Immunophenotyping Orthotopic Homograft (Syngeneic) Murine 기본 KPC 췌 장 Ductal 선 암의 Cytometry로의
Summary
Murine orthotopic PDAC homografts immunophenotyping에 실험 절차는 종양 면역 microenvironment 프로 파일링 목표로 합니다. 종양은 수술을 통해 이식 하는 orthotopically. 종양 크기에 200-600 m m3 의 수확 되었고 단일 셀 정지, 여러 면역 표식 FACS 분석 다른 붙일 표시 된 항 체를 사용 하 여 다음을 준비 하는 해리.
Abstract
Homograft (syngeneic) 종양은 오늘날의 면역-종양학 (I/O) 전 임상 연구의 주력. 종양의 microenvironment (TME), 특히 면역-구성, 예 후 및 치료 결과, immunotherapy의 특히 그의 예측에 필수적입니다. TME 면역-구성 요소 다 색 FACS에 의해 평가할 수 있는 면역 세포를 종양 침투의 다른 하위 집합으로 구성 됩니다. 췌 장 ductal 선 암 (PDAC) 좋은 치료 옵션, 따라서는 긴급 하 고 미 충족 의료 필요를 부족 한 치명적인 malignances 중 하나입니다. 그것의 비-응답 다양 한 요법 (항 암 치료-, 타겟, I/O)에 대 한 중요 한 이유 중 하나는 섬유 아 세포 및 이러한 치료에서 종양 세포를 보호 하는 백혈구의 구성 된 그것의 풍부한 TME 되었습니다. Orthotopically 이식된 PDAC는으로 더 정확 하 게 기존의 피하 (SC) 모델 보다 인간의 췌장암의 TME 탈환.
Homograft 종양 (KPC)는 마우스 자발적인 PDAC 유전자 조작된 KPC-마우스에서 발생의 이식 (KrasG12D / +/P53-/-/Pdx1-다시C) (KPC-GEMM). 기본 종양 조직 (~ 2 m m3) 작은 조각으로 자르고 피하 이식 (SC) syngeneic 받는 사람 (C57BL/6, 7-9 주 이전)에 게. homografts 수술 후 했다 orthotopically에 SC-주입, 17 일에 의해 300-1000 m m3 의 종양 볼륨에 도달 함께 새로운 C57BL/6 마우스의 췌 장 이식. 400-600 m m3 의 종양만 승인된 부검 절차 당 수확 되었고 인접 한 비 종양 조직을 제거 하는 청소. 그들은 다른 면역 세포의 다양 한 표시에 대 한 항 체 붙일 레이블 지정 패널 얼룩 다음 단일 셀 정지로 조직 dissociator를 사용 하 여 프로토콜 당 해리 했다 (림프, 골수성 NK, Dc). 얼룩진된 샘플 종양 내에서 그들의 상대적인 비율 뿐 아니라 다른 계보의 면역 세포의 숫자를 결정 하기 위해 다 색 FACS를 사용 하 여 분석 되었다. Orthotopic 종양의 면역 프로필 다음 SC 종양의 그들에 비교 되었다. 예비 데이터 췌 장, 그리고 사우스 캐롤라이나 종양 보다는 오히려 orthotopic 높은 B-세포 침투 종양에서 상당히 높은 침투 TILs/Tam을 시연 했다.
Introduction
췌 장 ductal 선 암 (PDAC) 하면 거의 절반 백만 mortalities 세계-넓은 매년 상위 5 암 살인범 중 하나. 몇 가지 효과적인 치료 옵션 및 아무 승인된 immunotherapies; 따라서, 새로운 치료 필사적으로 필요 합니다. 암은 점점 오늘 알려진 유전 질환 뿐만 아니라 PDAC를 포함 하 여 면역 질병으로 인식 되 고 있습니다. 면역 및 유전적 요인 치료 뿐만 아니라 질병의 예 후 결정 가능성이 결과. 종양은 호스트 면역 감시를 회피 하 고 결국 죽음을 미리. 이러한 면역 프로세스의 많은 내 발생 종양 microenvironment (TME)1,2,,34 어디 다른 종류의 면역 세포 작용 종양 세포와, 서로 다른 종양 stromal 구성 요소, 직접 또는 간접적으로 궁극적으로 질병 결과 결정 하는 cytokines. 따라서, TME, 또는 종양 immunophenotyping, 동등, 세는 법 및 면역 세포의 다른 계보의 지역화를 포함 하 여 종양 면역 구성의 특성은 항 종양 면역을 이해 하는 데 중요 합니다. PDAC, 경우 그것은 제안 되었습니다 그 높은 종양 침투 진압 대 식 세포 (TAM) 및 B 세포 T 세포 침투 활성화의 예방 및 섬유 증5,6의 높은 수준으로 이끈.
