Summary

Orthotopic Homogref (Syngeneic) fare birincil KPC pankreas duktal adenokarsinom, akış sitometresi tarafından Immunophenotyping

Published: October 09, 2018
doi:

Summary

Fare orthotopic PDAC homografts immunophenotyping deneysel ameliyat tümör IMMUNO-microenvironment profil oluşturma amaçlamaktadır. Tümör ameliyat ile implante orthotopically vardır. Tümör boyutu 200-600 mm3 hasat ve tek hücreli süspansiyonlar, çok bağışıklık marker FACS analizi farklı fluorescently etiketli antikorlar tarafından takip hazırlamak için ayrışmış.

Abstract

Homogref (syngeneic) tümör beygir bugünün IMMUNO-Onkoloji (g/ç) preklinik araştırma vardır. Tümör microenvironment (TME), özellikle bağışıklık-bileşenleri, teşhis ve tedavi sonuçları, özellikle de immünoterapi tahmini için hayati önem taşımaktadır. TME bağışıklık-bileşenleri farklı bağışıklık hücreleri değerlendirilebilir tümör infiltre kümelerine çok renkli FACS tarafından oluşur. Pankreas duktal adenokarsinom (PDAC) iyi tedavi seçenekleri, böylece bir acil ve karşılanmayan tıbbi ihtiyaç eksik en ölümcül malignances arasında olduğunu. Sigara-yanıt verdiğini çeşitli terapiler (kemoterapi hedef,-, I/O) için bir önemli nedeni onun bol TME, fibroblastlar ve bu tedaviler tümör hücreleri korumak lökosit oluşan olmuştur. İmplante PDAC için daha doğru bir şekilde inanılır Orthotopically TME insan pankreas kanserlerinin daha geleneksel cilt altı (SC) modelleri yeniden ele geçirmek.

Homogref tümörler (KPC) çoğu fare spontan PDAC genetiği KPC-fareler kaynaklanan nakli (KrasG12D / +/P53– / –/Pdx1-Cyeniden) (KPC-et). Birincil tümör doku küçük parçalara (~ 2 mm3) kesme ve subkutan nakledilen (SC) syngeneic alıcılara (C57BL/6, 7-9 haftalık). Homografts cerrahi olarak o zamanlar pankreas tümörü birimleri 300-1000 mm3 tarafından 16 gün ulaştı SC-implantasyon ile birlikte yeni C57BL/6 farelerin üzerine nakledilen orthotopically. Sadece tümör 400-600 mm3 onaylanmış otopsi yordamı hasat ve bitişik olmayan tümör doku kaldırmak için temizledim. Bir doku dissociator tek hücreli süspansiyonlar, çeşitli işaretleri farklı bağışıklık hücrelerinin fluorescently etiketli antikorların belirlenen panelleri ile boyama tarafından takip içine iletişim kuralı’nı başına ayrışmış (lenfoid, myeloid ve NK, DCs). Lekeli örnekleri farklı soy, hem de onların göreli yüzde tümörleri içinde bağışıklık hücrelerinin numaraları belirlemek için çok renkli FACS kullanarak analiz edildi. Orthotopic tümörlerin bağışıklık profilleri sonra o SC tümörler için karşılaştırıldı. İlk veri pankreas ve daha yüksek B-hücre infiltrasyonu SC tümör yerine orthotopic içine üzerinde önemli ölçüde yükseltilmiş infiltre TILs/TAMs tümörler olarak gösterdi.

Introduction

Pankreas duktal adenokarsinom (PDAC) yaklaşık yarım bir milyon Scotlan dünya çapında her yıl, ilk 5 kanser katillerden biri neden olur. Orada kaç etkili tedavi seçenekleri ve onaylanmış hiçbir immunotherapies; Bu nedenle, yeni tedaviler umutsuzca ihtiyaç vardır. Kanser giderek PDAC, bugün bilinen genetik hastalıklara ek olarak dahil immünolojik hastalıklar olarak tanınan ediliyor. İmmünolojik ve genetik faktörlerin yanı sıra tedavi hastalığı prognoz büyük olasılıkla belirlemek sonuçları. Tümörlerin konak immün gözetim evade ve sonunda ölüme neden ilerlemek. Bu bağışıklık süreçlerin pek çok farklı bağışıklık hücrelerinin tümör hücreleri ile birbirleriyle ve diğer tümör ile etkileşimde bulunduğu (TME)1,2,3,4 tümör microenvironment içinde meydana stromal bileşenleri, doğrudan veya dolaylı olarak sonuçta hastalık sonucu belirleyen sitokinler aracılığıyla. Bu nedenle, TME veya tümör immunophenotyping, subtyping, numaralama ve bağışıklık hücrelerinin farklı soy lokalizasyonu gibi tümör bağışıklık bileşenlerinin karakterizasyonu anti-tümör dokunulmazlık anlamak için önemlidir. PDAC söz konusu olduğunda, bu teklif edildi süpresif makrofajlar (TAM) tümör infiltre yüksek de B-hücreleri T-hücre infiltrasyonu ve/veya etkinleştirme önleme ve fibrozis5,6yüksek düzeyde yol açmıştır.

