ההליך ניסיוני-immunophenotyping של orthotopic מאתר PDAC homografts שמטרתה יצירת פרופיל חיסונית-microenvironment את הגידול. גידולים הם orthotopically מושתל באמצעות ניתוח. גידולים של 200-600 מ מ3 בגודל היו קוצרים, הפומבית להכין המתלים מתא בודד, שלאחריה יבוא ניתוח רב המערכת החיסונית סמן FACS באמצעות נוגדנים שונים עם התווית fluorescently.
גידולים מאותו מין (syngeneic) הם סוס עבודה של מחקר פרה חיסונית-אונקולוגיה (i/O) של היום. הגידול microenvironment (טיים), במיוחד את החיסון-מרכיביו, חיוני הפרוגנוזה ותחזית של תוצאות הטיפול, בעיקר אלה של חיסוני. טיים החיסון-רכיבים מורכבים שונים קבוצות משנה של גידולים הסתננות התאים החיסוניים למהירים על ידי צבע רב FACS. אדנוקרצינומה ductal הלבלב (PDAC) נמנית malignances הקטלני חסר אפשרויות טיפול טוב, ובכך קליניות ודחופים צורך רפואי. אחת הסיבות שלה ללא-ההיענות לטיפולים שונים (כימותרפיה-, ממוקד, קלט/פלט) חשוב כבר טיים שלו שופע, המורכב fibroblasts ו לויקוציטים להגן על תאים סרטניים של טיפולים אלה. Orthotopically מושתל PDAC הוא האמין יותר במדויק לשחזר את טיים ממקרי סרטן הלבלב האנושית מאשר קונבנציונאלי מודלים (SC) תת עורית.
גידולים מאותו מין (KPC) הם השתלות של העכבר ספונטנית PDAC שמקורם KPC-עכברים מהונדסים גנטית (KrasG12D / +/ /Pdx1-53– / –PCre) (KPC-GEMM). רקמת הגידול העיקרי הוא חתוך לחלקים קטנים (3~ 2 מ מ), מושתלים subcutaneously (SC) לנמענים syngeneic (C57BL/6, 7 – 9 שבועות). Homografts היו אז בניתוח orthotopically מושתלים לתוך הלבלב של עכברים C57BL/6 חדשים, יחד עם SC-השרשה, אשר הגיעו הגידול כרכים של 300-1000 מ מ3 ימים 17. רק גידולים של 400 – 600 מ מ3 היו שנקטפו לכל הליך הנתיחה שאושרו וניקה להסיר רקמות הגידול שאינם סמוכים. הם היו הפומבית לכל פרוטוקול באמצעות dissociator של הרקמה לתוך תא בודד המתלים, ואחריו מכתים עם לוחות המיועדים שכותרתו fluorescently נוגדנים עבור סמנים שונים של תאים חיסוניים שונים (הלימפה, מיאלואידית ו NK, בקרי קבוצת מחשבים). הדגימות מוכתם נותחו באמצעות צבע רב FACS כדי לקבוע מספרים של תאים חיסוניים של שושלות שונות, כמו גם את האחוזים היחסיים שלהם בתוך גידולים. הפרופילים המערכת החיסונית של גידולים orthotopic הושוו לאלה של גידולים SC. המידע הראשוני הפגינו גבוהות באופן משמעותי שחדר הפדגוגי/תאמי גידולים של הלבלב, ושל חדירה B-cell גבוה יותר orthotopic מאשר גידולים SC.
אדנוקרצינומה ductal הלבלב (PDAC) גורמת כמעט חצי מיליון בהירושימה ברחבי העולם מדי שנה, אחד הרוצחים סרטן ראש 5. ישנם כמה אפשרויות טיפול יעיל, אין immunotherapies שאושרו; לכן, טיפולים חדשים נדרשים נואשות. הם יותר ויותר להכרה סרטן מחלות חיסוניות, כולל PDAC, בנוסף מחלות גנטיות כפי הידוע כיום. גורמים גנטיים אימונולוגי היה סביר לקבוע פרוגנוזה מחלת, כמו גם טיפול תוצאות. גידולים להתחמק מעקב המערכת החיסונית המארח, בסופו של דבר לקדם לגרימת מוות. רבים של תהליכים חיסוניים אלה מתרחשות בתוך microenvironment הגידול (טיים)1,2,3,4 איפה סוגים שונים של תאים חיסוניים אינטראקציה עם תאים סרטניים, אחד עם השני ועם הגידול אחרים רכיבים סטרומה, ישירות או בעקיפין באמצעות ציטוקינים, אשר בסופו של דבר לקבוע התוצאה המחלה. לכן, אפיון מרכיבי מערכת החיסון של הגידול של טיים או גידול immunophenotyping, כולל subtyping, ספירה, לוקליזציה של שושלות שונות של תאים חיסוניים, חיוני להבנת אנטי הגידול חסינות. במקרה של PDAC, שהוא הוצע כי גבוהות גידולים הסתננות מדכאים מקרופאגים (TAM), תאי-B הובילו למניעת הסתננות T-cell ו/או הפעלה של רמות גבוהות של פיברוזיס5,6.
