Summary

Immunophenotyping של Orthotopic מאותו מין (Syngeneic) של KPC העיקרי מאתר אדנוקרצינומה Ductal הלבלב על ידי Cytometry זרימה

Published: October 09, 2018
doi:

Summary

ההליך ניסיוני-immunophenotyping של orthotopic מאתר PDAC homografts שמטרתה יצירת פרופיל חיסונית-microenvironment את הגידול. גידולים הם orthotopically מושתל באמצעות ניתוח. גידולים של 200-600 מ מ3 בגודל היו קוצרים, הפומבית להכין המתלים מתא בודד, שלאחריה יבוא ניתוח רב המערכת החיסונית סמן FACS באמצעות נוגדנים שונים עם התווית fluorescently.

Abstract

גידולים מאותו מין (syngeneic) הם סוס עבודה של מחקר פרה חיסונית-אונקולוגיה (i/O) של היום. הגידול microenvironment (טיים), במיוחד את החיסון-מרכיביו, חיוני הפרוגנוזה ותחזית של תוצאות הטיפול, בעיקר אלה של חיסוני. טיים החיסון-רכיבים מורכבים שונים קבוצות משנה של גידולים הסתננות התאים החיסוניים למהירים על ידי צבע רב FACS. אדנוקרצינומה ductal הלבלב (PDAC) נמנית malignances הקטלני חסר אפשרויות טיפול טוב, ובכך קליניות ודחופים צורך רפואי. אחת הסיבות שלה ללא-ההיענות לטיפולים שונים (כימותרפיה-, ממוקד, קלט/פלט) חשוב כבר טיים שלו שופע, המורכב fibroblasts ו לויקוציטים להגן על תאים סרטניים של טיפולים אלה. Orthotopically מושתל PDAC הוא האמין יותר במדויק לשחזר את טיים ממקרי סרטן הלבלב האנושית מאשר קונבנציונאלי מודלים (SC) תת עורית.

גידולים מאותו מין (KPC) הם השתלות של העכבר ספונטנית PDAC שמקורם KPC-עכברים מהונדסים גנטית (KrasG12D / +/ /Pdx1-53– / –PCre) (KPC-GEMM). רקמת הגידול העיקרי הוא חתוך לחלקים קטנים (3~ 2 מ מ), מושתלים subcutaneously (SC) לנמענים syngeneic (C57BL/6, 7 – 9 שבועות). Homografts היו אז בניתוח orthotopically מושתלים לתוך הלבלב של עכברים C57BL/6 חדשים, יחד עם SC-השרשה, אשר הגיעו הגידול כרכים של 300-1000 מ מ3 ימים 17. רק גידולים של 400 – 600 מ מ3 היו שנקטפו לכל הליך הנתיחה שאושרו וניקה להסיר רקמות הגידול שאינם סמוכים. הם היו הפומבית לכל פרוטוקול באמצעות dissociator של הרקמה לתוך תא בודד המתלים, ואחריו מכתים עם לוחות המיועדים שכותרתו fluorescently נוגדנים עבור סמנים שונים של תאים חיסוניים שונים (הלימפה, מיאלואידית ו NK, בקרי קבוצת מחשבים). הדגימות מוכתם נותחו באמצעות צבע רב FACS כדי לקבוע מספרים של תאים חיסוניים של שושלות שונות, כמו גם את האחוזים היחסיים שלהם בתוך גידולים. הפרופילים המערכת החיסונית של גידולים orthotopic הושוו לאלה של גידולים SC. המידע הראשוני הפגינו גבוהות באופן משמעותי שחדר הפדגוגי/תאמי גידולים של הלבלב, ושל חדירה B-cell גבוה יותר orthotopic מאשר גידולים SC.

Introduction

אדנוקרצינומה ductal הלבלב (PDAC) גורמת כמעט חצי מיליון בהירושימה ברחבי העולם מדי שנה, אחד הרוצחים סרטן ראש 5. ישנם כמה אפשרויות טיפול יעיל, אין immunotherapies שאושרו; לכן, טיפולים חדשים נדרשים נואשות. הם יותר ויותר להכרה סרטן מחלות חיסוניות, כולל PDAC, בנוסף מחלות גנטיות כפי הידוע כיום. גורמים גנטיים אימונולוגי היה סביר לקבוע פרוגנוזה מחלת, כמו גם טיפול תוצאות. גידולים להתחמק מעקב המערכת החיסונית המארח, בסופו של דבר לקדם לגרימת מוות. רבים של תהליכים חיסוניים אלה מתרחשות בתוך microenvironment הגידול (טיים)1,2,3,4 איפה סוגים שונים של תאים חיסוניים אינטראקציה עם תאים סרטניים, אחד עם השני ועם הגידול אחרים רכיבים סטרומה, ישירות או בעקיפין באמצעות ציטוקינים, אשר בסופו של דבר לקבוע התוצאה המחלה. לכן, אפיון מרכיבי מערכת החיסון של הגידול של טיים או גידול immunophenotyping, כולל subtyping, ספירה, לוקליזציה של שושלות שונות של תאים חיסוניים, חיוני להבנת אנטי הגידול חסינות. במקרה של PDAC, שהוא הוצע כי גבוהות גידולים הסתננות מדכאים מקרופאגים (TAM), תאי-B הובילו למניעת הסתננות T-cell ו/או הפעלה של רמות גבוהות של פיברוזיס5,6.