Bağışıklık br deneysel olarak araştırılması için ortak bir yaklaşım-cekti var olmak istimal vekil tümör preklinik hayvan modelleri, esas olarak ilgili fare tümör7, özellikle fare syngeneic (Homogref) ya da genetik fare modelleri (et) modelleri kanserleri, fare ve insan tümörler ve bağışıklık8,9için varsayılan benzerliği. Bu gerçekte iki tür10,11arasında içsel farklılıklar vardır anlaşılmaktadır.

Transplante fare tümörler spontan tümör7, yani eşitlenmiş tümör gelişimi, ebeveyn et spontan tümör geliştirme aksine önemli operasyonel üstünlükleri vardır. Homografts spontan fare tümörlerin birincil tümörleri asla edilerek manipüle vitrove yansıtma orijinal fare tümör histo – olarak kabul edilir / moleküler patoloji7yanı sıra olası bağışıklık profilleri. Bu fare homografts kez “hasta elde edilen xenografts (PDXs) bir fare sürüm” olarak kabul edilir. Bu nedenle büyük olasılıkla geleneksel syngeneic hücre satırı kaynaklı fare tümörler12‘ den daha iyi bir translatability var. Özellikle, birçok homografts nerede belirli insan hastalık mekanizmaları, Örneğin oncogenic sürücü mutasyonlar, mühendislik ve bu homografts bu nedenle onların klinik önemi avantajları olmalıdır belirli et türetilir. Özellikle, KPC et içinde 15-20 hafta-in yaş, hangi morfolojik insan hastalığı çoğunlukla iyi – için orta-Ayrıştırılan glandüler mimarisi ile recapitulates ve son derece stroma zenginleştirilmiş fare PDAC geliştirmek. Bu model Ayrıca insan PDAC, yani % 90 ve insan PDAC, sırasıyla5,%675’i de ortaya mutasyon ve P53 kaybı, işlev, aktive Kras en yaygın genetik özelliklerinin beyannamedir.

Nakli sitelerin de bir rol modeli translatability oynamak için önerilmiştir. Belirli doku çevreye, karşılık gelen bir orthotopic ortamı gibi bir niş sık transplante tümörler için Tekdüzen subkutan (SC) karşı ilerleme ortamlara belirli tümör olabilir. Bu özel ilgi olurdu eğer, ve/veya, e.gbağışıklık-microenvironment ve insan kanser, alaka düzeyi açısından iki nakli siteler arasında ne fark var. PDAC durumunda.

Bağışıklık profil oluşturma veya immunophenotyping, en önemli yönlerinden biri tümör infiltre bağışıklık hücreleri farklı soy, sayı, tümörler içinde göreli yüzde yanı sıra onların harekete geçirmek Birleşik ve yerleri tespit etmektir. Bu tümör-infiltratrating lymphoctyes içerir (TILs, hem T – ve B-), tümör infiltre makrofajlar (TAMs), tümör infiltre doğal katil hücreler (NKs) ve tümör yerleşik dendritik hücreleri3,13,14 , 15 , 16 , 17ve belirli hücreleri18,19,20, vbhücre altı lokalizasyonu. Floresans aktif hücre sıralama (FACS) veya akış sitometresi bir hücre belirli parametrelerini ölçmek için kullanılan bir tek hücre algılama teknolojisidir. Çok renkli bir tek hücre3,4,21 birden çok işaretçileri sitometresi önlemler akış ve numaraları ve bağışıklık hücrelerinin farklı alt kümelerini göreli yüzdesini belirlemek için en sık kullanılan yöntemdir, Bu tümörler içinde dahil.

Bu rapor bağışıklık hücreleri tümör infiltre profil oluşturma yordamları açıklar: 1) ile birlikte SC implantasyon; orthotopic PDAC fare tümör homografts implantasyonu 2) tümör doku hasat ve tek hücre hazırlık tümör ayrılma ile; 3) temel olarak tümör türetilmiş hücrelerin tümünü Akış Sitometresi Analizi; 4) temel profilleri her iki nakli yaklaşımın karşılaştırılması.