면역 TMEs을 실험적으로 조사 하는 일반적인 방법은 대리 종양 전 임상 동물 모델을 사용 하는 것, 주로 관련 마우스 종양 모델7, 특히 마우스 syngeneic (homograft) 또는 유전자 조작된 마우스 모델 (GEMM) 암, 마우스와 인간 종양과 면역8,9의 가정된 유사성에. 두 종10,11사이의 고유의 차이 현실에서 이해 된다.
종양 이식된 마우스는 자발적인 종양7, 즉 동기화 된 종양 개발, 부모의 GEMM 자연 종양 개발 달리 상당한 운영 이점이 있다. 자발적인 murine 종양의 homografts 1 차 종양 적 데 조작 생체 외에서미러링 원래 마우스 종양 조직-간주 됩니다 / 분자 병 리7, 뿐만 아니라 가능한 면역 프로필. 이러한 murine homografts는 종종 “환자 파생 xenografts (PDXs)의 마우스 버전” 간주 됩니다. 그들은 따라서 가능성이 있다 기존의 syngeneic 셀 라인 파생 마우스 종양12보다 더 나은 translatability. 특히, 많은 homografts는 특정 인간 질병 메커니즘, 예를 들면 종양 드라이버 돌연변이, 설계는, 그리고이 homografts 그러므로 그들의 임상 관련성에 이점이 있어야 특정 GEMM에서 파생 됩니다. 특히, KPC GEMM 형태학 상으로 주로 잘에 알맞게-차별화 된 선의 건축과 인간의 질병이 고 높은 기질 있는 나이의 15-20 주 이내 마우스 PDAC 개발. 이 모델은 또한 인간의 PDAC, 즉 Kra 90%와 인간의 PDAC, 각각5,6의 75%에서 발생 하는 돌연변이 P53 손실-의-기능을 활성화의 가장 일반적인 유전자 기능을이.
이식의 사이트는 또한 모델 translatability에 역할을 제안 되었습니다. 해당 orthotopic 환경 등 특정 주변 조직 환경 일반적으로 이식된 종양에 대 한 균일 한 피하 (SC) 반대로 진행 환경에 특정 종양에 대 한 틈새 수 있습니다. 그것은 특정 관심의 것 경우, 어떤 차이가 존재 하는 면역-microenvironment, 및 인간의 암에 관련성 두 이식 사이트 간에 예그리고/또한. PDAC 경우.
면역 프로 파일링 또는 immunophenotyping의 가장 중요 한 측면 중 하나는 종양 침투 면역 세포의 다른 계보, 숫자, 종양, 내 상대 비율으로 그들의 활성화 상태 및 위치를 결정 하는. 이 포함 하는 종양-infiltratrating lymphoctyes (TILs, T-와 B-), 종양 침투 대 식 세포 (Tam), 자연 킬러 세포 종양 침투 (NKs) 및 종양 상주 수지상 세포3,,1314 , 15 , 16 , 17, 그리고 특정 셀18,,1920, 등등의 subcellular 지 방화. 형광 활성화 된 세포 분류 (FACS) 또는 흐름 cytometry는 일반적으로 셀의 특정 파라미터를 측정 하는 데 사용 되는 단일 셀 탐지 기술. 멀티 컬러 cytometry 조치 단일 셀3,,421 에 여러 마커 흐름과 숫자와 면역 세포의 다른 하위 집합의 상대적 비율을 결정 하기 위해 가장 일반적으로 사용된 방법입니다. 그 종양을 포함 하 여.
이 보고서는 면역 세포 종양 침투를 프로 파일링 하는 절차를 설명 합니다: 1) SC 주입; 함께 orthotopic PDAC 마우스 종양 homografts의 주입 2) 종양 조직 수확 및 종양 분리; 통해 단일 셀 준비 모든 기준;으로 종양에서 파생 된 셀의 3) 흐름 cytometry 분석 4) 두 이식 방법의 기본 프로 파일의 비교.
