma célula. Multi cor medidas de citometria de fluxo vários marcadores em uma única célula3,4,21 e é o método mais comumente utilizado para determinar o número e a percentagem relativa de diferentes subconjuntos de células do sistema imunológico, incluindo aqueles dentro de tumores.
Este relatório descreve procedimentos para perfilação tumor infiltrando células do sistema imunológico: 1) implantação de ortotópico PDAC rato tumor stent, juntamente com a implantação de SC; 2) tumor tecido colheita e preparação única célula através de dissociação de tumor; 3) análise de citometria de fluxo de todas as células derivadas de tumores, como uma linha de base; 4) comparação dos perfis de linha de base de ambas as abordagens de transplante.
Protocol
Representative Results
Discussion
Embora estudos utilizando tumores de SC são mais facilmente conduzidos, modelos de tumores orthotopically implantado podem potencialmente ter mais relevantes para os estudos de farmacologia pré-clínica (particularmente as investigações I/O) fornecer Traduzibilidade próprios reforçado. Este relatório visa ajudar o leitores/público interessado para ser capaz de Visualizar diretamente os procedimentos técnicos que podem ser usados em suas respectivas pesquisas. Nossos protocolos de demonstram essa ortotópico impl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostaria de agradecer o Dr. Jody Barbeau – leitura crítica e edição do manuscrito e graças a Ralph Manuel para a concepção de obras de arte. Os autores também gostaria de agradecer a equipe de coroa Bioscience biomarcador de imuno-Oncologia Oncologia e a equipe de Oncologia In Vivo , por seus grandes esforços técnicos.
Materials
| Anesthesia machine | SAS3119 | ||
| Trocar 20 | 2mm | ||
| Petri dish | 20mm | ||
| 100x antibiotic and antimycotic | |||
| Iodophor swabs | Daily pharmacy purchase | ||
| Alcohol swabs | Daily pharmacy purchase | ||
| Liquid nitrogen | Air chemical | ||
| Biosafety hood | AIRTECH | BSC-1300IIA2 | |
| FACS machine LSRFortessa X-20 | BD | LSR Fortessa | |
| antibodies | BD | ||
| Trevigen MD or BD Matrigel Basement Membrane Matrix High concentration | BD | 354248 | |
| FACS buffers | BD | 554656 | Mincing buffer |
| Brilliant Staining Buffer | BD | 563794 | |
| Mouse BD Fc Block | BD | 553142 | |
| cell filters | BD-Falcon | 352350 | 70µm |
| routine blood tube | BD-Vacutainer | 365974 | 2mL |
| Kaluza | Beckman | vs 1.5 | |
| 6-well plates | Corning | 3516 | |
| Foxp3 Fix/Perm kit | ebioscience | 00-5523-00 | |
| UltraComp eBeads | ebioscience | 01-2222-42 | |
| Centrifuge | eppendorf | 5810R,5920R | |
| FlowJo software | FlowJo LLC | vs 10.0 | |
| PBS | Hyclone | SH30256.01 | 50mL |
| RPMI 1640 | Hyclone | SH30809.01 | |
| Disposable, sterile scalpels | Jin zhong | J12100 | 11# |
| knife handle | Jin zhong | J11010 | |
| eye scissors and tweezers | Jin zhong | Y00030 | Eye scissors 10cm |
| eye scissors and tweezers | Jin zhong | JD1060 | Eye tweezers 10cm with teeth |
| Portable liquid nitrogen tank | Jinfeng | YDS-175-216 | |
| Electronic balance | Metter Toledo | AL204 | 0-100g |
| Miltenyi C-tubes | Miltenyi | 130-096-334 | |
| Miltenyi Gentle MACS with heater blocks | Miltenyi | 120-018-306 | |
| Tumor Dissociation Kit | Miltenyi | 130-096-730 | |
| Cell counter | Nexcelom | Cellometer | Cellometer Auto T4 |
| cryopreservation tube | Nunc | 375418 | 1.8ml |
| Cultrex High Protein Concentration (HC20+) BME | PathClear | 3442-005-01 | |
| syringes | Shanghai MIWA medical industry | 1-5mL | |
| Studylog software | Studylog | software | |
| Studylog-Balance and supporting USB | OHAUS | SE601F | Balance and supporting USB |
| Studylog-Data line of vernier calipers | Sylvac | 926.6721 | Data line of vernier calipers |
| Caliper | Sylvac | 910.1502.10 | Sylvac S-Cal pro |
| Sterilized centrifuge tubes | Thermo | 339653 | 50mL |
| Sterilized centrifuge tubes | Thermo | 339651 | 15mL |
| Ice bucket | Thermo | KLCS-288 | 4°C |
| Ice bucket | Thermo | PLF-276 | —20°C |
| Ice bucket | Thermo | DW-862626 | —80°C |
| RNAlater | Thermo | am7021 |
References
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