Protocol

Tüm iletişim kuralları ve tadilat (lar) veya yordamlar içeren bakım ve hayvanların kullanımı incelenmeli ve Crown Bioscience kurumsal hayvan bakım ve kullanmak Komitesi (IACUC) tarafından çalışmalar yürütülmesi önce onaylanmalıdır. Bakım ve hayvanların kullanımı genellikle AAALAC (değerlendirme ve akreditasyon laboratuvar hayvan bakım Derneği) uluslararası kurallara uygun olarak bakım ve kullanmak of Laboratory Animals, ulusal araştırma için Kılavuzu’nda rapor olarak yapılacaktır Konseyi…

Representative Results

Hızlı tümör büyümesi için SC implantasyon görülen benzer PDAC implantasyonu Orthotopic sonuçlandı. Donör tümör parçaları alıcı fareler implante edildi sonra hem subkutan ve orthotopically iletişim kurallarına göre açıklanan adımları 2,1 ve 2,2, implante KPC Homogref tümörler Şekil 1A’gösterildiği gibi benzer hızlı büyüme gösterdi . Farklı zaman noktalarda hasat KPC Homogref tümör Şekil 1B ad…

Discussion

SC tümörler kullanarak çalışmaları daha kolay yapılmaktadır rağmen implante orthotopically tümör modelleri potansiyel olarak gelişmiş translatability sağlamak için preklinik Farmakoloji çalışmalar (özellikle I/O araştırmalar) için daha alakalı olabilir. Bu rapor baktılar okuyucu/izleyici-doğrudan ilgili kendi araştırmalarında kullanılan teknik prosedürler görselleştirmek için yardımcı olmayı amaçlamaktadır. Bizim iletişim kuralları bu orthotopic göstermektedir PDAC implantasyonu v…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar Dr Jody Barbeau – kritik okuma yazması düzenleme için teşekkür ve Ralph Manuel sanat tasarlamak için teşekkür ederim. Yazarlar ayrıca taç Bioscience Onkoloji IMMUNO-Onkoloji biyomarker ekibi ve onkoloji In Vivo takımı, büyük teknik çabaları için teşekkür etmek istiyorum.

Materials

Anesthesia machine SAS3119
Trocar 20 2mm
Petri dish 20mm
100x antibiotic and antimycotic
Iodophor swabs Daily pharmacy purchase
Alcohol swabs Daily pharmacy purchase
Liquid nitrogen Air chemical
Biosafety hood AIRTECH BSC-1300IIA2
FACS machine LSRFortessa X-20 BD LSR Fortessa
antibodies BD
Trevigen MD or BD Matrigel Basement Membrane Matrix High concentration BD 354248
FACS buffers BD 554656 Mincing buffer
Brilliant Staining Buffer BD 563794
Mouse BD Fc Block BD 553142
cell filters BD-Falcon 352350 70µm
routine blood tube BD-Vacutainer 365974 2mL
Kaluza Beckman vs 1.5
6-well plates Corning 3516
Foxp3 Fix/Perm kit ebioscience 00-5523-00
UltraComp eBeads ebioscience 01-2222-42
Centrifuge eppendorf 5810R,5920R
FlowJo software FlowJo LLC vs 10.0
PBS Hyclone SH30256.01 50mL
RPMI 1640 Hyclone SH30809.01
Disposable, sterile scalpels Jin zhong J12100 11#
knife handle Jin zhong J11010
eye scissors and tweezers Jin zhong Y00030 Eye scissors 10cm
eye scissors and tweezers Jin zhong JD1060 Eye tweezers 10cm with teeth
Portable liquid nitrogen tank Jinfeng YDS-175-216
Electronic balance Metter Toledo AL204 0-100g
Miltenyi C-tubes Miltenyi 130-096-334
Miltenyi Gentle MACS with heater blocks Miltenyi 120-018-306
Tumor Dissociation Kit Miltenyi 130-096-730
Cell counter Nexcelom Cellometer Cellometer Auto T4
cryopreservation tube Nunc 375418 1.8ml
Cultrex High Protein Concentration (HC20+) BME PathClear 3442-005-01
syringes Shanghai MIWA medical industry 1-5mL
Studylog software Studylog software
Studylog-Balance and supporting USB OHAUS SE601F Balance and supporting USB
Studylog-Data line of vernier calipers Sylvac 926.6721 Data line of vernier calipers
Caliper Sylvac 910.1502.10 Sylvac S-Cal pro
Sterilized centrifuge tubes Thermo 339653 50mL
Sterilized centrifuge tubes Thermo 339651 15mL
Ice bucket Thermo KLCS-288 4°C
Ice bucket Thermo PLF-276 —20°C
Ice bucket Thermo DW-862626 —80°C
RNAlater Thermo am7021