Protocol
Representative Results
Discussion
비록 연구 SC 종양을 사용 하 여 더 쉽게 실시 하 고, orthotopically 이식 종양 모델 수 있습니다 전 임상 약리학 연구 (특히 I/O 조사)에 대 한 관련성이 향상 된 translatability를 제공 하. 이 보고서는 관심이 독자/시청자 직접 그들의 각각 연구에 사용할 수 있는 기술 절차를 시각화 수 있도록 목표로 합니다. 우리의 프로토콜 입증 그 orthotopic PDAC 이식 효율적인 종양 성장, SC 주입 비슷한 발생할 수 있습니?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 박사 조디 Barbeau-중요 한 읽기 및 원고, 편집에 대 한 감사 드리고 그리고 삽화를 디자인 하기 위한 랄 프 마누엘을 감사 합니다. 저자는 또한 크라운 생명 종양 면역-종양학 바이오 마커 팀과 그들의 기술 노력에 대 한 종양 Vivo에서 팀을 감사 하 고 싶습니다.
Materials
| Anesthesia machine | SAS3119 | ||
| Trocar 20 | 2mm | ||
| Petri dish | 20mm | ||
| 100x antibiotic and antimycotic | |||
| Iodophor swabs | Daily pharmacy purchase | ||
| Alcohol swabs | Daily pharmacy purchase | ||
| Liquid nitrogen | Air chemical | ||
| Biosafety hood | AIRTECH | BSC-1300IIA2 | |
| FACS machine LSRFortessa X-20 | BD | LSR Fortessa | |
| antibodies | BD | ||
| Trevigen MD or BD Matrigel Basement Membrane Matrix High concentration | BD | 354248 | |
| FACS buffers | BD | 554656 | Mincing buffer |
| Brilliant Staining Buffer | BD | 563794 | |
| Mouse BD Fc Block | BD | 553142 | |
| cell filters | BD-Falcon | 352350 | 70µm |
| routine blood tube | BD-Vacutainer | 365974 | 2mL |
| Kaluza | Beckman | vs 1.5 | |
| 6-well plates | Corning | 3516 | |
| Foxp3 Fix/Perm kit | ebioscience | 00-5523-00 | |
| UltraComp eBeads | ebioscience | 01-2222-42 | |
| Centrifuge | eppendorf | 5810R,5920R | |
| FlowJo software | FlowJo LLC | vs 10.0 | |
| PBS | Hyclone | SH30256.01 | 50mL |
| RPMI 1640 | Hyclone | SH30809.01 | |
| Disposable, sterile scalpels | Jin zhong | J12100 | 11# |
| knife handle | Jin zhong | J11010 | |
| eye scissors and tweezers | Jin zhong | Y00030 | Eye scissors 10cm |
| eye scissors and tweezers | Jin zhong | JD1060 | Eye tweezers 10cm with teeth |
| Portable liquid nitrogen tank | Jinfeng | YDS-175-216 | |
| Electronic balance | Metter Toledo | AL204 | 0-100g |
| Miltenyi C-tubes | Miltenyi | 130-096-334 | |
| Miltenyi Gentle MACS with heater blocks | Miltenyi | 120-018-306 | |
| Tumor Dissociation Kit | Miltenyi | 130-096-730 | |
| Cell counter | Nexcelom | Cellometer | Cellometer Auto T4 |
| cryopreservation tube | Nunc | 375418 | 1.8ml |
| Cultrex High Protein Concentration (HC20+) BME | PathClear | 3442-005-01 | |
| syringes | Shanghai MIWA medical industry | 1-5mL | |
| Studylog software | Studylog | software | |
| Studylog-Balance and supporting USB | OHAUS | SE601F | Balance and supporting USB |
| Studylog-Data line of vernier calipers | Sylvac | 926.6721 | Data line of vernier calipers |
| Caliper | Sylvac | 910.1502.10 | Sylvac S-Cal pro |
| Sterilized centrifuge tubes | Thermo | 339653 | 50mL |
| Sterilized centrifuge tubes | Thermo | 339651 | 15mL |
| Ice bucket | Thermo | KLCS-288 | 4°C |
| Ice bucket | Thermo | PLF-276 | —20°C |
| Ice bucket | Thermo | DW-862626 | —80°C |
| RNAlater | Thermo | am7021 |
References
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