הגישה הנפוצה חוקרים TMEs המערכת החיסונית השפעול יהיה להשתמש במודלים בבעלי חיים פרה הגידול הפונדקאית, רלוונטי בעיקר העכבר הגידול מודלים7, במיוחד העכבר syngeneic (מאותו מין) או מודלים מהונדס גנטית עכבר (GEMM) סוגי סרטן, על הדמיון המשוערת של האדם עבור גידולים, חסינות8,9של עכבר. . זה מובן במציאות כי ישנם ההבדלים הטבועים בין שני המינים10,11

גידולים העכבר המושתלים יש יתרונות תפעוליים על פני גידולים ספונטניים7, כלומר גידול מסונכרן פיתוח, בניגוד התפתחות הגידול ספונטנית GEMM הורים. Homografts של גידולים מאתר ספונטנית נחשבים גידולים העיקרי שהיה מעולם לא מניפולציה במבחנה, שיקוף המקורי העכבר הגידול היסטו- / מולקולרי פתולוגיה7, כמו גם פרופיל החיסונית אפשרי. Homografts מאתר אלה נחשבים לעתים קרובות “גרסה העכבר של החולה, נגזר xenografts (PDXs)”. לכן סביר להניח להם translatability טוב יותר מאשר קונבנציונאלי תא syngeneic העכבר קו-derived גידולים12. בפרט, homografts רבות נגזרות GEMM ספציפי שבו מנגנוני מחלות אנושיות מסוימות, למשל הנהג oncogenic מוטציות, מתוכננים, homografts אלה כדאי לכן יש יתרונות הרלוונטיות הקלינית שלהם. בפרט, KPC GEMM לפתח העכבר PDAC תוך 15-20 שבועות של גיל, אשר מורפולוגית recapitulates מחלות אנושיות האדריכלות יוכפל לאחר המרתו טוב – עד בינוני-הבדיל הבלוטות והעשירו מאד משתית. מודל זה recapitulates גם את התכונות גנטי הנפוצים ביותר של PDAC אנושי, כלומר קראס. מפעיל את המוטציה ותפקוד P53 אובדן-של-, אשר מתרחשים 90% ו 75% של PDAC אנושי, בהתאמה5,6.

אתרים של השתלת גם שהוצעו כדי לשחק תפקיד דגם translatability. ספציפיים לרקמות הסביבה, כגון סביבת orthotopic המתאימים, יכול להיות נישה אקולוגית עבור גידולים ספציפיים לסביבות התקדמות, בניגוד אחיד תת עורית (SC) עבור גידולים מושתל בדרך כלל. זה יהיה עניין מיוחד אם, ו/או, מה ההבדל הקיים בין שני האתרים השתלת, במונחים של החיסון-microenvironment, ועולה סרטן אנושי, למשל. במקרה של PDAC.

אחד ההיבטים החשובים ביותר של פרופיל החיסונית או immunophenotyping, הוא לקבוע גידולים הסתננות התאים החיסוניים של שושלות שונות, המספרים, האחוז היחסי בתוך גידולים, כמו גם שלהם הפעלה מצבים ומיקומים. זה כולל את הגידול-infiltratrating lymphoctyes (הפדגוגי, T – וגם B-), גידולים הסתננות מקרופאגים (תאמי), גידולים הסתננות תאים הרוצח הטבעי (NKs), גידול תושב הדנדריטים תאים3,13,14 , 15 , 16 , 17, לוקליזציה subcellular של תאים18,19,20מסויימים, וכו ‘. קרינה פלואורסצנטית מופעל התא מיון (FACS) או זרימה cytometry היא טכנולוגיה זיהוי תא בודד המשמש בדרך כלל כדי למדוד את הפרמטרים הספציפיים של תא. צבע רב flow cytometry אמצעים מספר סמני ב4,3,תא בודד21 , היא השיטה הנפוצה ביותר כדי לקבוע את המספרים ואת האחוז היחסי של קבוצות משנה שונים של תאים חיסוניים, כולל אלה בתוך גידולים.