הגישה הנפוצה חוקרים TMEs המערכת החיסונית השפעול יהיה להשתמש במודלים בבעלי חיים פרה הגידול הפונדקאית, רלוונטי בעיקר העכבר הגידול מודלים7, במיוחד העכבר syngeneic (מאותו מין) או מודלים מהונדס גנטית עכבר (GEMM) סוגי סרטן, על הדמיון המשוערת של האדם עבור גידולים, חסינות8,9של עכבר. . זה מובן במציאות כי ישנם ההבדלים הטבועים בין שני המינים10,11
גידולים העכבר המושתלים יש יתרונות תפעוליים על פני גידולים ספונטניים7, כלומר גידול מסונכרן פיתוח, בניגוד התפתחות הגידול ספונטנית GEMM הורים. Homografts של גידולים מאתר ספונטנית נחשבים גידולים העיקרי שהיה מעולם לא מניפולציה במבחנה, שיקוף המקורי העכבר הגידול היסטו- / מולקולרי פתולוגיה7, כמו גם פרופיל החיסונית אפשרי. Homografts מאתר אלה נחשבים לעתים קרובות “גרסה העכבר של החולה, נגזר xenografts (PDXs)”. לכן סביר להניח להם translatability טוב יותר מאשר קונבנציונאלי תא syngeneic העכבר קו-derived גידולים12. בפרט, homografts רבות נגזרות GEMM ספציפי שבו מנגנוני מחלות אנושיות מסוימות, למשל הנהג oncogenic מוטציות, מתוכננים, homografts אלה כדאי לכן יש יתרונות הרלוונטיות הקלינית שלהם. בפרט, KPC GEMM לפתח העכבר PDAC תוך 15-20 שבועות של גיל, אשר מורפולוגית recapitulates מחלות אנושיות האדריכלות יוכפל לאחר המרתו טוב – עד בינוני-הבדיל הבלוטות והעשירו מאד משתית. מודל זה recapitulates גם את התכונות גנטי הנפוצים ביותר של PDAC אנושי, כלומר קראס. מפעיל את המוטציה ותפקוד P53 אובדן-של-, אשר מתרחשים 90% ו 75% של PDAC אנושי, בהתאמה5,6.
אתרים של השתלת גם שהוצעו כדי לשחק תפקיד דגם translatability. ספציפיים לרקמות הסביבה, כגון סביבת orthotopic המתאימים, יכול להיות נישה אקולוגית עבור גידולים ספציפיים לסביבות התקדמות, בניגוד אחיד תת עורית (SC) עבור גידולים מושתל בדרך כלל. זה יהיה עניין מיוחד אם, ו/או, מה ההבדל הקיים בין שני האתרים השתלת, במונחים של החיסון-microenvironment, ועולה סרטן אנושי, למשל. במקרה של PDAC.
אחד ההיבטים החשובים ביותר של פרופיל החיסונית או immunophenotyping, הוא לקבוע גידולים הסתננות התאים החיסוניים של שושלות שונות, המספרים, האחוז היחסי בתוך גידולים, כמו גם שלהם הפעלה מצבים ומיקומים. זה כולל את הגידול-infiltratrating lymphoctyes (הפדגוגי, T – וגם B-), גידולים הסתננות מקרופאגים (תאמי), גידולים הסתננות תאים הרוצח הטבעי (NKs), גידול תושב הדנדריטים תאים3,13,14 , 15 , 16 , 17, לוקליזציה subcellular של תאים18,19,20מסויימים, וכו ‘. קרינה פלואורסצנטית מופעל התא מיון (FACS) או זרימה cytometry היא טכנולוגיה זיהוי תא בודד המשמש בדרך כלל כדי למדוד את הפרמטרים הספציפיים של תא. צבע רב flow cytometry אמצעים מספר סמני ב4,3,תא בודד21 , היא השיטה הנפוצה ביותר כדי לקבוע את המספרים ואת האחוז היחסי של קבוצות משנה שונים של תאים חיסוניים, כולל אלה בתוך גידולים.