References

  1. Chevrier, S., et al. An Immune Atlas of Clear Cell Renal Cell Carcinoma. Cell. 169 (4), 736-749 (2017).
  2. Wargo, J. A., Reddy, S. M., Reuben, A., Sharma, P. Monitoring immune responses in the tumor microenvironment. Curr. Opin. Immunol. 41, 23-31 (2016).
  3. Mosely, S. I., et al. Rational Selection of Syngeneic Preclinical Tumor Models for Immunotherapeutic Drug Discovery. Cancer Immunol. Res. 5 (1), 29-41 (2017).
  4. Rühle, P. F., Fietkau, R., Gaipl, U. S., Frey, B. Development of a Modular Assay for Detailed Immunophenotyping of Peripheral Human Whole Blood Samples by Multicolor Flow Cytometry. Int. J. Mol. Sci. 17 (8), e1316 (2016).
  5. Jiang, H., et al. Targeting focal adhesion kinase renders pancreatic cancers responsive to checkpoint immunotherapy. Nat. Med. 22 (8), 851-860 (2016).
  6. Gunderson, A. J., et al. Bruton Tyrosine Kinase-Dependent Immune Cell Cross-talk Drives Pancreas Cancer. Cancer Discov. 6 (3), 270-285 (2016).
  7. Li, Q. X., Feuer, G., Ouyang, X., An, X. Experimental animal modeling for immuno-oncology. Pharmacol. Ther. 17, 34-46 (2017).
  8. Takao, K., Miyakawa, T. Genomic responses in mouse models greatly mimic human inflammatory diseases. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 112 (4), 1167-1172 (2015).
  9. Payne, K. J., Crooks, G. M. Immune-cell lineage commitment: translation from mice to humans. Immunity. 26 (6), 674-677 (2007).
  10. Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. J. Immunol. 172 (5), 2731-2738 (2004).
  11. von Herrath, M. G., Nepom, G. T. Lost in translation: barriers to implementing clinical immunotherapeutics for autoimmunity. J. Exp. Med. 202 (9), 1159-1162 (2005).
  12. Talmadge, J. E., Singh, R. K., Fidler, I. J., Raz, A. Murine models to evaluate novel and conventional therapeutic strategies for cancer. Am. J. Pathol. 170 (3), 793-804 (2007).
  13. Erdag, G., et al. Immunotype and immunohistologic characteristics of tumor-infiltrating immune cells are associated with clinical outcome in metastatic melanoma. Cancer Res. 72 (5), 1070-1080 (2012).
  14. Gutiérrez-Garcia, G., et al. Gene-expression profiling and not immunophenotypic algorithms predicts prognosis in patients with diffuse large B-cell lymphoma treated with immunochemotherapy. Blood. 117 (18), 4836-4843 (2011).
  15. Paiva, B., et al. PD-L1/PD-1 presence in the tumor microenvironment and activity of PD-1 blockade in multiple myeloma. Leukemia. 29 (10), 2110-2113 (2015).
  16. Youn, J. I., Collazo, M., Shalova, I. N., Biswas, S. K., Gabrilovich, D. I. Characterization of the nature of granulocytic myeloid-derived suppressor cells in tumor-bearing mice. J. Leukoc. Biol. 91 (1), 167-181 (2012).
  17. Lavin, Y., et al. Innate Immune Landscape in Early Lung Adenocarcinoma by Paired Single-Cell Analyses. Cell. 169 (4), 750-765 (2017).
  18. Mahoney, K. M., et al. PD-L1 Antibodies to Its Cytoplasmic Domain Most Clearly Delineate Cell Membranes in Immunohistochemical Staining of Tumor Cells. Cancer Immunol. Res. 3 (12), 1308-1315 (2015).
  19. Yamaki, S., Yanagimoto, H., Tsuta, K., Ryota, H., Kon, M. PD-L1 expression in pancreatic ductal adenocarcinoma is a poor prognostic factor in patients with high CD8+ tumor-infiltrating lymphocytes: highly sensitive detection using phosphor-integrated dot staining. Int. J. Clin. Oncol. 22 (4), 726-733 (2017).
  20. Jiang, Y., et al. ImmunoScore Signature: A Prognostic and Predictive Tool in Gastric Cancer. Ann. Surg. , (2016).
  21. Ribas, A., et al. PD-1 Blockade Expands Intratumoral Memory T Cells. Cancer Immunol. Res. 4 (3), 194-203 (2016).

Play Video

Cite This Article
An, X., Ouyang, X., Zhang, H., Li, T., Huang, Y., Li, Z., Zhou, D., Li, Q. Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (140), e57460, doi:10.3791/57460 (2018).

View Video