הדו ח מתאר הליכים עבור פרופיל גידולים הסתננות התאים החיסוניים: 1) השתלה של orthotopic PDAC העכבר גידול homografts, יחד עם ההשתלה SC; 2) גידול רקמות הקציר והכנות תא בודד באמצעות הגידול דיסוציאציה; 3) ניתוח cytometry זרימה של כל התאים נגזר גידולים כקו; 4) השוואה של פרופילים בסיסית של שתי הגישות השתלת.

Protocol

כל הפרוטוקולים, amendment(s) או הליכים הכוללים את הטיפול ואת השימוש בבעלי חיים נבדקו ואושרו על-ידי הכתר Bioscience מוסדיים בעלי חיים והטיפול הוועדה להשתמש (IACUC) לפני התנהלות של מחקרים. הטיפול ואת השימוש בבעלי חיים בדרך כלל תיעשה בהתאם להנחיות בינלאומיות AAALAC (האגודה הערכה וטיפול הסמכה של מעבדה חיה) כפ?…

Representative Results

Orthotopic השרשה של PDAC הביא הגידול מהיר דומה כי ראיתי להשתלה SC. אחרי השברים הגידול התורם שהיו מושתלים לתוך עכברים הנמען, הן subcutaneously orthotopically לפי הפרוטוקולים שתואר בשלבים 2.1 ו- 2.2, גידולים מאותו מין KPC מושתל הפגינו דומה צמיחה מהירה כפי שמוצג איור 1A . גידולים מאותו מ…

Discussion

למרות מחקרים באמצעות גידולים SC מתנהלים יותר בקלות, orthotopically מושתל גידולים מודלים עלולה להיות רלוונטיים יותר ללימודי פרמקולוגיה פרה (במיוחד חקירות קלט/פלט) כדי לספק translatability משופר. דו ח זה מטרתו לעזור לקוראים/הקהל מעוניין להיות מסוגל לבצע את ההליכים טכני יכול לשמש במחקר שלהם בהתאמה. הפרוטוק…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים מודים ד ר ג’ודי בארבו – קריאה ועריכה ביקורתית של כתב היד, ותודה ראלף מנואל לעיצוב יצירות אמנות. המחברים רוצה גם להודות את הכתר Bioscience אונקולוגיה חיסונית-אונקולוגיה סמן צוות וצוות אונקולוגיה Vivo ב , על מאמציהם טכני נהדר.

Materials

Anesthesia machine SAS3119
Trocar 20 2mm
Petri dish 20mm
100x antibiotic and antimycotic
Iodophor swabs Daily pharmacy purchase
Alcohol swabs Daily pharmacy purchase
Liquid nitrogen Air chemical
Biosafety hood AIRTECH BSC-1300IIA2
FACS machine LSRFortessa X-20 BD LSR Fortessa
antibodies BD
Trevigen MD or BD Matrigel Basement Membrane Matrix High concentration BD 354248
FACS buffers BD 554656 Mincing buffer
Brilliant Staining Buffer BD 563794
Mouse BD Fc Block BD 553142
cell filters BD-Falcon 352350 70µm
routine blood tube BD-Vacutainer 365974 2mL
Kaluza Beckman vs 1.5
6-well plates Corning 3516
Foxp3 Fix/Perm kit ebioscience 00-5523-00
UltraComp eBeads ebioscience 01-2222-42
Centrifuge eppendorf 5810R,5920R
FlowJo software FlowJo LLC vs 10.0
PBS Hyclone SH30256.01 50mL
RPMI 1640 Hyclone SH30809.01
Disposable, sterile scalpels Jin zhong J12100 11#
knife handle Jin zhong J11010
eye scissors and tweezers Jin zhong Y00030 Eye scissors 10cm
eye scissors and tweezers Jin zhong JD1060 Eye tweezers 10cm with teeth
Portable liquid nitrogen tank Jinfeng YDS-175-216
Electronic balance Metter Toledo AL204 0-100g
Miltenyi C-tubes Miltenyi 130-096-334
Miltenyi Gentle MACS with heater blocks Miltenyi 120-018-306
Tumor Dissociation Kit Miltenyi 130-096-730
Cell counter Nexcelom Cellometer Cellometer Auto T4
cryopreservation tube Nunc 375418 1.8ml
Cultrex High Protein Concentration (HC20+) BME PathClear 3442-005-01
syringes Shanghai MIWA medical industry 1-5mL
Studylog software Studylog software
Studylog-Balance and supporting USB OHAUS SE601F Balance and supporting USB
Studylog-Data line of vernier calipers Sylvac 926.6721 Data line of vernier calipers
Caliper Sylvac 910.1502.10 Sylvac S-Cal pro
Sterilized centrifuge tubes Thermo 339653 50mL
Sterilized centrifuge tubes Thermo 339651 15mL
Ice bucket Thermo KLCS-288 4°C
Ice bucket Thermo PLF-276 —20°C
Ice bucket Thermo DW-862626 —80°C
RNAlater Thermo am7021