הדו ח מתאר הליכים עבור פרופיל גידולים הסתננות התאים החיסוניים: 1) השתלה של orthotopic PDAC העכבר גידול homografts, יחד עם ההשתלה SC; 2) גידול רקמות הקציר והכנות תא בודד באמצעות הגידול דיסוציאציה; 3) ניתוח cytometry זרימה של כל התאים נגזר גידולים כקו; 4) השוואה של פרופילים בסיסית של שתי הגישות השתלת.
למרות מחקרים באמצעות גידולים SC מתנהלים יותר בקלות, orthotopically מושתל גידולים מודלים עלולה להיות רלוונטיים יותר ללימודי פרמקולוגיה פרה (במיוחד חקירות קלט/פלט) כדי לספק translatability משופר. דו ח זה מטרתו לעזור לקוראים/הקהל מעוניין להיות מסוגל לבצע את ההליכים טכני יכול לשמש במחקר שלהם בהתאמה. הפרוטוק…
The authors have nothing to disclose.
המחברים מודים ד ר ג’ודי בארבו – קריאה ועריכה ביקורתית של כתב היד, ותודה ראלף מנואל לעיצוב יצירות אמנות. המחברים רוצה גם להודות את הכתר Bioscience אונקולוגיה חיסונית-אונקולוגיה סמן צוות וצוות אונקולוגיה Vivo ב , על מאמציהם טכני נהדר.
Anesthesia machine | SAS3119 | ||
Trocar 20 | 2mm | ||
Petri dish | 20mm | ||
100x antibiotic and antimycotic | |||
Iodophor swabs | Daily pharmacy purchase | ||
Alcohol swabs | Daily pharmacy purchase | ||
Liquid nitrogen | Air chemical | ||
Biosafety hood | AIRTECH | BSC-1300IIA2 | |
FACS machine LSRFortessa X-20 | BD | LSR Fortessa | |
antibodies | BD | ||
Trevigen MD or BD Matrigel Basement Membrane Matrix High concentration | BD | 354248 | |
FACS buffers | BD | 554656 | Mincing buffer |
Brilliant Staining Buffer | BD | 563794 | |
Mouse BD Fc Block | BD | 553142 | |
cell filters | BD-Falcon | 352350 | 70µm |
routine blood tube | BD-Vacutainer | 365974 | 2mL |
Kaluza | Beckman | vs 1.5 | |
6-well plates | Corning | 3516 | |
Foxp3 Fix/Perm kit | ebioscience | 00-5523-00 | |
UltraComp eBeads | ebioscience | 01-2222-42 | |
Centrifuge | eppendorf | 5810R,5920R | |
FlowJo software | FlowJo LLC | vs 10.0 | |
PBS | Hyclone | SH30256.01 | 50mL |
RPMI 1640 | Hyclone | SH30809.01 | |
Disposable, sterile scalpels | Jin zhong | J12100 | 11# |
knife handle | Jin zhong | J11010 | |
eye scissors and tweezers | Jin zhong | Y00030 | Eye scissors 10cm |
eye scissors and tweezers | Jin zhong | JD1060 | Eye tweezers 10cm with teeth |
Portable liquid nitrogen tank | Jinfeng | YDS-175-216 | |
Electronic balance | Metter Toledo | AL204 | 0-100g |
Miltenyi C-tubes | Miltenyi | 130-096-334 | |
Miltenyi Gentle MACS with heater blocks | Miltenyi | 120-018-306 | |
Tumor Dissociation Kit | Miltenyi | 130-096-730 | |
Cell counter | Nexcelom | Cellometer | Cellometer Auto T4 |
cryopreservation tube | Nunc | 375418 | 1.8ml |
Cultrex High Protein Concentration (HC20+) BME | PathClear | 3442-005-01 | |
syringes | Shanghai MIWA medical industry | 1-5mL | |
Studylog software | Studylog | software | |
Studylog-Balance and supporting USB | OHAUS | SE601F | Balance and supporting USB |
Studylog-Data line of vernier calipers | Sylvac | 926.6721 | Data line of vernier calipers |
Caliper | Sylvac | 910.1502.10 | Sylvac S-Cal pro |
Sterilized centrifuge tubes | Thermo | 339653 | 50mL |
Sterilized centrifuge tubes | Thermo | 339651 | 15mL |
Ice bucket | Thermo | KLCS-288 | 4°C |
Ice bucket | Thermo | PLF-276 | —20°C |
Ice bucket | Thermo | DW-862626 | —80°C |
RNAlater | Thermo | am7021 |