References

  1. Chevrier, S., et al. An Immune Atlas of Clear Cell Renal Cell Carcinoma. Cell. 169 (4), 736-749 (2017).
  2. Wargo, J. A., Reddy, S. M., Reuben, A., Sharma, P. Monitoring immune responses in the tumor microenvironment. Curr. Opin. Immunol. 41, 23-31 (2016).
  3. Mosely, S. I., et al. Rational Selection of Syngeneic Preclinical Tumor Models for Immunotherapeutic Drug Discovery. Cancer Immunol. Res. 5 (1), 29-41 (2017).
  4. Rühle, P. F., Fietkau, R., Gaipl, U. S., Frey, B. Development of a Modular Assay for Detailed Immunophenotyping of Peripheral Human Whole Blood Samples by Multicolor Flow Cytometry. Int. J. Mol. Sci. 17 (8), e1316 (2016).
  5. Jiang, H., et al. Targeting focal adhesion kinase renders pancreatic cancers responsive to checkpoint immunotherapy. Nat. Med. 22 (8), 851-860 (2016).
  6. Gunderson, A. J., et al. Bruton Tyrosine Kinase-Dependent Immune Cell Cross-talk Drives Pancreas Cancer. Cancer Discov. 6 (3), 270-285 (2016).
  7. Li, Q. X., Feuer, G., Ouyang, X., An, X. Experimental animal modeling for immuno-oncology. Pharmacol. Ther. 17, 34-46 (2017).
  8. Takao, K., Miyakawa, T. Genomic responses in mouse models greatly mimic human inflammatory diseases. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 112 (4), 1167-1172 (2015).
  9. Payne, K. J., Crooks, G. M. Immune-cell lineage commitment: translation from mice to humans. Immunity. 26 (6), 674-677 (2007).
  10. Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. J. Immunol. 172 (5), 2731-2738 (2004).
  11. von Herrath, M. G., Nepom, G. T. Lost in translation: barriers to implementing clinical immunotherapeutics for autoimmunity. J. Exp. Med. 202 (9), 1159-1162 (2005).
  12. Talmadge, J. E., Singh, R. K., Fidler, I. J., Raz, A. Murine models to evaluate novel and conventional therapeutic strategies for cancer. Am. J. Pathol. 170 (3), 793-804 (2007).
  13. Erdag, G., et al. Immunotype and immunohistologic characteristics of tumor-infiltrating immune cells are associated with clinical outcome in metastatic melanoma. Cancer Res. 72 (5), 1070-1080 (2012).
  14. Gutiérrez-Garcia, G., et al. Gene-expression profiling and not immunophenotypic algorithms predicts prognosis in patients with diffuse large B-cell lymphoma treated with immunochemotherapy. Blood. 117 (18), 4836-4843 (2011).
  15. Paiva, B., et al. PD-L1/PD-1 presence in the tumor microenvironment and activity of PD-1 blockade in multiple myeloma. Leukemia. 29 (10), 2110-2113 (2015).
  16. Youn, J. I., Collazo, M., Shalova, I. N., Biswas, S. K., Gabrilovich, D. I. Characterization of the nature of granulocytic myeloid-derived suppressor cells in tumor-bearing mice. J. Leukoc. Biol. 91 (1), 167-181 (2012).
  17. Lavin, Y., et al. Innate Immune Landscape in Early Lung Adenocarcinoma by Paired Single-Cell Analyses. Cell. 169 (4), 750-765 (2017).
  18. Mahoney, K. M., et al. PD-L1 Antibodies to Its Cytoplasmic Domain Most Clearly Delineate Cell Membranes in Immunohistochemical Staining of Tumor Cells. Cancer Immunol. Res. 3 (12), 1308-1315 (2015).
  19. Yamaki, S., Yanagimoto, H., Tsuta, K., Ryota, H., Kon, M. PD-L1 expression in pancreatic ductal adenocarcinoma is a poor prognostic factor in patients with high CD8+ tumor-infiltrating lymphocytes: highly sensitive detection using phosphor-integrated dot staining. Int. J. Clin. Oncol. 22 (4), 726-733 (2017).
  20. Jiang, Y., et al. ImmunoScore Signature: A Prognostic and Predictive Tool in Gastric Cancer. Ann. Surg. , (2016).
  21. Ribas, A., et al. PD-1 Blockade Expands Intratumoral Memory T Cells. Cancer Immunol. Res. 4 (3), 194-203 (2016).

Play Video

Cite This Article
An, X., Ouyang, X., Zhang, H., Li, T., Huang, Y., Li, Z., Zhou, D., Li, Q. Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (140), e57460, doi:10.3791/57460 (2018).

View Video